Endotel Tüp Oluşumu Namına Uygulanan Fibroblast Türetilmiş 3D Matris Sistemi

Özet

Bu yöntemin amacı sonraki hücresel tahliller için doğal bir iskele olarak fibroblast türetilmiş 3D matris elde etmektir. Fibroblastlar önceden işlenmiş bir kültür plakası içinde tohumlanır ve matris üretimi için askorbik asit ile uyarılır. Matrisler hücreden arındırılır ve kültürle ilgili hücrelere (örn. endotel hücreleri) bloke edilir.

Özet

Hücre dışı matriks (ECM), dokularda hücreler için ana destek görevi gören üç boyutlu bir iskeledir. ECM, yapısal işlevinin yanı sıra hücre göçü, çoğalma ve farklılaşmaya da katılır. Fibroblastlar ECM lif düzenleme ve üretim değiştiren hücrelerin ana türüdür. Kanserde, CAFs (kanser ilişkili fibroblastlar) kalıcı aktivasyon durumu, ECM remodeling katılan, tümör hücre göçü kolaylaştırmak, ve uyarıcı tümör ilişkili anjiyogenez, diğer pro-tümörijenik roller arasında. Bu yöntemin amacı, ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar veya insan birincil CAFs kullanarak, in vivo matrisbenzer bir lif bileşimi ile üç boyutlu bir matris oluşturmaktır. Fibroblastlar önceden tedavi edilen hücre kültürü tabakalarında kültürlenir ve askorbik asit stimülasyonu altında yetiştirilir. Daha sonra fibroblastlar çıkarılır ve daha fazla hücre tohumlama için matrisler bloke edilir. Bu ECM modelinde, fibroblastlar etki hücre kültüründe incelenebilir matris, farklı türde oluşturmak için aktive veya değiştirilebilir. 3D matrisler de hücre sinyalleri tarafından şekillenir, bozulma veya lif dağılımını değiştirebilecek çapraz bağlantı enzimleri gibi. Bu bağlamda, anjiyogenez, epitel tümör hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile birlikte incelenebilir.

Giriş

Hücre dışı matriks (ECM) tüm doku türlerinde bulunan dinamik bir yapıdır. Hücre yapışması, göç ve iletişim için çok önemli olan liflerin bir ağ oluşturmak proteinler ve polisakkaritler oluşur^1. ECM bileşimi dokuya bağlı olarak değişir. Tip-I kollajen en yaygın yapısal protein iken, kollajen türleri II, III, V ve XI de çeşitli dokularda bulunabilir². Fibroblastlar tarafından üretilen fibronektin hücre adezyonu için gereklidir². Ayrıca, elastin gibi diğer yapısal moleküller vardır, laminin ve yüzey reseptörleri integrinler denilen bu lif montaj aracılık ve farklı ECM dokulara özgü². ECM bir hücre iskelesi olarak önemli bir rol oynar ve aynı zamanda fizyolojik ve patolojik süreçler de dahil edilebilir^1. ECM'de anormallikler Kanser gibi patolojilerde gözlenir, bu da ECM kompozisyonunu ve/veya organizasyonunu değiştirir. Tümörlerde, ECM tümör mikroçevre (TME), fibroblastlar, bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri, perisitler ve çözünür faktörlerin çeşitli gibi hücre bileşenlerinin karmaşık bir ortam hücresel olmayan bileşeni temsil eder. TME'nin kanser progresyonu ve metastazı teşvik ettiği bilinmektedir; kanserilişkili fibroblastlar, tümör stroma baskın hücre tipi olarak, bu süreçte yer almak³. Normal fibroblastların aksine, CAF'ler kalıcı aktivasyon da, ECM proteinlerinin ve büyüme faktörlerinin (örneğin, Transforming Growth Factor-β, TGF-β) salgılanmasının yanı sıra α-düz kas aktin (α-SMA) ve fibroblast aktivasyon proteini (FAP)⁴gibi bazı belirteçlerin daha yüksek bir ekspresyonu gösterir. Ancak, CAFs aktivasyon veya marker ifade⁵farklı düzeylerde gösteren heterojen bir hücre popülasyonu vardır. Daha sonra fibroblast kaynaklı matrislerin bileşimi ve yapısının fibroblast durumuna ve özelliklerine bağlı olacağı varsayılabilir.

