Yöntem makalesi

Fiziksel ve İzotropik Genişleme Yoluyla İnsan Doku Bölümlerinin Nanoskobik Görüntülemesi

DOI:

10.3791/60195

⸱

25 Eylül 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2QPathology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik doku örneklerinin nanoölçekli görüntülemesi hastalık patogenezinin anlaşılmasını iyileştirebilir. Genleşme patolojisi (ExPath), geleneksel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun araştırılması için standart klinik doku örnekleriile uyumluluk için modifiye edilen genleşme mikroskobunun (ExM) bir versiyonudur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modern patolojide optik mikroskopi, klinik örneklerin mikroskobik yapılarını ortaya çıkararak hastalık tanısında önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, temel fiziksel kırınım sınırı geleneksel optik görüntüleme yaklaşımları kullanırken nanoölçekli anatomi ve ince patolojik değişikliklerin sorgulanmasını önler. Burada, hem sabit dondurulmuş hem de formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku dahil olmak üzere klinik primer doku örneklerinin ortak tiplerinin nano ölçekli optik görüntülemesi için genişleme patolojisi (ExPath) adı verilen basit ve ucuz bir protokolü tanımlıyoruz. Bölüm. Bu yöntem, doku örneklerini kimyasal olarak doku-hidrojel melezine dönüştürerek ve fiziksel olarak saf suda birden fazla pulda izole ederek optik kırınım sınırını aşar. Genişleme nedeniyle, daha önce çözülemeyen moleküller ayrılır ve böylece geleneksel optik mikroskop kullanılarak gözlemlenebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokuların moleküler organizasyonunun üç boyutlu (3D) bir bağlamda araştırılması, biyolojik fonksiyonlar ve hastalık gelişimi hakkında yeni bir anlayış sağlayabilir. Ancak, bu nano ölçekli ortamlar, en az çözülebilir uzaklığın d α λ / NA ile tanımlandığı konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskopların (200−300 nm) çözünürlük yeteneklerinin ötesindedir. Burada λ ışığın dalga boyu ve NA görüntüleme sisteminin sayısal diyafram (NA) olduğunu. Son zamanlarda, floresan etiketli moleküllerin doğrudan görselleştirme mümkün yeni geliştirilen süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri1,2,3, uyarılmış emisyon tükenmesi de dahil olmak üzere (STED), foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM), stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM). Bu görüntüleme teknikleri nano ölçekte biyolojik fonksiyon anlayışında devrim yarattı, ancak pratikte, genellikle pahalı ve/veya özel ekipman ve görüntü işleme adımlarına güvenirler, geleneksel optik görüntüleme, belirli özelliklere sahip floroforlar gerektirir (fotoğraf anahtarlama yeteneği ve/veya yüksek fotostabilite gibi). Buna ek olarak, doku örnekleri üzerinde 3D süper çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmek için bir meydan okuma olmaya devam etmektedir.

İlk olarak 20154yılında tanıtılan genleşme mikroskobu (ExM), şişme polielektrolit hidrojeline gömülü korunmuş numuneleri fiziksel olarak genişleterek nano ölçekli özellikleri (<70 nm) görüntülemede alternatif bir araç sağlar. Burada, anahtar biyomoleküller ve/veya etiketler, kimyasal işleme den sonra izotonik olarak genişletilebilen bir polimer ağa yerinde sabitlenir. Fiziksel genişleme toplam etkin çözünürlüğü arttırdığından, ilgi molekülleri geleneksel kırınım sınırlı görüntüleme sistemleri kullanılarak çözülebilir. Özel sentezlenmiş floresan etiketlerin polimer ağına bağlı olduğu orijinal protokolün yayınlanmasından bu yana4, proteinleri (protein tutma ExM veya proExM) doğrudan bağlamak için yeni stratejiler kullanılmıştır5, 6,7,8,9 ve RNA9,10,11,12 hidrojel için, ve yineleme ile fiziksel büyütme artırmak genişleme13 veya adapte jelkimyası 8,14,15.

