Yöntem makalesi

İzole Caenorhabditis elegans Embriyo Blastomerler ve Yapıştırıcı Polistiren Boncuklar ile Mekansal Hücre Temas Desenleri In Vitro Reconstitution

DOI:

10.3791/60422

⸱

26 Kasım 2019

 ,  , 
1Department of Zoology, The University of British Columbia, 2Life Sciences Institute, The University of British Columbia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok hücreli sistemlerin doku karmaşıklığı hücre dışı ipuçları ve bireysel hücresel davranışlar arasındaki nedensel ilişkinin belirlenmesini şaşırtmak. Burada, C. elegans embriyo blastomerleri ve yapışkan polistiren boncuklar kullanarak temasa bağlı ipuçları ve bölünme eksenleri arasındaki doğrudan bağlantıyı incelemek için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok hücreli sistemlerde, tek tek hücreler komşu hücrelerden ve çevreden gelen çeşitli fiziksel ve kimyasal ipuçları ile çevrilidir. Bu doku karmaşıklığı dışsal ipuçları ve hücresel dinamikler arasındaki nedensel bağlantının belirlenmesini bozar. Sentetik olarak yeniden oluşturulmuş çok hücreli sistem, araştırmacıların belirli bir ipucu için test etmesini sağlarken diğerlerini ortadan kaldırarak bu sorunun üstesinden gelir. Burada izole Caenorhabditis elegans blastomer ve yapışkan polistiren boncuklarla hücre temas desenlerini yeniden oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Prosedürler yumurta kabuğu kaldırma, hücre-hücre adezyonu bozarak blastomer izolasyonu, yapışkan polistiren boncuk hazırlanması ve hücre-hücre veya hücre-boncuk temas reconstitution içerir. Son olarak, embriyoların geliştirilmesinde uzamsal hücresel desenleme ve hücre kaderi özelliklerinin düzenlenmesine katkıda bulunan hücresel bölünme eksenlerinin yönünü araştırmak için bu yöntemin uygulanmasını saklı atıyoruz. Bu sağlam, tekrarlanabilir ve çok yönlü in vitro yöntemi uzamsal hücre temas desenleri ve hücresel yanıtlar arasındaki doğrudan ilişkilerin incelenmesini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok hücreli gelişim sırasında, tek tek hücrelerin hücresel davranışları (örneğin, bölünme ekseni) çeşitli kimyasal ve fiziksel ipuçları ile belirtilir. Tek tek hücrenin bu bilgiyi nasıl yorumladığını ve çok hücreli montajı acil bir özellik olarak nasıl düzenlediklerini anlamak morfogenez çalışmalarının nihai hedeflerinden biridir. Model organizma C. elegans hücre polaritesi gibi morfogenezin hücresel düzeyde düzenlenmesinin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur1, hücre bölünmesi desenleme1, hücre kader kararı2, ve nöronal kablolama gibi doku ölçekli düzenlemeler3 ve organogenez4,5. Çeşitli genetik araçlar mevcut olmasına rağmen, doku mühendisliği yöntemleri sınırlıdır.

C. elegans çalışmasında en başarılı doku mühendisliği yöntemi klasik blastomerizolasyonu 6; C. elegans embriyo bir yumurta kabuğu ve geçirgenlikbariyer7ile çevrili olduğu gibi, bunların kaldırılması bu yöntemin ana prosedürleri biridir. Bu blastomer izolasyon yöntemi hücre-hücre temasının basitleştirilmiş bir şekilde yeniden yapılandırılmasını sağlarken, istenmeyen ipuçlarının ortadan kaldırılmasına izin vermez; hücre teması hala hem mekanik (örneğin, yapışma) hem de kimyasal ipuçları nı oluşturur ve bu da işaret ile hücresel davranış arasındaki nedensel ilişkiyi tam olarak analiz etme yeteneğimizi sınırlandırır.