Bu bağlamda, bu metodolojinin amacı in vivo ECM ayarına eşdeğer fibroblastlar ile ECM üretimi için uygun bir in vitro model oluşturmaktır. Bu yaklaşımı, ECM aracılığında kemodirenç veya göç gibi tümör hücre fonksiyonlarının daha ileri çalışmaları için in vitro çeviri metodolojisi olarak öneriyoruz. Grubumuz başka bir yerde yayınlandığı gibi, CAFs taze doku örneklerinden elde edilebilir, ancak bu kültürDE CAFs 'hayatta kalma sınırlı olduğunu ve hücre geçiş sayısı^{azalır unutulmamalıdır 6}. Buna ek olarak, hasta örneklerinden oluşturulan CAF primek kültürleri matris üretimi için kullanılabilir. Fibroblastlarda gen ekspresyonunun manipülasyonu da matris bileşimi, lif oryantasyonu, vb üzerinde olası etkilerini değerlendirmek için çeşitli in vitro matrisler üretmek için ilginç bir yoldur. Bu doğrultuda, grubumuz son zamanlarda çeşitli türemiş matrisler 7 kompozisyon ve lif oryantasyonusal Salyangoz ifade^{fibroblastlar}rolünü bildirdi.

Ayrıca, CAFs ve ECM vasküler sistem, damar üretimi hem de vazo dış^{tabakasının}bir parçası olarak 8 yer almaktadır. ECM remodeling anjiyogenez indükler; matris metalloproteinazlar (MDP' ler) bu sürece katkıda bulunan en önemli enzim tipi gibi görünüyor^9,10. EcM'leri oluşturan primer hücrelerin doku vaskülarizasyonu, ECM makromolekülleri, ECM'de yer alan artık büyüme faktörleri, matris elastikiyeti ve matris kalınlığı endotel hücre aktivasyonunda rol oynayan faktörler olarak tanımlanır¹¹. Tümörlerde hipoksi ECM sertliğini ve endotel filizi oluşumunu arttırır^12. Ayrıca, CAFs salgılar vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) tümör stroma anjiyogenez uyarmak¹³. Bu alanda, in vitro matris üretimi farklı deneysel koşullar altında anjiyogenez süreçleri veya MMP eylem çalışma için kullanılabilir. Böylece, en analog in vivo matris in vitro üreme anjiyogenez veya mikro-çevresel hücre etkileşimleri ECM rolünü araştırmak için değerli bir araç olabilir.

Matris birikimini artırmak ve Bir ECM oluşturmak için askorbik asit ile kültürlü fibroblastların uyarılması in vivo matrisler benzer üreten kabul edilen bir yoludur. Ölümsüzleştirilmiş fibroblast hücre hatları kolayca kültürlenir ve PDGF-BB, Tümör Nekrozu Faktör-α (TNF-α) veya TGF-β¹⁴gibi çeşitli büyüme faktörleri ile aktive edilir. TME içinde, CAFs sentez tip-I kollajen ve fibronektin ECM ana bileşenleri olarak⁴. Benzer şekilde, bu bileşenler in vitro-oluşturulan fibroblast kaynaklı matrislerin ana bileşenleri olarak bulunur(Şekil 1).