Burada proExM'in genleşme patolojisi (ExPath)16olarak adlandırılan ve klinik patoloji biçimleri için optimize edilmiş uyarlanmış bir versiyonunu salıyoruz. Protokol, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE), hemaoksilin ve eozin (H&E) lekeli ve cam slaytlara monte edilmiş taze dondurulmuş insan doku örnekleri dahil olmak üzere klinik örnekleri ExM ile uyumlu bir duruma dönüştürür. Proteinler daha sonra hidrojele sabitlenir ve mekanik homojenizasyon yapılır (Şekil 1)16. Numunelerin 4 kat lineer genişlemesi ile çok renkli süper çözünürlükte (~70 nm) görüntüler, sadece ~300 nm çözünürlüğe sahip geleneksel konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir ve diğer süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri ile de kombine edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stok Reaktifleri ve Çözümlerinin Hazırlanması

  1. Jelling çözeltisi bileşenlerini hazırlayın.
    NOT:     Çözelti konsantrasyonları g/mL (w/v yüzde) olarak verilmiştir.
    1. Aşağıdaki stok çözeltileri yapın: %38 (w/v) sodyum akrilat (SA), %50 (w/v) akrilamid (AA), %2 (w/v) N,N′-methylenebisacrylamide (Bis) ve %29.2 (w/v) sodyum klorür (NaCl). Bileşikleri iki kat deiyonize suda çözün (ddH2O). Tablo 1'deki tutarları referans olarak kullanın; hazırlanan çözümler gerektiğinde hacim olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Örneğin, %38 (w/v) SA çözeltisinin 10 mL'sini yapmak için, mezun olmuş 10 mL silindire 1,9 g SA ekleyin ve 5 mL'lik bir hacme DDH2O ekleyin.
    2. Tablo 1'degösterildiği gibi 1,06x konsantrasyonda 9,4 mL monomer çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Bu başlatıcı, hızlandırıcı ve inhibitör eklenmesinden sonra 1x konsantrasyonu neden olacaktır. Monomer stoku 4 °C'de 3 aya kadar veya uzun süreli depolama için -20 °C'de saklanabilir.
    3. Aşağıdaki stok çözümlerini ddH2O'da ayrı ayrı hazırlayın: Inhibitörün %0,5'ini (w/v) 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametipiperidin-1-oxyl (4HT), jelleşmeyi engelleyen jelleşmeyi engelleyerek jelleşmeyi engelleyerek dokulara % 10 (v/v) amonyum persülfat (APS) ile radikal oluşumu hızlandıran başlatıcı tetrametilenedediamin (TEMED) ve jelleşme sürecini başlatan %10 (w/v) APS.
      NOT: 4HT ve TEMED stok çözümleri 1 mL aliquots olarak hazırlanabilir ve en az 6 ay -20 °C'de saklanabilir. APS'nin uzun süreli depolamadan sonra etkinliğini kaybettiği ve jelling'den hemen önce küçük miktarlarda (<0.1 mL) olarak en iyi şekilde hazırlandığı tespit edilmiştir.
  2. 1 M Tris pH 8 (25 mL DDH2O) 25 mL 1 M Tris pH 8 (3.03 g Tris baz 3.03 g) birleştirerek sindirim tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] nonionic süraktif, 0.8 M NaCl) hazırlayın , 2.25 g niyonik yüzey aktif madde ve NaCl 23.38 g. Toplam 500 mL hacim için ddH2O ekleyin.
    NOT: Çözelti gerektiği gibi yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir ve 4 °C'de saklanabilir. Proteinaz K (ProK) sindirim adımıhemen önce eklenecektir.
  3. 20 mM sodyum sitrat çözeltisini 2,941 g sodyum sitrat tribasic dihidrat ile 500 mL ddH2O birleştirerek ve oda sıcaklığında (RT) pH'ı 8,0'a ayarlayarak hazırlayın. Gerektiğinde stok hacmini ölçeklendirin.
  4. 6-((akriloyl)amino)heksanoik asit, succinimidyl ester (akriloyl-X, SE; AcX), demirleme bileşeni. AcX'i 500 μL'lik susuz dimetil sülfoksitte (DMSO) 10 mg/mL'lik son konsantrasyonda çözün.
    NOT: Çözelti -20 °C'de 20°L aliquots'ta kurutulmuş bir ortamda saklanabilir.
  5. İmmünoboyama için ticari olarak kullanılabilen tamponlar kullanmıyorsanız, engelleme tamponu hazırlayın. %5 (v/v) normal hayvan serumu ve %0,1 (w/v) niyonik yüzey aktif maddeden 1x fosfat tamponlu salin (PBS) bir engelleme tamponu kullanın ve ikincil antikorların ana hayvanına göre serumu seçin. Örneğin, keçide yetiştirilen antikorlar için 500 mL bloke tamponu hazırlamak için 25 mL keçi serumu, 0,45 g niyonik yüzey aktif madde ve 1x PBS ile 500 mL'lik bir hacim birleştirin.

