Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Genotipleri ve Mutasyonel Profilleri Farmakolojik Tepkilere Çeviren Araçlar Olarak Prostat Organoid Kültürleri

9.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60346

⸱

24 Ekim 2019

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

Bu makalede

Özet

Burada sunulan prostat epitel organoidleri farmakolojik yanıtları çalışma için bir protokoldür. Organoidler vivo biyolojiye çok benzer ler ve hasta genetiğini yeniden özetlerler, bu da onları çekici model sistemleri haline getirir. Prostat organoidleri wildtype prostatlar, genetiği değiştirilmiş fare modelleri, iyi huylu insan dokusu ve ileri prostat kanserinden kurulabilir.

Özet

Burada sunulan bir protokol farmakodinamik çalışma, kök hücre potansiyeli, ve prostat epitel organoidlerde kanser farklılaşması. Prostat organoidleri, prostatik epiteli andıran tanımlanmış bir ortamda yetişen androjen duyarlı, üç boyutlu (3D) kültürlerdir. Prostat organoidleri vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş fare modelleri, iyi huylu insan dokusu ve ileri prostat kanserinden kurulabilir. Daha da önemlisi, hasta kaynaklı organoidler genetik ve in vivo tümör biyolojisindeki tümörlere çok benzerler. Ayrıca, organoidler CRISPR/Cas9 ve shRNA sistemleri kullanılarak genetik olarak manipüle edilebilir. Bu kontrollü genetik, genotiplerin ve mutasyonprofillerinin farmakolojik yanıtlar üzerindeki etkilerini hızla test etmek için bir platform olarak organoid kültürü cazip kılmaktadır. Ancak, deneysel protokoller özellikle tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için organoid kültürlerin 3D doğaya adapte edilmelidir. Burada tanımlanan organoid oluşum kapasitesini belirlemek için tohumlama tahlilleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller vardır. Daha sonra, bu rapor ilaç tedavilerini nasıl gerçekleştireceklerini ve canlılık ölçümleri, protein izolasyonu ve RNA izolasyonu yoluyla farmakolojik yanıtın nasıl analiz edilebildiğini göstermektedir. Son olarak, protokol, organoidlerin ksenogreftleme için nasıl hazırlanacağını ve subkutan greftleme kullanılarak in vivo büyüme testlerinin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır. Bu protokoller son derece tekrarlanabilir veriler sağlar ve 3B kültür sistemleri için yaygın olarak uygulanabilir.

Giriş

İlaç direnci kanser tedavisinde önemli klinik sorunlardan biridir. Metastatik prostat kanseri (PCa) tedavisi öncelikle androjen sinyal eksenine yöneliktir. Yeni nesil anti-androjen tedavileri (örneğin, enzalutamide ve abiraterone) büyük klinik başarı göstermiştir, ama hemen hemen tüm PCa sonunda bir androjen-bağımsız devlet doğru ilerler, ya da kastrasyona dirençli prostat kanseri (CRPC).

CRPC'nin son genomik ve transkripsiyon profili prostat kanserinde üç genel direnç mekanizması olduğunu ortaya koymuştur: 1) androjen reseptörünün (AR)sinyalizasyonuile sonuçlanan mutasyonları aktive eder 1; 2) bypass sinyalaktivasyonu, yeni nesil anti-androjen tedavi direnci için bir ön klinik modelde örneklendiği gibi hangi glukokortikoid reseptöraktivasyonu (GR) AR sinyal kaybı telafi edebilir2; ve 3) tümör hücrelerinin ilaç hedefine bağımlı bir hücre tipinden buna bağımlı olmayan başka bir hücre tipine geçiş yaparak direnç kazandığı soy plastisite süreci (PCa'da AR-negatif olarak temsil edilir) ve/veya nöroendokrin hastalık [NEPC])3,4. Ancak, ilaç direncine neden olan moleküler mekanizmalar anlaşılamamıştır. Ayrıca, edinsel anti-androjen direnci yararlanılabilir terapötik güvenlik açıklarına yol açabilir. Bu nedenle, hasta fenotiplerini ve genotipleri taklit eden model sistemlerde ilaç yanıtlarını değerlendirmek esastır.