In vivo ECM simüle etmek için farklı in vitro metodolojileri vardır. ECM liflerinin karışımı ile kaplamalı kültür yemeklerinin kullanımı geçmiş yıllarda genişletilmiş, ancak bu 2D yaklaşım çapraz bağlı jeller (örneğin, Matrigel)¹gibi 3D yapılar, iyileştirme gerekiyordu. Matrigel benzeri kurulum, 3B matrisi simüle etmek için standart bir yöntem haline gelmiştir. Fibrin de matris üreten bir alternatif ama ECM¹gücü ve dayanıklılığı açısından başarısız olur. Kollajen diğer ECM bileşenleri ile birlikte kullanılan yukarıda belirtilen konuların bazılarını değiştirir. Ancak, bu kollajen jeller yönlendirilebilir lifler ilerlikleri ile güçlü bir ağ oluşturmak, ancak son derece heterojen, deney tekrarları bir sorun olabilir¹. Bununla birlikte, deneylerin amacına bağlı olarak, Matrigel veya diğer hidrojellerin kullanımının daha uygun olduğu varsayılmalıdır (örneğin, jel kontraksiyonunun kolayca tespit edilebildiği matris daralma çalışmalarında).

Üretilen matrislerin potansiyel immünojenite bazı hücre tipleri ile deneylerde bir sorun olabilir. Bu nedenle, bizim yöntemi kullanırken ECM üreten hücreler nedeniyle bağışıklık yanıtları olasılığını azaltmak için, matrisler hücreden arındırılmış ve yıkanır, hücre parça kaldırma toplam olamazdı rağmen¹⁵. İdeal ECM hücre kültürü ile uyumlu olması ve iletişim kurmak ve hücre sinyallerine tepki gerekir. Prosedürümüz, ECM üretimi sırasında (örn. fibroblast uyarıcı büyüme faktörleri ekleyerek) değişikliklerin zorlanmadan başlatılmasını sağlar.

Protokol

Madrid'deki Ramón y Cajal Hastanesi Araştırma Etik Kurulu'nun onayı ile insan doku örnekleri alındı.

1. Çözümlerin Hazırlanması

1. %0.2 jelatin çözeltisi hazırlayın: 500 mL PBS'ye 1 g jelatin ekleyin. Çözeltiyi otomatik olarak tökezle ve 4 °C'de tutun. Kullanmadan önce 0,22 μm filtre ile filtre uygulayın.
2. %1 glutaraldehit hazırlayın: 24 mL PBS'ye %25 glutaraldehit stok çözeltisi 1 mL ekleyin. Kullanmadan önce 0,22 μm filtre ile filtre uygulayın.
3. 1 M etanolin hazırlayın: Kullanmadan önce steril H₂O. Filtre ile etanolamin çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Etanolamin bir güvenlik kapağı ile sağlandığı için iğne ve şırınga gerekecektir.
4. Askorbik asit hazırlayın: 0.1 mL 50 mg/mL stok çözeltisi askorbik asit (ışığa duyarlı) ila 100 mL orta ekleyin.
5. Lysis tamponhazırlayın: PBS hazırlamak 0.5% Triton 100X ile 20 nM NH₄OH. Kullanmadan hemen önce NH₄OH ekleyin.
6. PBS Kalem/Strep hazırlayın: 100 U/mL Kalem ve 100 μg/mL Strep'e pen/Strep stok çözeltisini seyreltin.
7. %10 FBS ile DMEM hazırlayın: 500 mL DMEM'e %10 FBS ekleyin. Takviyesi ile 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 0.1 mg/mL Normocin ve 0.25 g/mL amphotericin B.
8. %2 BSA ısı denatüre hazırlayın: 100 mL steril suya 2 g BSA ekleyin. 7 dakika kaynar suda ılık.
9. Antibiyotiklerle FBS hazırlayın: 200 U/mL penisilin, 200 μg/mL streptomisin, 100 μg/mL gentamisin ve 2.5 g/mL amphotericin B ile ek FBS.