2. ExPath için Arşivlenmiş ve Taze Hazırlanmış Klinik Doku Slaytlarının Hazırlanması

  1. Dokuyu ExPath uyumlu bir biçime dönüştürün. Numunenin nasıl hazırlandığına bağlı olarak aşağıdaki dört adımdan birini (2.1.1−2.1.4) seçin: FFPE slaytlar, lekeli FFPE slaytlar veya optimum kesme sıcaklığı (OCT) çözeltisinde sabitlenmemiş veya sabit dondurulmuş doku slaytları.
    NOT:     Bunlar patoloji örnekleri için standart kurtarma adımlarını temel alınmaktadır ve ExPath protokolüne özgü değildir.
    1. FFPE klinik örnekleri
      1. %95 etanol, %70 etanol ve %50 etanol olmak üzere 30 mL hazırlayın. 30 mL ksilen, %100 etanol ve ddH2O ölçün.
      2. Slaydı 50 mL konik konik bir konik olarak yerleştirin ve 15 mL ksilen ekleyin. Tüpü kaplayın ve yaklaşık 60 rpm'de bir orbital shaker üzerine yatay olarak yerleştirin ve her çözelti için 3 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Kalan 15 mL xylene ile tekrarlayın.
      3. %100 etanol, %95 etanol, %70 etanol, %50 etanol ve xilen yerine ddH2O ile tekrar adım 2.1.1.2.
    2. Lekeli ve monte edilmiş kalıcı slaytlar
      1. 100 mm Petri kabına kaydırıve ksilen ile kaplayın. Bir jilet kullanarak kapak kayslipini dikkatlice çıkarın. Kapak kolayca kaldırılmazsa, kapak kayması gevşeyene kadar kaydırağı ksilene geri döndürün.
      2. FFPE örnekleri için adımları kullanarak işlem (adım 2.1.1.1−2.1.1.3).
        NOT: H&E lekeli slaytlarda genleşme işlemi sırasında lekeler ortadan kalkar.
    3. OCT çözeltisinde düzeltilmemiş dondurulmuş doku slaytları
      1. 10 dakika boyunca -20 °C'de asetondaki dokuyu düzeltin.
      2. Numuneleri 1x PBS çözeltisi ile her biri 10 dakika boyunca 3 kez RT'de yıkayın.
    4. Daha önce sabit, dondurulmuş klinik doku slaytlar
      1. OCT çözeltisini eritmek için slaytları RT'de 2 dakika kuluçkaya yatırın.
      2. Numuneyi RT'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1x PBS çözeltisi ile yıkayın.
  2. Biçim dönüştürmeden sonra tüm numunelerde antijen alımı için ısıl işlem yapın.
    1. Isıya dayanıklı bir kapta 20 mM sitrat çözeltisi (RT'de pH 8) ekleyin, örneğin slayt boyama kavanozu gibi.
      NOT: Slayta monte edilen dokuyu kapsayacak kadar çözüm olmalıdır (standart bir slayt boyama kavanozu için 50 mL).
    2. Sitrat çözeltisini mikrodalgafırında 100 °C'ye ısıtın ve kaydırağı çözeltiye yerleştirin. Kabı hemen bir kuluçka odasına aktarın ve 60 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slaytlar Petri yemeklerine yerleştirilebilir ve 1x PBS ile kaplanabilir ve 4 °C'de saklanabilir.
  3. Standart immünofloresan (IF)/immünohistokimya (IHC) boyama protokollerini kullanarak numuneyi lekeleyin.
    NOT:     Spesifik primer ve sekonder antikor konsantrasyonları ve boyama süreleri üretici tarafından önerilen konsantrasyonlara veya belirli deney için optimizasyona bağlıdır.
