Yöntem makalesi

Fare Böbreği ve Tavuk Koryoallantoik Membranda Kurulan Metastatik Berrak Hücreli Renal Hücreli Karsinom Modelinin Karşılaştırılması

DOI:

10.3791/60314

⸱

8 Şubat 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom kapsamlı bir klinik öncesi araştırma için kapsamlı bir hayvan modeli olmayan bir hastalıktır. Bu protokol hastalık için iki yeni hayvan modelini göstermektedir: ortonik olarak implante edilmiş fare modeli ve tavuk koryoallantoik membran modeli, her ikisi de klinik olgulara benzeyen akciğer metastazı göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom (ccRCC) böbrek kanserinin en sık görülen alt tipidir. Lokalize ccRCC olumlu bir cerrahi sonuç vardır. Ancak CCRCC hastalarının üçte birinde akciğerde metastaz gelişir ve bu da hastalar için çok kötü bir sonuçla ilişkilidir. Metastazın moleküler mekanizması bilinmediği için ne yazık ki, bu ölümcül evre için hiçbir tedavi mevcut değildir. Von Hippel-Lindau (VHL) tümör baskılayıcı genin fonksiyon kaybının ccRCC'nin pathognomonic olduğu 25 yıldır bilinmektedir. Ancak ccRCC'nin klinik olarak ilgili transgenik fare modeli oluşturulmamamıştır. Bu protokolün amacı, metastatik ccRCC için yeni kurulan iki hayvan modelini tanıtmak ve karşılaştırmaktır. Bunlardan ilki fare modeline böbrek implantasyonu. Laboratuvarımızda CRISPR gen düzenleme sistemi çeşitli RCC hücre hatlarında VHL genini devre dışı bıraktı. Heterojen ccRCC popülasyonlarının renal kapsüle ortotopik implantasyonu, immünyonlu farelerde sağlam akciğer metastazları geliştiren yeni ccRCC modellerini oluşturmıştır. İkinci model tavuk koryoallantoik membran (CAM) sistemidir. Fare modeliile karşılaştırıldığında, bu model daha fazla zaman, işçilik ve maliyet-etkin. Bu model aynı zamanda sağlam tümör oluşumunu ve intravazasyonunu da destekledi. CAM'de tümörün 10 günlük kısa büyümesi nedeniyle toplanan embriyo dokularında immünohistokimya (IHC) tarafından hiçbir metastaz gözlenmedi. Ancak yumurtadan çıkan tavukta tümör büyümesi iki hafta uzadığında akciğerlerde IHC tarafından mikrometastatik ccRCC lezyonları gözlendi. Bu iki yeni preklinik model metastazın arkasındaki moleküler mekanizmayı daha fazla incelemek ve metastatik ccRCC için yeni tedavilerin geliştirilmesine yönelik yeni, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDXs) oluşturmak için yararlı olacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Renal hücreli karsinom (RCC) Amerika Birleşik Devletleri'nde7 en sık görülen kanser. Her yıl, 74.000 Amerikalılar yeni teşhis olduğu tahmin edilmektedir, 14.000 'den fazla ölüm ler için muhasebe (Clear-cell histolojik alt tip, veya ccRCC, en yaygın alt tip, RCC olguların yaklaşık% 80'ini oluşturan. Lokalize maligniteli hastalar nefrektomi ile tedavi edilir ve 5 yıllıksağkalım oranı %73'tür 1. Ancak hastaların %25-30'u akciğerler gibi hayati organlara uzak metastazlar gelişir ve bu da ortalama 13 ay ve 5 yıllık sağkalım oranının sadece %11 ile sonuçlanmasınanedenolur. Metastatik ccRCC için ölümcül sonucu iyileştirmek için metastatik mekanizmanın daha iyi anlaşılması gerekir.