2. Hücre Kültürü Hazırlama

1. Ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar hücre hattı
   1. Kültür rekombinant telomeraz transfeced ölümsüzleştirilmiş insan sünnet derisi fibroblastlar (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) DMEM ile 10% FBS ve korumak 37 ° C ve 5% CO₂.
2. Endotel hücreleri
   1. Kültür insan göbek ven endotel hücreleri (HUVECs, ATCC PCS-100-013) EBM-2 ortamda 2% FBS içeren ve 37 ° C ve% 5 CO₂korumak .
3. Fibroblast birincil kültür
   NOT: CAF kuruluşu ve kültürü için grubumuz tarafından daha önce yayınlanan protokol⁶izlenmiştir.
   1. Kısaca, yaklaşık 2-3 mm³ küçük parçalar halinde doku örnekleri kesilmiş ve antibiyotik yüksek konsantrasyonile FBS tohum.
   2. İlk fibroblastlar ortaya çıktığında, hücre bakımı için orta ortamı FBM ortamı ile değiştirin.
      NOT: Doku kökenine bağlı olarak hücre kültürleri kolayca kontamine olabilir. PBS'de antibiyotiklerle desteklenen, yüksek derecede kontamine olmuş doku (örneğin, kolon⁶⁾ile yıkama ve 30-45 dakika sallayın.

3. Fibroblast türetilmiş 3D Matrisler (Castelló-Cros ve Cukierman^16'danuyarlanmıştır)

1. 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 2 mL%0,2 jelatin çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
2. Jelatini aspire edin ve 2 mL PBS'de yıkayın.
3. 2 mL ekleyin 1% glutaraldehit ve inkübat 30 dk RT. Glutaraldehit çapraz bağlantı jelatin olacaktır.
4. Glutaraldehit aspire ve 5 dk. 2 mL PBS kuyuları yıkayın.
5. RT. Etanolamine de 30 dakika boyunca 1 M etanolin 2 mL ekleyin ve kuluçka kalan glutaraldehit engellemek için hareket edecektir.
6. Etanolamin aspire edin ve kuyuları 2 mL PBS'de 5 dk.
7. %10 FBS ile 1 mL DMEM ekleyin. Ortam hemen pembeye dönerse, ortayı çıkarın, 2 mL PBS'de yıkayın ve %10 FBS ile tekrar 1 mL DMEM ekleyin.
8. Her kuyuda 5 x 10⁵ hücreli 1 mL fibroblast süspansiyon tohumu. Her kuyunun toplam hacmi 2 mL olacaktır.
9. %100 biraraya ulaşana kadar kültür hücrelerine ulaşılır. Daha sonra ortamı çıkarın ve kullanılırsa 50 μg/mL askorbik asit ve ek tedavi ile %10 FBS ile DMEM ile değiştirin.
10. Orta ortamı 6 gün boyunca her 2 günde bir %10 FBS ve 50 g/mL askorbik asit ile değiştirin.
    NOT: Ek tedavi kullanılıyorsa (örneğin, PDGF-BB, TGF-β ve/veya diğer büyüme faktörleri), askorbik asit tedavisinin eklenmegünlerine ilave edilir.
11. Son askorbik asit tedavisinden iki gün sonra ortayı çıkarın ve 2 mL PBS'de yıkayın.
12. Her kuyuya 37 °C'de önceden ısıtılmış 1 mL lysis tamponu ekleyin. Fibroblastlar (mikroskop altında gözlemlenebilir) lysed kadar RT 5-10 dakika kuluçka.
13. Dikkatle ve lysis tampon kaldırmadan, 2 mL PBS ekleyin. Daha sonra yaklaşık 2,5 mL PBS aspire edin. Toplam üç yıkıntı için iki kez tekrarlayın.
14. Sonunda, 2,5 mL PBS çıkarın ve Pen/Strep ile 2 mL PBS ekleyin (sırasıyla 100 U/mL ve 100 μg/mL). Film ile mühürleyin ve 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
    NOT: Deneye bağlı olarak, üretilen matrislerin uzun süreli depolanması sonuçları etkileyebilir. Mümkün olan en kısa sürede matris kullanmanızı öneririz, ve daha da çok eğer deney hücre tohumlama içeriyorsa, olası protein bozulması nedeniyle. Eğer matrisler kollajen gözlemi gibi yapısal tahliller için kullanılırsa, matrisler daha uzun süre sabitlenebilir ve saklanabilir. Bu protokol 6 kuyulu bir kültür plakası için endikedir. Diğer plakalar kullanılabilir, ancak reaktif hacimleri ve hücre süspansiyon konsantrasyonu iyi alana göre yeniden hesaplanması gerekir.