    1. Bir hidrofobik kalem doku kapsayacak şekilde gerekli çözelti hacmini en aza indirmek için slayt üzerinde doku bölümü (ler) etrafında bir sınır çizmek için kullanın. Slaytı, kaydırağa sığacak kadar büyük bir tabağa yerleştirin. Standart 3 inç lik bir slayt için 100 mm Petri kabı kullanın.
      NOT: Hidrofobik kalem, numunenin polimerizasyonuna veya sindirim sürecine engel olmaz.
    2. Nonspesifik bağlanmayı azaltmak için 37 °C'de 1 saat, RT'de 2 saat veya 4 °C'de 1 saat boyunca bloke edici tamponile dokuyu kuluçkaya yatırın.
    3. Hazırlanan blokaj tamponu (veya diğer tercih edilen boyama tamponu) uygun miktarda istenilen konsantrasyona birincil antikorları seyreltin. En az 3 saat RT veya 37 °C'de veya gece boyunca 4 °C'de birincil antikor solüsyonu olan dokuları kuluçkaya yatırın.
      NOT: Örnekler, dokunun kurumasını önlemek için nemlendirilmiş bir kapta (nemli silme ile Petri kabı gibi) yerleştirilmelidir. Tipik olarak, antikorlar kullanılan doku büyüklüğüne ve antikora bağlı olarak 200−500 μL tamponda 1:100−1:500'e seyreltilmiştir.
    4. RT'de 10 dakika boyunca 3 kez hazırlanmış bloke tamponu (veya diğer tercih edilen yıkama tamponu) ile dokuyu yıkayın.
    5. Seyreltik sekonder antikorlar (ve 300 nM 4′,6-diamidino-2-fenilindole [DAPI] istenirse), hazırlanan engelleme tampon (veya diğer tercih edilen boyama tampon) yaklaşık 10 g/mL konsantrasyon. Sekonder antikor çözeltisindeki dokuyu RT veya 37 °C'de en az 1 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Zamanlama, kullanılan antikorlar ve doku kalınlığına bağlı olarak ayarlanabilir. Siyanür boyaları içeren sekonder antikorlar (Cy3, Cy5, Alexa 647) ön polimerizasyon uygulandığında ExM protokolü ile uyumlu değildir. Önerilen boyalar Alexa 488 (yeşil), Alexa 546 (turuncu/ kırmızı) ve Atto 647N veya CF633 (uzak kırmızı) içerir. DAPI genişleme işlemi sırasında yıkandığından, genişlemeden sonra yeniden uygulanmalıdır.
    6. Rt'de her biri 10 dakika boyunca 3 kez hazırlanan engelleme tamponu (veya diğer tercih edilen yıkama tamponu) ile dokuyu yıkayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slaytlar Petri yemeklerine yerleştirilebilir ve 1x PBS ile kaplanabilir ve 4 °C'de saklanabilir.
    7. Geleneksel geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskobu veya tercih eki diğer görüntüleme sistemini kullanarak floresan görüntüleme yapın.
      NOT: Bu adım, genişleme öncesi ve sonrası görüntüleri karşılaştırarak genişleme faktörlerini kullanarak biyolojik uzunluğu belirlemek için gereklidir. Genişleme sonrası görüntülemeyi kolaylaştırmak için, kolayca tanımlanabilir ilgi alanları seçilmeli ve hem düşük hem de yüksek büyütmede görüntüler toplanmalıdır.