VHL tümör baskılayıcı genin in kaybı insan ccRCC olgularının çoğunda gözlenen bir ayırt edici genetik lezyondur4,5,6,7. Ancak ccRCC'de VHL kaybının kesin onkojenik mekanizması bilinmemektedir. Ayrıca, VHL ifade durumu ccRCC8sonucu tahmin değildir. Özellikle, renal-epitel hedefli VHL nakavt sayısız girişimlere rağmen, bilim adamları farelerde gözlenen preneoplastik kistik lezyonlar ötesinde böbrek anormalliği oluşturmak için başarısız oldu9, PTEN ve p5310gibi diğer tümör baskılayıcıların silinmesi ile kombine bile . Bu bulgular, VHL kaybının tek başına tümörigenez veya sonraki spontan metastaz için yetersiz olduğu fikrini desteklemez.

Son zamanlarda, laboratuvarımız yeni bir VHL knockout (VHL-KO) hücre hattı murine VHL + ccRCC hücre hattında VHL geninin CRISPR / Cas9 aracılı silme kullanarak oluşturulan11,12. Biz VHL-KO sadece mezenkimal olduğunu gösterdi, ama aynı zamanda mezenkimal geçiş epitel teşvik (EMT) VHL-WT hücrelerinin12. EMT metastatik süreçte önemli bir rol oynadığı bilinmektedir13. Çalışmalarımız ayrıca uzak akciğer metastazının sadece böbrekteki VHL-KO ve VHL-WT hücrelerinin birlikte implantasyonu ile oluştuğunu ve metastazın ortak mekanizmasını desteklediğini göstermiştir. Daha da önemlisi, ortotokik olarak implante edilen VHL-KO ve VHL-WT modelimiz, klinik ccRCC olgularını özetleyerek sağlam akciğer metastazlarına yol açabilmiştir. Bu spontan metastatik ccRCC modeli, özellikle yeni anti-metastaz ilaçlarının geliştirilmesinde transgenik metastatik fare modelinin eksikliğini telafi eder. Bu protokol, genetik mühendisliği renca hücrelerinin heterojen hücre popülasyonlarının renal kapsül implantasyonunu göstermektedir.

Tavuk CAM modelleri, Tablo 114,15,16,17,18'deözetlendiği gibi, çok sayıda avantajı nedeniyle anjiyogenez ve tümör biyolojisi araştırmalarında uzun bir geçmişe sahiptir. Kısaca, CAM tümör büyümesi için zaman penceresi kısa, CAM tavuk16kuluçka üzerine yok olana kadar 11 gün maksimum izin . Kısa büyüme süresine rağmen, tavuk embriyosu zengin beslenme kaynağı ve immünoeksik devlet çok verimli tümör engraftment 16 ,19,20,21sağlar. Son olarak, her döllenmiş yumurta maliyeti ~ $ 1, üzerinde 100 $ bir SCID fare için karşılaştırıldığında. Birlikte, CAM modeli fare ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet büyük bir tasarruf yeni PDXs kurulmasında değerli bir alternatif hayvan modeli olarak hizmet verebilir. Bu protokolde, modelin fare ortotopik modelinde gözlenen metastatik ccRCC'nin biyolojisini özetleyip özetleyemeyeceğini değerlendirdik.

(SCID) FareCAMNot
Maliyet>Her biri 100$~$1'er%50-75 arasında değişen canlılık
Bariyer muhafazaihtiyacıEvet№Daha fazla maliyet azaltır ve tümörlerin seri izleme kolaylaştırır
Tümör doğrudan görünür№EvetŞekil 3A
İlk engraftment zamanı (RENCA)2 hafta2-4 günhakem 14, 15
Büyümenin bitiş noktası (RENCA)3-6 hafta10 günhakem 14, 15
Metastaz (RENCA) gözlendiEvetEvet civcivŞekil 3D
Seri pasajlarEvetEvetref 16-18
Farelere Geçiş (RENCA)EvetEvetHu, J., ve diğerleri gözden geçiriliyor (2019)
Tümör heterojenliğini koruyunEvetEvetHu, J., ve diğerleri gözden geçiriliyor (2019)