Prostat organoidleri tanımlanmış bir ortama sahip 3Boyutlu protein matrisinde yetişen organotipik kültürlerdir. Daha da önemlisi, prostat organoidler murin veya insan kökenli iyi huylu ve kanserli doku kurulabilir, ve onlar in vivo bulunan henotypic ve genotypik özellikleri korumak5,6. Daha da önemlisi, hem anti-androjen duyarlı PCa ve CRPC hücreleri organoidlerin mevcut özet temsil edilmektedir. Ayrıca, prostat organoidleri kolayca genetik CRISPR /Cas9 ve shRNA5kullanılarak manipüle edilir. Bu nedenle, prostat organoidleri ilaç yanıtlarını test etmek ve direnç mekanizmalarını açıklamak için uygun bir model sistemdir. Burada, prostat organoidleri kullanarak ilaç testi yapmak ve farmakolojik yanıtları analiz etmek için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde tanımlanan tüm çalışmalar daha önce kurulmuş olan murine organoidler ve hasta kaynaklı organoidler ile gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan çalışmaları Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Araştırma Hayvan Kaynak Merkezi yönergelerine uygun olarak yapılmıştır (IACUC: 06-07-012). Tüm hasta kaynaklı dokular Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi 'nin (IRB: 12001) kural ve yönetmeliklerine uygun olarak toplanmıştır.

1. Orta ve tampon hazırlama

  1. Deneye başlamadan önce bir gecede 4 °C'de çözülen bazal membran matrisi (örneğin, Matrigel). Kullanım sırasında buzüzerinde tutun.
  2. Kültür plakalarını deneylerden önce 24 saat boyunca 37 °C'ye yerleştirin. Bu polimerize bodrum membran matris kubbe (bundan böyle matris kubbe olarak anılacaktır) yardımcı olacaktır. Kaplama organoidleri adım 2.1.2 olarak tanımlanır.
  3. Organoid ortamı belirlenen protokol5'egöre hazırlayın.
  4. Epidermal büyüme faktörü eklemeden organoid ortamı hazırlayın (EGF; komponentler için Malzeme Tablosu'na bakın). EGF AR transkripsiyonel çıktı bastırır ve anti-androjen direnciconfers 5.
  5. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile Dulbecco Modifiye Kartal orta (DMEM) hazırlayın.
    NOT: Bu ortam bölüm 2-4'te tripsin replasmanı ile enzimatik sindirimi inhibe etmek için kullanılır.
  6. Üreticinin protokolüne göre ilaç çözümleri hazırlayın. Enzalutamide/mdv3100 (bundan böyle ikinci nesil anti-androjen olarak anılacaktır) için, dimetil sülfoksit (DMSO) 100 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Stok -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir ve taze olarak yapılmak zorunda değildir.

2. İzolasyon, enzimatik sindirim ve organoidlerin kurulması

  1. Daha önce kurulmuşprotokolleregöre fare veya insan dokusundan prostat organoidleri izole5 ,7. Kısa bir açıklama aşağıda verilmiştir.
    1. Kıyma ve enzimatik tek bir hücre süspansiyon üretmek için prostat dokususindirmek. Bu deneyde ADMEM/F12'de 5mg/mL kollajenaz tip II'nin 1 mL'si prostat dokusunun 50 mg sindirimi için kullanıldı.
    2. 5 dakika için 300 x g santrifüj ile hücreleri toplamak, hücreleri saymak, bazal membran matris onları yeniden askıya almak, ve uygun yoğunlukta plaka5,7 önceden ısıtılmış organoid kültür plakaları üzerinde matris kubbeler (kaplama yöntem Şekil 1A'dagösterilmiştir.
    3. Kubbelerin katılaşmasını ve kubbelerin üstlerine ortam eklemesine izin verin ki tamamen kaplanmış olacak.
  2. Aşağı akım uygulamaları için organoidleri istenilen miktarda büyütün. Hücre numarası standart sayma yöntemleri ile belirlenebilir. Yoğunluk la ilgili ek ayrıntılar için protokolün uygulamaya özel bölümüne bakın.
  3. P1000 pipet kullanarak, orta ve pipet yukarı ve aşağı bozmak için çizin. Bazal membran matrisi tamamen bozulduğunda süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Tek 15 mL konik tüp başına 10'dan fazla kubbe yerleştirmeyin. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  4. Supernatant çekin ve PBS 5 mL ile hücre pelet yıkayın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  5. Supernatant çekin ve tripsin replasmanın4 mL pelet resuspend. 37 °C'de sallayarak 5-10 dakika sindirin. Tripsin replasmanı inhibe etmek için eşit hacimli organoid ortam + %10 FBS ekleyin. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  6. Supernatant kapalı çekin ve PBS 1 mL resuspend.
  7. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için süspansiyonu 40 μm filtre ile filtreleyin. Hemositometre veya eşdeğer sayma cihazı kullanarak hücre numarasını ölçün.
    NOT: Tek hücreli tek hücreleri elde etmek zorsa, tek hücreli bir çözüm elde etmek için akış sıralamasını kullanın.