3. Numunelerin Yerinde Polimerizasyonunda

  1. Numuneyi demirleme çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
    1. Aldehit olmayan fiksatiflerle sabitlenmiş numuneler için 1x PBS'deki AcX stok çözeltisini 0,03 mg/mL konsantrasyona veya aldehit fiksatiflerle sabitlenmiş numuneler için 0,1 mg/mL'ye seyrelterek demirleme çözeltisini (genellikle 250 μL doku bölümünü kapsayacak kadar yeterlidir) hazırlayın , AcX ile reaksiyona daha az ücretsiz aminler var.
    2. 100 mm Petri kabına kaydırığı yerleştirin ve pipet bağlantı çözeltisini dokunun üzerine yerleştirin. RT'de en az 3 saat veya 4 °C'de bir gece kuluçka.
  2. Jelling çözeltisi içinde örnekleri kuluçkaya yatırın.
    1. Jelleç çözeltisinin en az 100 kat fazla hacmini hazırlayın. 200 μL başına, sırayla aşağıdakileri birleştirin: 188 μL monomer çözeltisi, 4 μL %0,5 4HT stok çözeltisi (1:50 seyreltme, nihai konsantrasyon: %0,01), 4 μL %10 TEMED stok çözeltisi (%1:50, nihai konsantrasyon 0.2%)ve 4 μL %10 APS stok çözeltisi (1:50 seyreltme, son konsantrasyon %0.2.
      NOT: Jelling çözeltisi kullanılmadan hemen önce yapılmalıdır. Çözelti 4 °C'de tutulmalı ve erken jellemesini önlemek için APS çözeltisi en son eklenmelidir.
    2. Doku bölümünden fazla çözeltiyi çıkarın ve kaydırağı 100 mm'lik petri kabına yerleştirin. Numuneye taze, soğuk jelleçözelti sürün ve karışımı dokuya 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırArak çözeltinin dokuya difüzyonuna izin verin.
  3. Jelleme çözeltisini bozmadan, numunenin etrafındaki slaytta bir oda(Şekil 2A) oluşturun.
    1. Bir elmas bıçak kullanarak kapak cam parçaları ince keserek jelleştirici odası için spacers olun.
      NOT: Görüntüleme sonrası genişlemeyi kolaylaştırmak için, spacers doku üzerinde boş jel miktarını azaltmak için doku örneğine kalınlığı yakın olmalıdır. Standart klinik numuneler için 1,5 cam (5−10 μm) kullanılabilir. Kapak cam parçaları kalın numuneler için istiflenebilir.
    2. Su damlacıkları (~10 μL) kullanarak dokunun her iki tarafındaki boşlukları sabitleyin.
    3. Dikkatlice slayt üzerine bir kapak cam kapak yerleştirin, doku üzerinde hava kabarcıkları bindirme önlemek için emin olun(Şekil 2B).
  4. Numuneyi 37 °C'de nemli bir ortamda (nemli mendil ile kapalı petri kabı gibi) 2 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slayt haznesi 4 °C'de kapalı bir Petri kabının içinde saklanabilir.

4. Örnek Sindirim

  1. Bir jiletkapağının altına yavaşça kaydırarak ve kapak kaymasını jel yüzeyinden yavaşça kaldırarak jelhazonun kapağını çıkarın. Hacmi en aza indirmek için doku etrafında boş jel kırpın. Örnek saydam olacağından, jelhomojenizasyondan sonra jelin yönünü izlemek için jeli asimetrik olarak kesin.
    1. Kullanmadan önce ProK'u sindirim tamponunda (son konsantrasyon 4 U/mL) 1:200 ile seyreltin. Jeli tamamen batırmak için yeterli çözelti hazırlayın; dört kuyulu plastik hücre kültür plakasının tek bir kuyusu, kuyu başına en az 3 mL gerektirir.
    2. Numuneyi 60 °C'de 3 saat boyunca sindirim tamponu içeren kapalı bir kapta kuluçkaya yatırın. Numune sindirim sırasında slayttan ayırmazsa, numuneyi nazikçe çıkarmak için jilet kullanın.
      NOT: Numune, numunenin kurumasını önlemek için sindirim tamponuna tamamen batırılmalı ve filmle kapatılmış kapalı bir kapta (küçük bir kaydırak kutusu, plastik kuyu, Petri kabı vb.) yerleştirilmelidir.