Tablo 1: Fare ve CAM modellerinin avantajları ve sınırlamaları. Bu tablo, iki modeli, gerekli zaman, maliyet, işçilik ve biyoloji açısından avantajları ve sınırlamaları açısından karşılaştırmaktadır. CAM modeli verimlilik avantajları vardır, ama aynı zamanda kuşlar ve memeliler arasındaki farklı morfolojinedeniyle kendi benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, modelkenogreftlerin biyolojisini koruyabileceğini doğrulamak önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm yöntemler, UCLA Şansölyehayvan Araştırma Komitesi (ARC) (ARC 2002-049-53 ve ARC 2017-102-01A) olarak belirlenen Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 2002-049-53 protokolü, ccRCC tümör hücrelerinin Nude veya BALB/c farelerin böbrek kapsülüne yerleştirilmesi için optimize edilebiyi optimize edeildi. Yumurtadan çıkmadan önce döllenmiş tavuk yumurtalarında tümör implantasyonu deneyleri IACUC onayı gerektirmez. Akciğer metastazı kurulması için süre uzatmak için, CAM tümörlü embriyolar yumurtadan ve tavuk içine büyümeye izin verilir. 2017-102-01A protokolü bu hayvan deneylerini kapsamaktadır.

1. Farelerde ortotopik tümör çalışmaları

NOT: Bu denemenin zaman çizelgesi Şekil 1A'dagösterilmiştir. Bu yordamlar önceki yayınlardan uyarlanmıştır11,12.

  1. Aşılama için tek hücreli süspansiyon un hazırlanması
    1. RENCA VHL-WT ve VHL-KO hücrelerini tripsin/EDTA kullanarak kültür yemeklerinden ayırın.
    2. Hücreleri hemositometre ile sayın ve önceden soğutulmuş 1:1 PBS ve hücre dışı matriks çözeltisi karışımında 1 x 105 hücre/μL konsantrasyonda yeniden askıya alın.
      NOT: Heterojen implantlar için 1:4 vhl-WT:VHL-KO hücreleri ve homojen implantlar için tek başına VHL-WT kullanın.
    3. Yeniden askıya alınan hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın ve implantasyona kadar buzda tutun.
  2. Böbrek kapsülüne implantasyon
    1. Anestezi: Sıcak bir pedi 37 °C'ye ısıtın ve üzerini kalın steril bir perde ile kapatın. Fareyi indüksiyon odası veya intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile 10 mL/kg dozajında %1 pentobarbital sodyum ile anestezi edin.
    2. Cerrahi alandaki saçı tıraş edin. Bu adım çıplak fareler için atlanabilir.
    3. Dezenfeksiyon ve cerrahi draping: Povidone-iyot 3x ile tamamen farenin arka dezenfekte 70% etanol 1x takip ve steril pamuk bezleri ile kuru silin. Daha sonra bir cerrahi alan oluşturmak ve fareim immobilize etmek için tüm geri kapsayan, sırayla üç steril tıbbi pansuman uygulayın.
    4. Kesi ve böbrek dışlaşması: Operasyondan önce operatörün parmaklarını povison-iyot ile dezenfekte edin veya steril eldiven kullanın. Fareyi yatkın konuma getirin ve sol kanadın altında sol böbreği bulmak için parmakları kullanın. Belirtilen yerin altındaki cildi ve kas tabakasını kesmek için bir çift künt çözgü ve makas kullanın. Kısmen karın dışında sol böbrek dışlaştırmak için steril pamuk lu bezler ve forceps kullanın.
    5. Tümör hücre implantasyonu: Adım 1.1'de hazırlanan hücre süspansiyonunu insülin şırıngalarına veya özelleştirilmiş Hamilton şırıngalarına yükleyin (spesifikasyonlar için Malzeme Tablosu'na bakın). Böbrek kapsülünün altına 20 μL'lik resuspended hücreleri enjekte edin.
      NOT: Başarılı enjeksiyon böbrek yüzeyinde yarı saydam bir şişkinlik oluşumu ile belirlenir. Böbrek parankimine kazara enjeksiyon, enjeksiyon yerinde ölümcül kanamaya bağlı olarak kanama ve ameliyat sonrası mortalite oranının %90'a varan oranda düşmesi ile sonuçlanır.
    6. Hücre dışı matriks çözeltisinin kanama yı veya tümör hücre sızıntısını sağlamlaştırması ve önlemesi için iğneyi yavaşça çekin. Sonra, steril bir pamuklu bez kullanarak, geri karın içine böbrek itin.
    7. Yara dikiş: Kas tabakası dikiş için 5-0 kaplı VICTRYL sütür kullanın. Bir kez povidone-iyot ile cildi dezenfekte ve yara autoclips ile cildi kapatın.
    8. Kurtarma: Fareyi uyanana kadar sıcak pedin üzerine yerleştirin. Fare teneffüs ile anestezi edildiyse, isoflurane'yi geri çekin ve uyanana kadar fareyi sıcak pedüzerinde tutun.
  3. Biyolüminesans görüntüleme (BLI) ve doku toplama
    1. Tümör implantasyonundan altı hafta sonra, ateş böceği-luciferase tabanlı BLI görüntüleri alın. Sonra izofluran inhalasyonu ile fare ötenazi ve servikal çıkış takip.
    2. Akan sitometri ile dolaşımdaki tümör hücresi (CTC) tespiti için kan toplayın.
    3. Hasat tümör ve ilgi organları (böbrekler, akciğerler, karaciğer, bağırsak, ve dalak) steril doku hasat tekniği kullanılarak22. Parafin-balmumu gömme için bir gecede% 4 paraformaldehit onları düzeltin.

