Method Article

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

DOI:

10.3791/60362

⸱

October 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans, embriyonik gelişim sırasında hücre kader özelliklerinin ve morfogenetik olayların sistematik analizinde önde gelen sistemdir. Bir sorun embriyogenez dinamik yaklaşık 13 saat bir süre içinde gelişir; bu yarım günlük zaman ölçeği, görüntülenebilen embriyo sayısını sınırlayarak deneylerin kapsamını kısıtlamıştır. Burada, orta zaman çözünürlükte 80-100 embriyoda, 14 farklı koşuldan, tek bir gecede, aynı anda 3D hızlandırılmış gelişim görüntülemesağlayan yarı-yüksek iş letme protokolü açıklıyoruz. Protokol basittir ve nokta ziyaret kapasitesine sahip bir mikroskoba erişimi olan herhangi bir laboratuvar tarafından uygulanabilir. Bu protokolün yararı, mikrop tabakası belirtimi ve morfogenezin önemli yönlerini görselleştirmek için optimize edilmiş floresan işaretleri ifade eden iki özel olarak üretilmiş suşları görüntülemek için kullanılarak gösterilmiştir. Verileri analiz etmek için, tüm kanallarda, z adımlarında ve zaman noktalarında tek tek embriyoları daha geniş bir görüş alanından eken ve her embriyo için dizileri ayrı bir tiff yığınına kaydeden özel bir program oluşturulmuştür. Kullanıcı dostu bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içeren program, görselleştirme veya otomatik analize hazırlık olarak bireysel embriyoları izole ederek, ön işlemeye ve tek tip yönlendirerek veri işlemeyi kolaylaştırır. Ayrıca her zaman noktasında her embriyo için maksimum yoğunlukfloresan projeksiyon ve brightfield görüntüleri görüntüleyen bir çok panelli dosya içine bireysel embriyo verileri derleyen bir ImageJ makro. Burada açıklanan protokoller ve araçlar, daha önce tanımlanmış 40 gelişimsel genin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi karakterize etmek için kullanılarak doğrulanmıştır; bu analiz daha önce açıklamalı gelişimsel fenotipleri görselleştirmiş ve yenilerini ortaya koymuştur. Özetle, bu çalışma ayrıntıları bir kırpma programı ve ImageJ görselleştirme aracı ile birleştiğinde bir yarı-yüksek-throughput görüntüleme yöntemi, bilgilendirici floresan belirteçleri ifade suşları ile birleştiğinde, büyük ölçüde analiz etmek için deneyler hızlandırır embriyonik gelişim.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans embriyo mekanistik hücre biyolojisi ve hücre kader özellikleri ve morfogenetik olayların analizi için önemli bir model sistemi embriyonik gelişimsürüş 1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Bugüne kadar, embriyodaki hem hücresel düzeydeki olayların hem de hücre kaderi özelliklerinin karakterizasyonunun büyük bir kısmı, embriyoların her 10-100'de bir kez elde edilmesiy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. C. elegans Embriyolarının Yarı-yüksek-yüksek-throughput Görüntüleme için hazırlanması

NOT: Protokolün bu bölümünün amacı, uygun marker suşlarından(Şekil 2)parçalanmış yarı senkronize (2 ila 8 hücreli evre) C. elegans embriyolarından oluşan bir popülasyonu görüntüleme için cam dipli 384 kuyulu bir plakaya yüklemektir. Diğer plaka biçimleri de işe yarayabilir, ancak küçük kuyu boyutu embriyoların yayılmasını nispeten küçük bir alana kısıtladığı için 384 kuyu plakası tercih edilir, bu da zaman atlamalı görüntüleme için birden fazla embriyo içeren alanların belirlenmesini kolayla....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler tedirginliklerin C. elegans embriyonik gelişimi üzerindeki etkisini karakterize etmede önemli bir zorluk, embriyoların ilk bölünmeden 20°16'dauzama nın sonuna kadar ilerlemesi için yaklaşık 10 saat almasıdır. Büyük embriyo kohortlarının aynı anda görüntülenebileceği yarı yüksek iş yapma yöntemi, bu zaman ölçeğindeki olaylar için yararlıdır, çünkü her koşul için yeterli topluluk boyutuna paralel olarak birden fazla koşulun görüntülenmesine izin verir. kantitatif analiz (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, C. elegansembriyonik gelişim genlerin işlevini profilini daha büyük ölçekli çabaları sağlamak için geliştirilen araçlar ve yöntemler bir paketi açıklanır. Yarı yüksek iş yöntemimiz, tek bir deneyde 80-100 embriyo için 20 dk çözünürlükte embriyonik gelişimin 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesini sağlar. Bu protokol istenilen herhangi bir belirteç suş (lar) ile kullanılmak üzere adapte edilebilir iken, bu çalışma embriyogenez sırasında olayları izlemek için geliştirilen iki özel suşları kullanarak yö.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.D.O. Ulusal Institute of General Medical Sciences sponsorluğunda University of California San Diego Kurumsal Araştırma ve Akademik Kariyer Geliştirme Ödülü (NIH/IRACDA K12 GM068524) tarafından desteklendi. A.D. ve K.O. Ludwig Kanser Araştırmaları Enstitüsü tarafından desteklendi ve bu da onlara bu çalışmayı desteklemek için kullanılan araştırma fonu sağladı. Biz Andrew Chisholm bu projenin erken aşamalarında yaptığı tavsiye için müteşekkiriz, Ronald Biggs ilk yöntem geliştirme aşamasından sonra bu projeye katkıları için, ve Dave Jenkins ve Andy Shiau destek ve Küçük Molekül Discovery erişim için grubun yüksek içerikli görüntüleme sistemi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aspiratör Borusu KomplesiDrummond Scientific2-000-000
Kalibre Edilmiş Pipet (25 mL)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager YazılımıYokogawa Electric CorpCV1000
Konik Tüp (15 mL)VerilirUSA Scientific1475-0501
CV1000 MikroskopYokogawa Electric CorpCV1000
Depresyon slaydı (3 kuyulu)Erie Scientific1520-006
Diseksiyon MikroskobuNikonSMZ-645
Eppendorf Santrifüj 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJIAçık Kaynakhttps://imagej.net/Fiji
M9 TamponLaboratuvarı Hazırlananhttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
Mikrosantrifüj Tüpü (1.5 mL)USA Scientific1615-5500
Microseal F-folyo contaBio-RadMSF1001
NGM PlakalarıLabhttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Hazırlanan Neşter #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 Kuyu, F-alt, Cam AltGreiner Bio-One781855
Tetramisol HidroklorürSigma AldirchT1512-10G
Cımbız, Dumont #3Elektron Mikroskobu Bilimleri0109-3-PO
U-PlanApo objektif (10 kez; 0.4 NA)Olympus1-U2B823
U-PlanApo objektif (60 kez; 1.35 NA)Olympus1-U2B832
ile Birlikte

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans Embryonic DevelopmentSemi high throughput Imaging3D Time lapse ImagingEmbryo Cropping ProgramImageJ Visualization ToolkitFluorescent Marker StrainsConfocal MicroscopyAutomated Data AnalysisRNAi based ScreeningEmbryo Preparation Protocol

Related Articles