Burada, ticari olarak mevcut mikrokuyu kültür sistemini kullanarak testis spesifik doku mimarisi ile domuz testis organoidlerinin tekrarlanabilir üretimi için bir protokol sıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Microwell Kültürü kullanılarak Testis'e Özgü Mimariye Sahip Domuz Testis Organoidlerinin Üretimi
Bu makalede
Özet
Özet
Organoidler, doku mimarisini ve organların işlevlerini in vivo olarak özetleyebilen birden fazla hücre tipinden oluşan üç boyutlu yapılardır. Organoidlerin oluşumu temel ve çevirisel araştırmaların farklı yollarını açmıştır. Son yıllarda, testis organoidler erkek üreme biyolojisi alanında ilgi topladı. Testis organoidleri hücre-hücre etkileşimleri, doku gelişimi ve germ hücre niş mikroortamda çalışma için izin ve yüksek iş yapımı ilaç ve toksisite tarama kolaylaştırmak. Testis spesifik doku mimarisine sahip testis organoidlerinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesi için bir yöntem gereklidir. Microwell kültür sistemi piramit şeklinde mikrowelller yoğun bir dizi içerir. Ergenlik öncesi testislerden elde edilen testis hücreleri bu mikrowelllere santrifüj edilir ve testis-spesifik doku mimarisi ve hücre çağrışımları ile testis organı oluşturmak için kültürlenir. Bu süreç le binlerce homojen organoid üretilebilir. Burada bildirilen protokol, erkek üremesi üzerinde araştırma yapmak ta bir araştırmacının ilgisini çekebilir.
Giriş
Son yıllarda, üç boyutlu (3D) organoidler ilgi bir canlanma olmuştur. Bağırsak gibi farklı organlar1, mide2, pankreas3,4, karaciğer5, ve beyin6 başarıyla 3D organoid sistemlere türetilmiştir. Bu organoidler in vivo organlara mimari ve fonksiyonel benzerlikler var ve daha biyolojik olarak monolayer kültürsistemleri7 daha doku mikroçevre çalışması için ilgilidir. Sonuç olarak, testis organoidler de ilgi toplamaya başlamıştır8,9,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: 1 haftalık domuz yavrularından alınan testisler, ticari domuzların hadım edilmesinden elde edilen yan ürün olarak ticari bir domuz çiftliğinden elde edilebildi. Testislerin kaynak Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Doku sindirimi için enzim çözeltilerinin hazırlanması
NOT: İki farklı kollajenaz IV çözeltisi (A, B çözeltisi) ve deoksiribonükle I (DNase I) çözeltisi içeren üç farklı enzimatik çözüm gereklidir.
- A çözeltisi hazırlamak için, 20 mg kollajenaz IV S(Malzeme Tablosu)ve 40 mg kollajenaz IV W(Malzeme Tablosu)25 mL yüksek gliko....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mikrowelllerde kendi kendine organize edilen 1 haftalık domuz testlerinden izole hücreler(Şekil 1A, Şekil 2), belirgin dış (seminifer epitel) ve iç bölmeler ( interstitium) (Şekil 1B, Şekil 2). İki bölme kollajen IV+ve bazmembran ile ayrılmıştır. UCH-L1+ve mikrop hücreleri ve GATA4+ve Sertoli hücreleri bo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz in vivo12testis benzer doku mimarisi ile testis organoidlerin çok sayıda tutarlı, tekrarlanabilir nesil sağlayan basit bir yöntem kurduk. Yaklaşım domuz testis hücreleri kullanılarak geliştirilmiş olsa da, daha geniş fare, insan olmayan primat ve insan testis12için de geçerlidir. Testis organoidleri 8 ,9,10,11 üretmek için farklı yöntemlerbildirilmi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Dr. Ungrin'in bir mucit olarak AggreWell teknolojisine finansal bir ilgisi var.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH/NICHD HD091068-01 tarafından Dr. Ina Dobrinski tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100 mm ultra düşük ataşmanlı doku kültürü kabı | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm doku kültürü kabı | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Kök Hücre Teknolojileri | #34411 | |
| Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu | Kök Hücre Teknolojileri | #07010 | |
| Clostridium histolyticium'dan kollajenaz tip IV | Sigma-Aldrich | #C5138 | Kollajenaz IV S |
| olarak adlandırılır Kollajenaz tip IV | Worthington Worthington-Biochem | #LS004189 | Kollajenaz IV W |
| Deoksiribonükleaz I | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta - yüksek glikoz | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Salamin | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Büyüme Faktörü R | & D Sistemleri | # 236-EG | |
| Falcon Hücre Süzgeçleri 70 & m | FisherScientific | # 352350 | |
| Falcon Hücre Süzgeçleri 40 & m | FisherScientific | # 352340 | |
| Fetal Sığır Serumu | ThermoFisher Scientific | # 12483-020 | |
| İnsülin-Transferrin-Selenyum | Gibco | # 41400-045 | |
| Penisilin-Streptomisin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Domuz testis dokusu | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Kanada) | ||
| Steriflip-GP Steril Santrifüj Tüp Üst Filtre Ünitesi | Millipore | #SCGP00525 | |
| Tripsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
Kaynaklar
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