2. CAM tümör ksenogreft modeli

NOT: Bu yordamlar uyarlanmış ve daha önce yayımlanmış protokolleri23,24değiştirilmiştir. Bu yordamın zaman çizelgesi Şekil 1B'degösterilmiştir. Bu makalede yalnızca kolaylaştırılandırılan protokolü sunar. Ayrıntılı protokoller için, lütfen25.

  1. Preincubaation: 7 gün boyunca 37 °C ve%55-65 nem de dönen bir yumurta kuluçka içinde taze döşenmiş, döllenmiş tavuk yumurtası kuluçka.
  2. CAM ve açık pencere (gelişim gün 7) bırakın:
    1. Hava kesesini ve damarları bulun ve işaretleyin.
      NOT: Genellikle yumurtaların %10-15'i döllenmeden sonra 7 gün içinde döllenmedikleri veya öldükleri için çıkarılır.
    2. İşaretli bir damarın üzerine yeni bir hava kesesi oluşturun.
    3. Yeni hava kesesini ölçün, paketleme bandı uygulayın ve yumurtaları kuvöze geri koyun.
      NOT: Yordam burada duraklatılmış olabilir. Hava kesesinin hareket edebileceğinden, aynı gün içinde işlemlere devam etmesi önerilir.
    4. Bir pencere açın: Kavisli mikrodissecting makası ve iğne burun lu bir çift forceps kullanarak, kabuk içinde 1,5 x 1,5 cm dairesel bir pencere kesti.
      NOT: CAM bozulması kan ve kesilmiş kabuk parçası üzerinde CAM mevcut bir parça ile gösterilir.
    5. Deliği şeffaf tıbbi pansumanla kapatın ve yumurtaları 37 °C ve %55-65 nemde sabit bir kuluçka makinesine yerleştirin.
      NOT: Adım 2.1'deki gibi aynı yumurta kuluçka makinesini kullanın. Sabit olması için rotator'u kapatın.
  3. Sağlık kontrolü (gelişimsel gün 9): Ölü yumurtaları çıkarın ve sonra tümör hücresi implantasyonu için yumurtaların geri kalanını rastgele gruplayın.
    NOT: İdeal olarak, bu noktada sağkalım oranı gelişim sel gün 0 yaklaşık% 80'dir.
  4. Tümör hücrelerinin yeni maruz kalan CAM'e aşılanması (gelişimsel gün 10)
    1. Ekstrasellüler matriks çözeltisini önceden soğutulmuş RPMI 1640 hacminin iki katı (L-glutamin ile) seyreltin. 2 x 104 hücre/l konsantrasyonuna ulaşmak için RENCA hücrelerini ayırın ve yukarıdaki çözeltide yeniden askıya alın.
      NOT: Heterojen implantlar için 1:1 vhl-WT:VHL-KO hücreleri ve homojen implantasyon için tek başına VHL-WT kullanın.
    2. Hücre süspansiyonuna üstünlük sağlamak için, her hücre karışımının 100 μL'sini 200°L pipet uçlarında doldurun ve 15 dakika boyunca bir hücre kuluçka makinesine yerleştirin.
    3. Cam yüzeyindeki her yumurta için pencereden 100 μL hücre süspansiyonu yerleştirin.
      NOT: Bazı protokoller implantasyon dan önce CAM çizilme gerektirir23. Bu RENCA hücreleri için gerekli değildir, çünkü çok hızlı büyürler.
  5. CAM'deki hücreleri 10 gün boyunca büyütün ve 2 günde bir fotoğraf çekin.
  6. Ötenazi ve tümör, kan ve organları hasat.
    1. Gelişim günü 20 (tümör gün 10), bir heparinize 10 mL şırınga ile korallantotik ven yoluyla kan toplamak.
    2. 15 dakika buz üzerine koyarak embriyolar ötenazi.
    3. Tümörleri hasat edin ve tartar. Fareler için kullanılan benzer steril doku hasat tekniği kullanarak akciğer ve karaciğerleri diseksiyon22.
      NOT: Tavuk karaciğerlerinde karın boşluğunda görülen ilk organlar olan iki lob vardır. Bunları akciğerlerle karıştırmayın. Tavuk akciğerlerkalp ve septum altında yer almaktadır26. Akciğerlerin başarılı toplama maruz kaburga ile teyit edilebilir.
    4. Parafin-balmumu katıştırma için bir gecede% 4 paraformaldehit tümörler ve parçalanmış organları düzeltmek.
  7. Tavukları yumurtadan çıkar.
    1. Uzun süreli tümör büyümesi için kuluçkaya 21 gün boyunca devam edin ve tavukların 37 °C'de ve en az %60 nemde yumurtadan çıkmasını bekleyin.
      NOT: Tavuklar 21. Bu durumda, yumurta kabukları çatlama bazı yardımcı olur. Tavukların kuluçka işlemini 24 saat içinde tamamlamaları önemlidir, çünkü o andan sonra besin yetersizliğinden ölürler.
    2. Bir hayvan tesisinde (2017-102-01A) 2 hafta boyunca tavuk yetiştirin.
    3. Gelişim günü 34 (tümör gün 24), izofluran inhalasyonu ile civciv ötanazi servikal dislokasyon takip.
    4. Fareler için kullanılan benzer steril doku hasat tekniği kullanarak akciğerleri incelemek22. Sonra, parafin-balmumu gömme için bir gecede% 4 paraformaldehit onları düzeltmek.

3. İmmünohistokimya

NOT: Tüm doku kesitleri ve H&E boyama, Los Angeles California Üniversitesi'ndeki Translational Patoloji Çekirdek Laboratuvarı (TPCL) tarafından yapılmıştır.

  1. 20 dakika boyunca 65 °C'de kızakları pişirin ve ksilen kullanarak 3x deparafinize edin ve %100 etanolten suya seri olarak rehidrat.
  2. 25 dakika boyunca bir sebze buharlı haşlanmış bir sitrat tampon antijenleri alın.
  3. Engelleme için %1 BSA uygulayın. Daha sonra PBS'de 1:200 seyreltme oranında hazırlanan birincil antikorları (anti-VHL, anti-HA, anti-flag) uygulayın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  4. TBST (her biri 7 dk) ile 3x yıkadıktan sonra, 1:200 seyreltme de ikincil antikor ile slaytlar inkübat. TBST ile 3x yıkayın (her biri 7 dk) ve hematoksilin karşı boyama ardından DAB reaktifleri uygulayın.