5. Örnek Genişletme ve Görüntüleme

  1. Numuneyi istenilen görüntüleme sistemiyle uyumlu ve tamamen genişletilmiş jeli barındıracak kadar büyük bir kapta 1x PBS'ye aktarmak için yumuşak bir boya fırçası kullanın. Doku, ters bir sistemde görüntüleme veya görüntüleme, görüntüleme nin görüntülenmesi durumunda örnek lebirlikte aşağı ya da görüntüleme nin dik bir sistemde görüntülenmesi durumunda, görüntüleme amacından numuneye olan uzaklığı en aza indirgemede olduğundan emin olun. Gerekirse yumuşak bir boya fırçası kullanarak jeli çevirin.
    NOT: Bir LED'den yan aydınlatma, onları sıvı içinde görünür hale getirmek için kullanılabilir. Standart 6 kuyulu bir plaka, önceden genişletilmiş çapı 0,6 cm'den az olan numuneleri barındırabilir. Ters bir sistemde görüntüleme için cam alt kuyu plakası kullanılmalıdır.
  2. Numuneleri 10 dakika boyunca RT'de 1x PBS'de yıkayın. İstenirse, sindirim işlemi DAPI lekesini yıkayınca numuneyi 300 nM DAPI ile yeniden lekeleyin. Rt'de 20 dakika boyunca 1x PBS'de seyreltilmiş 300 nM DAPI ile PBS ve lekeyi çıkarın ve ardından RT'de 1x PBS ile 10 dk yıkayın.
    NOT: Numuneler 1x PBS ile kaplanabilir ve bir sonraki adıma geçmeden önce 4 °C'de saklanabilir.
  3. Numuneleri genişletmek için PBS'yi değiştirin ve RT'de 10 dakika boyunca her biri için 3−5 kez ddH2O (en az 10 x son jel hacmi) hacmi fazlalığıile yıkayın.
    NOT: 3 veya4 yıkamadan sonra numunenin genişlemesi platoya başlanmalıdır. Depolama için, bakteri üremesini önlemek için, ddH2O ile takviye edilebilir 0.002%−0.01% sodyum azit (NaN3). Bu durumda, son genişleme faktörü geri döndürülen% 10 azalır.
  4. Geleneksel geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskobu veya tercih eki diğer görüntüleme sistemini kullanarak floresan görüntüleme yapın.
    NOT: Jellerin sürüklenmesini önlemek için, fazla sıvı kuyudan çıkarılabilir. Jeller de 1.5−2% düşük erime agarose ile hareketsiz olabilir. Çözelti hacminin 2−4 katı bir kapta suda 1,5−2%(w/v) az erimiş agarose hazırlayın. Çözeltiyi 40 °C'lik bir su banyosunda veya mikrodalgafırında 10−20 s ısıtın ve çözeltiyi eritin. Pipet jel kenarlarında erimiş agarose. Agarose'un RT veya 4 °C'de sertlemesine izin verdikten sonra, dehidratasyonu önlemek için numuneye su ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol başarıyla uygulanmışsa(Şekil 1),numuneler mekanik homojenizasyondan sonra düz ve saydam bir jel olarak görünür (Şekil 3A) ve suda 3−4.5x faktörüile genişleyebilir (Şekil 3B), kullanılan son genleşme faktörü ve görüntüleme sistemine bağlı olarak ~70 nm etkin bir çözünürlük sağlayarak5,16. Şekil 4, ExPath...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ffpe, H&E vitray ve cam slaytlar üzerinde taze dondurulmuş numuneler de dahil olmak üzere patolojide kullanılan klinik biyopsi örneklerinin en yaygın türlerine uygulanabilen proExM5'in bir varyantı olan ExPathprotokol16'yısıyoruz. Biçim dönüştürme, antijen alımı ve örneklerin immünboyamı ExPath'e özgü olmayan yaygın olarak kullanılan protokolleri izler. Orijinal proExM protokolü aksine9, ExPath sindirim tampon EDTA daha yüksek bir konsantrasy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

YZ ve OB, burada açıklanan teknolojilerin bir alt kümesi nde patent koruması almış ve başvuran mucitlerden ikisidir (ABD patentleri US20190064037A1, WO2018157074A1 ve WO201815704A1 ve WO2018157048A1).