3. Organoid oluşum kapasitesinin değerlendirilmesi

NOT: Organoid oluşturabilen hücrelerin yüzdesini belirlemek için, kök/ata potansiyeli için bir tohumlama tonu yapılabilir. Organoid oluşum kapasitesi de canlılık tahlilleri için bir hücre tohumlama numarası tanımlamak için önemlidir.

  1. 10 μM Rho kinaz inhibitörü Y-27632 içeren organoid ortam kullanarak süspansiyonun 10 μL'si başına 2,7 ila 100 hücre de elde edilen hücre süspansiyonu seyreltin.
  2. 1.100 hücreyi (110 μL süspansiyon) yeni bir konik tüpe aktarın.
  3. 285 μL'lik bazal membran matrisi ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın. Bu ~ 70% matris konsantrasyonu neden olacaktır.
    NOT: Tohumlama sırasında bazal membran matrisinin seyreltilmesi, protein matrisinin viskozitesinin neden olduğu kubbe büyüklüğündeki değişimi büyük ölçüde azaltır.
  4. Önceden ısıtılmış 24 kuyu plakalı matris kubbelerin 35 μL'lik tohum hücreleri 200 hücre/kuyu ile sonuçlanır. Plaka 3-5 örnek başına çoğaltma (ayrıca Şekil 1A ve adım 2.1.2'deki kaplama yöntemine de bakınız).
  5. Hücrelerin matris kubbe içinde kalmasını sağlamak için, plaka yıkın ve bir hücre kuluçka içine yerleştirin bodrum membran matris katılaşmak için.
  6. 10 dakika sonra, kuvözden plakayı çıkarın ve Rho kinez inhibitörü içeren ortam ekleyin.
  7. Ortamı 2 günde bir yenileyin. 7 gün sonra organoid sayısını ölçün. Rho kinazininhibitörlerini deney boyunca medyada tutun.
  8. Kubbe başına kurulan organoid lerin sayısını sayın ve kaplanmış toplam hücre sayısından (200 hücre) oluşan organoidlerin yüzdesini hesaplayın.
    NOT: Organoid kuruluş oranları hücre tipine ve genotiplerine bağlı olarak %3-60 arasında değişmektedir.