4. Tüp Oluşumu Tsası

1. Maksimum bir araya kadar EBM-2 2% FBS HUVEC hücreleri büyümek.
2. Orta ortamı 8 saat boyunca FBS olmadan EBM-2 ile değiştirin.
3. Hücreleri tohumlamadan önce matrisleri hazırlayın.
   1. Matrice'leri buzdolabından çıkarın ve RT'de 1 saat bekletin.
   2. Isı denatüre 2% BSA 2 mL ekleyerek matrisblok. 37 °C'de kuluçka 1 saat.
   3. Aspirasyon BSA ve 2 mL PBS yıkayın.
4. Tohum 2 x 10⁵ FBS tükenmiş ortamda HUVEC hücreleri daha önce 3D fibroblast türetilmiş matrisler ile kaplanmış 6-iyi plaka her kuyuda.
5. 37 °C'de 16 saat boyunca inkübatendial hücreler.
6. 20-40x büyütmede standart parlak alan mikroskobu altında tüp benzeri yapı oluşumunu inceleyin.

Sonuçlar

PDGF-BB uyarılmış fibroblastlar daha kalın bir ECM oluşturur. Herrera ve ark. nasıl PDGF uyarılmış fibroblastlar daha kalın bir matris yanı sıra daha yüksek lif oryantasyonu⁷üretti gösterdi . BJ-hTERT fibroblastları PDGF ile veya PDGF'siz kuluçkaya yatırıldı ve gözlenen temsili alanlar PDGF uyarılmış fibroblast tarafından üretilen matrislerde daha uyumlu hücre dağılımı gösterdi(Şekil 1a). PDGF uyarılmış fibroblastlarda...

Tartışma

Matrisler ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar veya primer fibroblast kültürleri ile oluşturulabilir. Fibroblastlar yüksek büyüme hızı ve stres direnci ile in vitro kültürde korumak kolaydır. Hatta post-mortem doku izole edilebilir³, kontaminasyon bir kısıtlama olabilir rağmen, doku kökenine bağlı olarak.

3D-matris modeli burada başarıyla ECM kompozisyon ve lif oryantasyonu çalışma için yeni ve etkili bir sistem sunuyor. Fibroblast aktivasyon durumu, gen/protein ekspresyonu...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amonyum hidroksit (NH < alt > 4< / alt >OH)	Roth	A990.1
Amfoterisin-B	Corning	30-003-CF
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma	A7906-50G
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Corning	10-014-CVR
Endotelyal Bazal Orta (EBM)	Lonza	CC-3121	kullanmadan önce takviyeler ekleyin
Endotel hücreli Bazal Orta Takviyeler (EGM-2)	Lonza	CC-4176
Etanolamin	Sigma	411000-100ML
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Biowest	S181B-500	kullanmadan önce ısıyla inaktive edilmiş
Fibroblast Büyümesi Bazal Orta (FBM)	Lonza	CC-3131	kullanmadan
önce takviyeleri ekleyinFibroblast Büyüme Ortamı Takviyeleri ve Büyüme Faktörleri (FGM-2)	Lonza	CC-4126
Sığır derisinden elde edilen jelatin	Sigma	G9391-100G
Glutaraldehit	Sigma	g5882
L-Askorbik Asit	Sigma	A92902-100G	ışığa duyarlı
L-Glutamin	Lonza	BE17-605E
Normocin	Invivogen	3ANT-NR-2
Pencillin/Streptomisin (Kalem/Strep)	Gibco	15140122
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Corning	21-040-CVR
Triton X100	Roth	3051
Rekombinant telomeraz transfekte edilmiş ölümsüzleştirilmiş insan sünnet derisi fibroblastları (BJ-hTERT)	ATCC	ATCC CRL-4001
İnsan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler)	ATCC	PCS-100-013