4. Akış Sitometri

  1. Fare veya tavuk kanını üreticinin protokolüne göre kırmızı kan hücresi (RBC) lisis tamponu ile işleyin.
    NOT: Cam kanını analiz ederken yeterli RBC lysis özellikle önemlidir çünkü tavuk RBC'leri çekirdeklidir ve ileri ve yan dağılım kullanılarak akış sitometrisinde kolayca ayırt edilemez.
  2. Kan dolaşımında akış sitometrisi çalıştırın ve mStrawberry ve EGFP ekspresyonuna ait verileri analiz edin.
  3. Birincil kapıları enkaz, ölü hücreler ve unlysed RBC'ler hariç ileri ve yan dağılıma göre ayarlayın.
  4. Floresan kapılarını lekesiz numunelere ve tek lekeli kontrollere göre ayarlayın. VHL-WT, VHL-KO veya etiketlenmemiş RENCA hücreleri ile astarlanmış kan lysate kullanın tek lekeli kontroller ve lekesiz kontroller sırasıyla.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aksi belirtilmedikçe her deneme en az 3x gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Önemi, iki grup varken eşleştirilmiş, Öğrencinin T-testi veya üç veya daha fazla grup varken tek yönlü bir ANOVA ile belirlenmiştir. Önemi belirlemek için 0,05 p değeri kesintisi kullanıldı.

Ortonik implante RENCA hücreleri başarıyla fare böbreklerinde büyüdü, BLI ve H & E boyama tarafından doğrulandı