4. Organoidlerin farmakolojik yanıtlarının belirlenmesi

  1. Adım 2.7'den itibaren, bir matris kubbede 1.000-10.000 hücre tohum. Son hücre numarasını belirlemek için organoid oluşum verimliliğini ve büyüme hızını bir proxy olarak kullanın.
    NOT: Önerilen hücre numaraları Tablo 1'deverilmiştir. Çözümleme başına koşul başına üç ila beş çoğaltma kullanın. Viskozitenin neden olduğu borulama hatalarını azaltmak için %70'lik son konsantrasyonu kullanın.
  2. 24 kuyu plakalı matris kubbelerin 35°L'lik tohumu ve kubbelerin bölüm 3'te yapıldığı gibi katılamasına izin verin (Şekil 1A ve adım 2.1.2'deki kaplama yöntemine de bakınız). Rho kinaz inhibitörü ve tercih edilen ilaç içeren orta ekleyin. Bu yöntem tüm ilaçlara uygulanabilir, ancak bu protokolde örneğin 10 μM'de ikinci nesil anti-androjen kullanılır. Yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu belirlemek için (IC50), bir log10 artımlı gerçekleştirmek, ve bir kontrol olarak, ilacın çözündolduğu araç kullanın.
  3. Her iki veya üç günde bir orta yenileyin ve ilacın farmakolojik yanıtını belirlemek için 7. Zaman dilimleri deney ve ilaç seçimi arasında değişebilir.
    NOT: Organoidlerin bu tahlilleri yapabilmeleri için dengeleniye gerek yoktur.
  4. Bir P1000 pipet kullanarak organoidleri sağlam tutmak için, orta ve pipet yukarı ve aşağı bodrum membran matris bozmak için çizin.
  5. Bazal membran matrisi tamamen bozulduğunda süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. 15 mL konik tüp başına 10'dan fazla matris kubbe aktarmayın.
  6. Santrifüj 300 x g için 5 dk. Supernatant çekin ve 5 mL PBS ile yıkayın.
  7. 1 mL PBS'deki organoidleri yeniden askıya alın ve triturasyon ve cam Pasteur pipet kullanarak organoidleri bozun.
  8. Organoid parçalarının sayısını ölçün. Tohum 5, adım 2.1.2'de açıklandığı gibi 100 organoid parçasını içeren kopyalar.
  9. Bölüm 7'de aşağıda açıklandığı şekilde hücre canlılığı tayini gerçekleştirin.

5. Organoidlerden RNA izolasyonu

NOT: Ticari olarak kullanılabilen sütun tabanlı yöntemler, RNA'nın iyi miktarda ve kalitesisağlar. İyi miktarda RNA sağlamak için, örnek başına en az bir kubbe kullanın; ancak, üç kubbe kullanarak tavsiye edilir, hangi bir 12 kuyu plaka tek bir kuyuda tohumlanmış olabilir.

  1. ß-mercaptoethanol ekle (%1) RNA izolasyon kitinde glutatyon lisis tampon.
  2. Organoidler içeren bodrum membran kubbelerden orta çekin ve bu tampon 750 ° L ekleyin. P1000 pipetkullanarak pipet yukarı ve aşağı. Tüm temel membran matrisinin çözülmüş olup olmadığını kontrol edin.
  3. %70 etanol 750 μL ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Daha sonra karışımın 700 μL'sini kolona aktarın, 12.000 x g'de 1 dk santrifüj yapın ve kalan kısmı yla tekrarlayın.
  4. Üreticinin talimatlarına göre yıkar ve kolon da DNase tedavisi ni gerçekleştirin. 30-50 μL RNAse içermeyen suda elute RNA.
  5. Konsantrasyonları OD = 260 nm ve 280 nm'de bir florometre kullanarak ölçün ve -80 °C'de saklayın veya akış aşağı uygulamalarına devam edin.

6. Organoidlerden protein izolasyonu

NOT: Protein izolasyonu için fosfataz ve proteaz inhibitörleri içeren standart RIPA tamponu hazırlayın(Malzeme Tablosu). En az üç kubbe kullanılması tavsiye edilir, hangi tek bir 12 kuyuda tohumlanabilir.

  1. Bir P1000 pipet kullanarak, temel membran matris bozmak için yukarı ve aşağı organoidler ve pipet içeren bodrum membran kubbeler ile hücreden orta çizin.
  2. Tamamen bozulduğunda, süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  3. Supernatant çekin ve buz gibi PBS 5 mL ile yıkayın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  4. Supernatant çekin ve tripsin replasmanın4 mL pelet resuspend. 37 °C'de sallayarak 5-10 dakika sindirin.
  5. Tripsin replasmanı inhibe etmek için eşit hacimli organoid ortam + %10 FCS ekleyin. Santrifüj 300 x g 5 dk.
    NOT: Santrifüj sonrası pelette hiçbir bazal membran matrisi görünmemelidir.
  6. Supernatant çekin ve buz gibi PBS 5 mL ile yıkayın. Supernatant çekin ve bir P1000 pipet kullanarak lysis tampon 300 μL hücre pelet yeniden askıya, sonra 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
  7. 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka ve daha sonra 4 ° C sıcaklıkta soğutulmuş suda 30 s her için 2x sonicate. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve standart yöntemlerle protein nicelemesi yapın.
  8. 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve yükleme boyası içeren sodyum dodecyl sülfat (SDS) ekleyerek proteinden arındırın. -80 °C'de depolayın veya akış aşağı uygulamalarına devam edin.