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Carnegie Mellon Üniversitesi (YZ) ve NIH Direktörü'nün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2 OD025926-01'den YZ'ye) Fakülte Başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-hidroksi-TEMPO (4HT)Sigma Aldrich176141İnhibitörü
6 oyuklu cam tabanlı plaka (# 1.5 kapak camı)CellvisP06-1.5H-N
AsetonFischer ScientifcA18-500
AkrilamidSigma AldrichA8887
Akriloyl-X, SE (AcX)İnvitrojenA20770
AgarozFischer ScientifcBP160-100
Amonyum persülfat (APS)Sigma AldrichA3678
Tavşanda üretilen başlatıcı Anti-ACTN4 antikoruSigma AldrichHPA001873
Farede üretilen Anti-Kollajen IV antikoruSanta Cruz Biotechsc-59814
Tavukta üretilen anti-Vimentin antikoruAbcamab24525
Aqua Hold II hidrofobik kalemBilimsel Cihaz980402
Meme Yaygın Hastalığı Doku DizisiAbcamab178113
DAPI (1 mg / mL)Thermo Scientific62248Nükleer leke
Elmas bıçak No. 88 CMGenel Aletler31116
EtanolPharmco111000200
Etilendiamintetraasetik
asit (EDTA) 0,5 M		VWRBDH7830-1
FFPE Böbrek ÖrneğiUSBiomaxHuFPT072
Forseps
Keçi Anti-Tavuk IgY (H+L), Yüksek Çapraz Adsorbe CF488ABiotium20020
Keçi Anti-Tavuk IgY (H+L), Yüksek Çapraz Adsorbe CF633Biotium20121
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Alexa Fluor 546InvitrogenA11010
MAXbind Boyama OrtamıAktif Motif15253Tercih edilen ticari olmayan duruş tamponu ile ikame edilebilir.
MAXblock Engelleme OrtamıAktif Motif15252Tercih edilen ticari olmayan engelleme tamponu ile değiştirilebilir.
MAXwash Yıkama OrtamıAktif Motif15254Tercih edilen ticari olmayan yıkama tamponu ile değiştirilebilir.
Mikro kapak Cam # 1 (24 mm x 60 mm)VWR48393 106
Mikro kapak Cam # 1.5 (24 mm x 60 mm)VWR48393 251
N,N,N′,N′-
Tetrametiletilendiamin (TEMED)		Sigma AldrichT9281Hızlandırıcı
N,N′-MetilenbisakrilamidSigma AldrichM7279
Normal keçi serumuJackson Immunoresearch005-000-121Engelleme tamponu hazırlamak için. İkincil antikorların hayvan konakçısına bağlıdır.
Nunclon 4 Kuyulu x 5 mL Çok Parçalı Hücre Kültürü KabıThermo Fisher167063Çok kuyulu plastik kültür kabı
Nunclon 6 Kuyulu Hücre Kültürü KabıThermo Fisher140675
Nunc 15 mL  KonikTermo Fisher339651
Nunc 50 mL  KonikThermo Fisher339653
Orbital Çalkalayıcı
Boya fırçası
pH Metre
Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 10x ÇözeltiFischer ScientifcBP399-1
Plastik Petri Kabı (100 mm)Fischer ScientifcFB0875713
Proteinaz K ( Moleküler Biyoloji Sınıfı)Thermo ScientificEO0491
Tıraş bıçağıFischer Scientifc12640
Safelock Mikrosantrifüj Tüpleri 1.5 mLThermo Fisher3457
Safelock Mikrosantrifüj Tüpleri 2.0 mLThermo Fisher3459
Sodyum akrilatSigma Aldrich408220
Sodyum klorürSigma AldrichS6191
Sodyum sitrat tribazik dihidratSigma AldrichC8532-1KG
Tris BaseFischer ScientifcBP152-1
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Biotium29026ile etiketlenmiş buğday tohumu aglütinini
CF640R Xylenes Sigma Aldrich 214736

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).
  9. Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
  10. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  11. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165(2016).
  12. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  13. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  14. Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
  15. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  16. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ekspansiyon PatolojisiDoku EkspansiyonuNan l ekli G r nt lemeHidrojel nf zyonuProteinaz K SindirimiFloresan G r nt lemeSpinning Disc KonfokalFFPE Doku KesitleriAntijen Geri Kazan mJelle me Haznesi

İlgili makaleler