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitel maligniteleri olan birçok hastada, hayati organlara metastaz mortalitenin birincil nedenidir. Bu nedenle, altta yatan mekanizma ve metastatik hastalık için tedavi yeni bir yol bulmak esastır. Ne yazık ki, ilgili metastatik ccRCC hayvan modellerinin eksikliği vardır. Büyük ölçüde sorun çok sayıda transgenik böbrek epitel hedefli VHL nakavt faremodelleri9,10nesil rağmen farelerde ccRCC yeniden eksikliği kaynaklanmaktadır. Burada, fare ve tavuk CAM olmak üzer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma UCLA JCCC tohum hibe, UCLA 3R hibe, UCLA CTSI ve UC TRDRP (LW) tarafından finanse edilmiştir. Biz Crump Enstitüsü Preklinik Görüntüleme Tesisi, TPCL ve UCLA Laboratuvar Hayvan Tıbbı (DLAM) Deneysel yöntemlerile yardım için teşekkür ederiz. Akış sitometri ucla Johnson Kapsamlı Kanser Merkezi (JCCC) ve Merkezi AIDS Araştırma Akış Sitometri Çekirdek Tesisi ulusal Sağlık enstitüleri tarafından desteklenen yapıldı P30 CA016042 ve 5P30 AI028697, ve JCCC tarafından, UCLA AIDS Enstitüsü, David Geffen Tıp Fakültesi UCLA UCLA Şansölye Ofisi, ve UCLA Yardımcısı Araştırma Ofisi. İstatistik danışmanlık ve veri analizi hizmetleri UCLA CTSI Biyoistatistik, Epidemiyoloji ve Araştırma Tasarımı (BERD) Programı tarafından sağlanan NIH / Ulusal Merkezi Çeviri Bilim UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881 İlerletme için desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kalsiyum, Magnezyum ve Sodyum Bikarbonat içermeyen HBSS'de %0,25 Tripsin, %0,1 EDTACorning25053CI
8050-N/18 Mikro 8V Max Alet KitiDremel8050-N/18
anti-VHL antikoruAbcamab135576
BD Lo-Doz U-100 İnsülin ŞırıngalarıBD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences
BDGeneral Kullanım ve PrecisionGlide Hipodermik İğnelerFisher Scientific14-826-5D
DAB Kromojen KitiBiocare MedicalDB801R
D-Luciferin Ateşböceği, potasyum tuzuGoldbioLUCK-1G
Kalsiyum ve Magnezyum içermeyen DPBSGibcoLS14190250
DYKDDDDK Etiket Monoklonal Antikor (FG4R)eBioscience14-6681-82
Etanol 200 ProvaSilindir Yönetimi43196-11Suda% 70 hazırlayın
Fetal Sığır Serumu, Nitelikli, USDA onaylı BölgelerFisher Scientific10-437-028
Fisherbrand Keskin Uçlu Diseksiyon MakasıFisher Scientific08-940
Fisherbrand Steril Pamuk ToplarıFisher Scientific22-456-885
FisherbrandYüksek Hassasiyetli Düz Konik Ultra İnce Uçlu Cımbız/ForsepsFisher Scientific12-000-122
FisherbrandPremium Mikrosantrifüj Tüpleri: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Formaldehit Soln., %4, Tamponlu, pH 6.9 (yaklaşık %10 Formalin soln.), Histoloji içinMilliporeSigma1.00496.5000
Hamilton özelleştirilmiş şırıngaHamilton8040825 & L, Model 702 SN, Ölçer: 30, Nokta Stili: 4, Açı: 30, İğne Uzunluğu: 17 mm