7. Organoidler ile hücre canlılığı tsay

NOT: Hücre canlılığı, ticari olarak kullanılabilen hücre canlılığı titrekiti ve luminometre kullanılarak değerlendirilebilir. Üreticinin talimatlarına göre arabellek hazırlayın. Durum başına beş çoğaltma önerilir: bir çoğaltma bir 35 μL bodrum membran matris kubbe bir kuyuda oluşan 24 kuyu plaka.

  1. Matris kubbeleri sağlam bırakmak için dikkatli olmak, organoid kültürün orta çekin.
  2. Matris kubbesini bozmak için 65 μL PBS ve pipet ekleyin.
  3. Hücre canlılık isame kiti arabelleği 100 μL ekleyin ve pipetleme ile yeniden askıya alın.
  4. Sallayarak 10 dakika oda sıcaklığında (RT) kuluçka.
  5. 100 μL karışımı luminometreye uygun olmayan yarı saydam bir plakaya aktarın ve hücre canlılığı ölçüm kiti için üreticinin talimatlarına göre okuma yapın.

8. Ksenogreftleme için organoidlerin hazırlanması

NOT: Organoidler, hem bağışıklık sistemi zayıf olan hayvanlarda hem de İzojenik farelerde deri altı greftleme için de uygundur. Enjekte edilen organoidlerin in vivo olarak ayırt edilebilmesini sağlamak için, florofor5'ioluşturan bir şekilde ifade eden organoidleri etiketletir. Aşılama verimi organoid çizgiler arasında değiştiğinden, enjeksiyon başına 5 x10 6 hücreye 5 x 106 hücre kullanılarak aşılama için pilot deney yapılmasını tavsiye edilir.

  1. Bir P1000 pipet kullanarak, orta ve pipet yukarı ve aşağı bodrum membran matris bozmak için çizin. Tamamen bozulduğunda, süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
    NOT: 15 mL konik tüp başına 10'dan fazla matris kubbe aktarmayın.
  2. Supernatant çekin ve PBS 5 mL ile yıkayın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  3. Supernatant çekin ve tripsin replasmanın4 mL pelet resuspend. 37 °C'de sallayarak 5-10 dakika sindirin.
  4. Trippsin replasmanı inhibe etmek için eşit hacimli organoid ortam + %10 FBS ekleyin. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  5. Supernatant kapalı çekin ve PBS 1 mL resuspend. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için süspansiyonu 40 μm filtre ile filtreleyin. Hücreleri standart yöntemlerle ölçün.
  6. PBS + Rho inhibitöründeki hücreleri 100 μL'de 2 x 106 hücre konsantrasyonuna geri döndürün (değişen konsantrasyonlar için gerekli hücre konsantrasyonları ve mutlak hücre sayısı için Tablo 2'ye bakın). 1:1 süspansiyon oluşturmak için eşit hacimli bodrum membran matrisi kullanın. Süspansiyonu buza yerleştirin.
  7. Hücreleri standart protokollere göre enjekte edin ve standart yöntemlerle ksenogreft büyümesini izleyin8.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tohumlama verimliliği
Organoid oluşum kapasitesi fenotip ve genotip ile belirlenir. Yabani tip (WT) prostat bazal hücreleri üstün organoid oluşum kapasitesi (0-@) gösterdi luminal hücrelere göre (%3) (Şekil 1A). Organoid kurulmasından sonra oluşum kapasitesi önemli ölçüde artmıştır. Tipik olarak, WT organoidinden elde edilen hücrelerin %-30'u yeni bir organoid oluşturabilir(Şekil 1B

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Anti-androjen direncinin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması ve potansiyel terapötik zayıflıkların keşfedilmesi, prostat kanserini taklit eden model sistemlerde farmakolojik yanıtların test edilmesini gerektirir. Burada açıklanan hasta kaynaklı ve genetiği değiştirilmiş prostat organoidlerinde farmakolojik yanıtların güvenilir analizi ve bu organoid örneklerinin downstream uygulamaları için hazırlanması için ayrıntılı bir protokoldür.

