Klinik doku örneklerinin nanoölçekli görüntülemesi hastalık patogenezinin anlaşılmasını iyileştirebilir. Genleşme patolojisi (ExPath), geleneksel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun araştırılması için standart klinik doku örnekleriile uyumluluk için modifiye edilen genleşme mikroskobunun (ExM) bir versiyonudur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fiziksel ve İzotropik Genişleme Yoluyla İnsan Doku Bölümlerinin Nanoskobik Görüntülemesi
Bu makalede
Özet
Özet
Modern patolojide optik mikroskopi, klinik örneklerin mikroskobik yapılarını ortaya çıkararak hastalık tanısında önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, temel fiziksel kırınım sınırı geleneksel optik görüntüleme yaklaşımları kullanırken nanoölçekli anatomi ve ince patolojik değişikliklerin sorgulanmasını önler. Burada, hem sabit dondurulmuş hem de formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku dahil olmak üzere klinik primer doku örneklerinin ortak tiplerinin nano ölçekli optik görüntülemesi için genişleme patolojisi (ExPath) adı verilen basit ve ucuz bir protokolü tanımlıyoruz. Bölüm. Bu yöntem, doku örneklerini kimyasal olarak doku-hidrojel melezine dönüştürerek ve fiziksel olarak saf suda birden fazla pulda izole ederek optik kırınım sınırını aşar. Genişleme nedeniyle, daha önce çözülemeyen moleküller ayrılır ve böylece geleneksel optik mikroskop kullanılarak gözlemlenebilir.
Giriş
Dokuların moleküler organizasyonunun üç boyutlu (3D) bir bağlamda araştırılması, biyolojik fonksiyonlar ve hastalık gelişimi hakkında yeni bir anlayış sağlayabilir. Ancak, bu nano ölçekli ortamlar, en az çözülebilir uzaklığın d α λ / NA ile tanımlandığı konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskopların (200−300 nm) çözünürlük yeteneklerinin ötesindedir. Burada λ ışığın dalga boyu ve NA görüntüleme sisteminin sayısal diyafram (NA) olduğunu. Son zamanlarda, floresan etiketli moleküllerin doğrudan görselleşti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Stok Reaktifleri ve Çözümlerinin Hazırlanması
-
Jelling çözeltisi bileşenlerini hazırlayın.
NOT: Çözelti konsantrasyonları g/mL (w/v yüzde) olarak verilmiştir.- Aşağıdaki stok çözeltileri yapın: %38 (w/v) sodyum akrilat (SA), %50 (w/v) akrilamid (AA), %2 (w/v) N,N′-methylenebisacrylamide (Bis) ve %29.2 (w/v) sodyum klorür (NaCl). Bileşikleri iki kat deiyonize suda çözün (ddH2O). Tablo 1'deki tutarları referans olarak kullanın; hazırlanan çözümler gerektiğinde hacim olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Örneğin, %38 (w/v) SA çözeltisinin 10 mL'sini yapmak için, mezun olmuş 10 mL silindire 1,9 g ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokol başarıyla uygulanmışsa(Şekil 1),numuneler mekanik homojenizasyondan sonra düz ve saydam bir jel olarak görünür (Şekil 3A) ve suda 3−4.5x faktörüile genişleyebilir (Şekil 3B), kullanılan son genleşme faktörü ve görüntüleme sistemine bağlı olarak ~70 nm etkin bir çözünürlük sağlayarak5,16. Şekil 4, ExPath.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, ffpe, H&E vitray ve cam slaytlar üzerinde taze dondurulmuş numuneler de dahil olmak üzere patolojide kullanılan klinik biyopsi örneklerinin en yaygın türlerine uygulanabilen proExM5'in bir varyantı olan ExPathprotokol16'yısıyoruz. Biçim dönüştürme, antijen alımı ve örneklerin immünboyamı ExPath'e özgü olmayan yaygın olarak kullanılan protokolleri izler. Orijinal proExM protokolü aksine9, ExPath sindirim tampon EDTA daha yüksek bir konsantrasy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
YZ ve OB, burada açıklanan teknolojilerin bir alt kümesi nde patent koruması almış ve başvuran mucitlerden ikisidir (ABD patentleri US20190064037A1, WO2018157074A1 ve WO201815704A1 ve WO2018157048A1).
Teşekkürler
Bu çalışma Carnegie Mellon Üniversitesi (YZ) ve NIH Direktörü'nün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2 OD025926-01'den YZ'ye) Fakülte Başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4-hidroksi-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | İnhibitörü |
| 6 oyuklu cam tabanlı plaka (# 1.5 kapak camı) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Aseton | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Akrilamid | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Akriloyl-X, SE (AcX) | İnvitrojen | A20770 | |
| Agaroz | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Amonyum persülfat (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tavşanda üretilen başlatıcı Anti-ACTN4 antikoru | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Farede üretilen Anti-Kollajen IV antikoru | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Tavukta üretilen anti-Vimentin antikoru | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hidrofobik kalem | Bilimsel Cihaz | 980402 | |
| Meme Yaygın Hastalığı Doku Dizisi | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg / mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nükleer leke |
| Elmas bıçak No. 88 CM | Genel Aletler | 31116 | |
| Etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 0,5 M | VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Böbrek Örneği | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forseps | |||
| Keçi Anti-Tavuk IgY (H+L), Yüksek Çapraz Adsorbe CF488A | Biotium | 20020 | |
| Keçi Anti-Tavuk IgY (H+L), Yüksek Çapraz Adsorbe CF633 | Biotium | 20121 | |
| Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Boyama Ortamı | Aktif Motif | 15253 | Tercih edilen ticari olmayan duruş tamponu ile ikame edilebilir. |
| MAXblock Engelleme Ortamı | Aktif Motif | 15252 | Tercih edilen ticari olmayan engelleme tamponu ile değiştirilebilir. |
| MAXwash Yıkama Ortamı | Aktif Motif | 15254 | Tercih edilen ticari olmayan yıkama tamponu ile değiştirilebilir. |
| Mikro kapak Cam # 1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Mikro kapak Cam # 1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetrametiletilendiamin (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | Hızlandırıcı |
| N,N′-Metilenbisakrilamid | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal keçi serumu | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | Engelleme tamponu hazırlamak için. İkincil antikorların hayvan konakçısına bağlıdır. |
| Nunclon 4 Kuyulu x 5 mL Çok Parçalı Hücre Kültürü Kabı | Thermo Fisher | 167063 | Çok kuyulu plastik kültür kabı |
| Nunclon 6 Kuyulu Hücre Kültürü Kabı | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Konik | Termo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Konik | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Çalkalayıcı | |||
| Boya fırçası | |||
| pH Metre | |||
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 10x Çözelti | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastik Petri Kabı (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinaz K ( Moleküler Biyoloji Sınıfı) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Tıraş bıçağı | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Mikrosantrifüj Tüpleri 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Mikrosantrifüj Tüpleri 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodyum akrilat | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodyum klorür | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodyum sitrat tribazik dihidrat | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Biotium | 29026 | ile etiketlenmiş buğday tohumu aglütinini | |
Kaynaklar
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