HA-prob Antikoru (Y-11)Santa Cruz Biyoteknolojisc805
HemositometreHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Yumurta Kuluçka Makinesi Combo KitKuluçka DeposuHB1588D
İzotezi (İzofluran) çözeltisiHenry Schein Hayvan Sağlığı1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Görüntüleme SistemiPerkin Elmer
Matrigel GFR Membran MatrisiCorningC354230
Medline Cerrahi Alet Örtüsü, Şeffaf Yapıştırıcı, 24" x 18"Medex TedarikMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraksiyon V [Sığır Serum Albümini] Isı Şoku İzolasyonuMilliporeSigma2910-25GM
Penisilin-Streptomisin Çözümü, 100X, 10.000 IU Penisilin, 10.000ug/mL StreptomisinFisher ScientificMT-30-002-CI
Pentobarbital SodyumSigma Aldrich57-33-0Salin içinde %1 hazırlayın
Peroksidaz AffiniPure Goat Anti-Fare IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları111-035-045
Povidon-İyot Çözeltisi USP, %10 (a/h)%1 (a/h) Mevcut İyot, Laboratuvar Kullanımı içinRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Puromisin dihidroklorür hidrat, %99, ACROS OrganicsFisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 Orta (Mod.) 1X, L-GlutaminCorning10040CV
ile Scientific 96 Kuyulu Eteksiz Plakalar, DüşükProfilli Fisher ScientificAB-0700
SHARP Hassas Bariyer Uçları, P-200, 200 ve mikro için; l, 960 (96'lık 10 raf)Thomas Scientific1159M40
Nakliye Bandı, Çok Amaçlı, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, 6 Rulo PaketOfis Deposu220717
SütürEthiconJ385H
Tegaderm Şeffaf Pansuman Orijinal Çerçeve Stili 2 3/8" x 2 3/4"Moore Medical1634
Termo-Tavuk Isıtmalı PedK& H üretimi1000
Tygon Clear Laboratuvar Borusu - 1/4 x 3/8 x 1/16 duvar (50 fit)TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR/Cas9 aracılı VHL'nin nakavtı, ardından lentiviral olarak bayrak etiketli EGFP ve ateşböceği lusiferaz
VHL-WTlentiviral olarak etiketlenmiştir HA etiketli mÇilek floresan proteini ve ateşböceği lusiferaz
ile lentiviral olarak etiketlenmiştirDünya Hassas Aleti FORSEPS IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
Yara otomatik klips kitiBraintree scientific, inc.ACS KIT
Ksilenler (Histolojik), FisherChemical Fisher ScientificX3S-4
555899 ile

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009(2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032(2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6(2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815(2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare B brek mplantasyonuVHL Gen NakavtOrtotopik T m r mplantasyonuAkci er Metastaz AnaliziDola an T m r H cresi Say mmm nohistokimyasal TespitCRISPR Gen D zenlemeHasta Kaynakl Ksenogreftler

İlgili makaleler