Bu protokolde iki kritik adım vardır. Bunlar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

C.L.S Novartis yönetim kurulunda görev yapmaktadır; ORIC İlaç kurucularından ve enzalutamide ve apalutamid coinventor olduğunu; Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra ve PMV'nin bilim danışmanıdır; 2014 yılında Genentech/Roche tarafından satın alınan Seragon'un kurucularındandır. W.R.K. bir coinventor ve organoid teknoloji patent sahibidir.

Teşekkürler

K.P. NIH 1F32CA236126-01 tarafından desteklenir. C.L.S. HHMI tarafından desteklenir; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; ve Starr Kanser Konsorsiyumu. W.R.K. Hollanda Kanser Vakfı/KWF Buit 2015-7545 ve Prostat Kanseri Vakfı PCF 17YOUN10 tarafından destekleniyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
A83-01Tocris2939Organoid ortam bileşeni: Son konsantrasyon 200 nM
ADMEM/F12Gibco/Life teknolojileri12634028Organoid medium bileşeni
B27Gibco/Life teknolojileri17504-044Organoid orta bileşen
Hücre kültürü plakalarıFisher657185
Hücre Titresi GloPromegaG7571
DHTSigma-AldrichD-073Organoid orta bileşen: Son Konsantrasyon 1 nM
DMSOFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09Organoid orta bileşen: Nihai konsantrasyon fare için 50 ng/ml, İnsan
FGF10Peprotech100-26İnsana özgü organoid ortam bileşeni: Nihai konsantrasyon 10 ng/ ml
FGF2Peprotech100-18Bİnsana özgü organoid ortam bileşeni: Nihai konsantrasyon 5 ng/ml
GlutamaxGibco/Yaşam teknolojileri35050079Organoid ortam bileşeni
HEPES ÜRETİM KURUMYOKOrganoid ortam bileşeni: Nihai konsantrasyon 10 mM
Matrigel (Büyüme faktörü azaltılmış & Fenol Kırmızısı içermez)CorningCB-40230COrganoid orta bileşen
N-AsetilsisteinSigma-AldrichA9165Organoid orta bileşen: Son konsantrasyon 1.25 mM
NikotinamidSigma-AldrichN0636İnsana özgü organoid ortam bileşeni: Nihai konsantrasyon 10 mM
NOGGINPeprotech veya Noggin yapılı stabil transfekte edilmiş 293t hücreler (Karthaus ve ark. 2014)120-10COrganoid ortam bileşeni: Nihai Konsantrasyon %10 şartlandırılmış ortam veya 100 ng/ml
Penisilin / Streptavidinİkizler Biyo-Ürünler400-109Organoid orta bileşenli
Fospataz inhibitörleriMerck Millipore524629
Prostaglandin E2Tocris3632464
Proteaz İnhibitörleriMerck Millipore 539131
R-SPONDINPeprotech veya R-Spondin1 yapısına sahip stabil transfekte edilmiş 293t hücreleri (Karthaus ve ark. 2014)120-38Organoid ortam bileşeni: Son Konsantrasyon %10 şartlandırılmış ortam veya 500 ng/ml
RIPA tamponuMerck20-188
RNA-kolay minikitQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7< / a >İnsana özgü organoid ortam bileşeni: Nihai konsantrasyon 10 & mu; M
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049Organoid orta bileşen: Nihai Konsantrasyon 10 & mu; M
için 5 ng/nl İÇİ

Kaynaklar

  1. Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454(2015).
  2. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  3. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  4. Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
  5. Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  6. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  8. Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
  9. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  10. Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
  11. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).
  12. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  13. Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891(2019).
  14. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  15. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  18. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  19. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  20. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  21. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  22. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Organoid K lt rFarmakolojik Yan tGenotip Analizila TedavisiCanl l k AnaliziProtein zolasyonuRNA zolasyonuKsenogreft AnaliziCRISPR Cas9
Genotipleri ve Mutasyonel Profilleri Farmakolojik Tepkilere Çeviren Araçlar Olarak Prostat Organoid Kültürleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.