Bu yazıda sunulan yöntem, ligand olarak proteinler de dahil olmak üzere herhangi bir amin-reaktif moleküllere kovalent bağlanabilen karboksilit modifiye polistiren boncuklar kullanmalıdır. Özellikle, rhodamine Red-X'in amin-reaktif formunu kullanarak boncukları hem görsel olarak izlenebilir hem de hücreye yapıştırıcı hale getirmek için kullandık. Boncuk yüzeyi karboksil grupları ve ligand molekülünün primer amin grupları suda çözünen karbodiimid 1-etil-3-(dimethylaminoproyl) karbodiimide (EDAC)8,9ile birleştiğindedir. Elde edilen yapışkan boncuklar hücresel dinamikleri10mekanik işaret etkileri için izin verir. Hücre bölünmesi oryantasyonu10için gerekli mekanik ipuçlarını tanımlamak için bu tekniği kullandık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Yapıştırıcı polistiren boncuk hazırlanması

NOT: Bu protokol aseptik teknik gerektirmez.

  1. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpte 10 mg karboksilat modifiye polistiren boncuk ağırlığındadır.
  2. Boncukları yıkamak için, tüp içine 2-(N-morpholno)etanesulfonik asit (MES) tampon 1 mL ekleyin. MES tamponu, karbodiimidin reaktivitesini azaltabilen fosfat ve asetat içermediğinden protein kaplin reaksiyonunda kullanılması uygundur. Boncukları karıştırmak için tüpü girdap.
  3. Bir tezgah üstü santrifüj ile 2.000 x g 60 s için tüp spin.
  4. Tamponu dikkatlice dışarı borulayarak supernatant atın.
  5. 1.2-1.4 adımlarını izleyerek boncukları 1 mL MES tamponu ile tekrar yıkayın.
  6. Yüzey karboksil gruplarını etkinleştirmek için tüpe 10 mg EDAC içeren 1 mL MES tamponu ekleyin. Boncukları karıştırmak için tüpü girdap.
  7. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika döndürün ve kuluçkaya yatırın.
  8. 2.000 x g60 s için boncuk aşağı spin .
  9. Tamponu dikkatlice dışarı borulayarak supernatant atın.
  10. Boncukları yıkamak için tüpe 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Boncukları karıştırmak için tüpü girdap.
  11. 2.000 x g60 s için tüp aşağı spin .
  12. Tamponu dikkatlice dışarı borulayarak supernatant atın.
  13. 1.10-1.12 adımlarını izleyerek boncukları 1 mL PBS ile tekrar yıkayın.
  14. Rhodamine kullanılan son konsantrasyonu görüntülenecek gerginlik bağlıdır. 0,65 mM Rhodamine Red-X stok çözeltisinden 1 mL 1-, 10-, 100-ve 1000 kat seyreltme serisi Rhodamine Red-X hazırlayın.
  15. Her seri seyreltme tüpüne 20°L boncuk.
  16. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika döndürün ve kuluçkaya yatırın.
  17. 1.10-1.12 adımlarını tekrarlayarak boncukları 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  18. Tüpe 1 mL PBS ekleyin ve 4 °C'de 6 haftakadar saklayın. Canlı görüntüleme için kullanılan bir mikroskop altında boncuk floresan yoğunluğunu kontrol edin. Rhodamine Red-X succinimidyl esterinuygun konsantrasyonu görüntüleme koşullarına bağlıdır(Şekil 1).
    NOT: Rhodamine Red-X tedavisi olmayan boncuklar hücreye yapışmaz. Rhodamine Red-X floresan belirteci yanı sıra yapışkan molekül olarak hizmet vermektedir. Pozitif yüklü Rhodamine Red-X ve negatif yüklü plazma membran arasındaki elektro statik etkileşim yapışma putatif bir nedenidir.

2. Ağız pipetinin montajı

  1. Geniş (6,35 mm iç çap) ve dar (3,175 mm iç çap) Tygon tüpleri sırasıyla yaklaşık 25 cm ve 40 cm uzunluğunda kesin (Şekil 2).
  2. Tygon tüplerini politetetrafloroetilen (PTFE) filtresi (0,2 m gözenek boyutu) ile bağlayın (Şekil 2).
  3. Ticari olarak mevcut bir aspiratör tüpünü sökün ve kılcal tutucusunu ve ağızlığını sırasıyla dar ve geniş Tygon tüplerinin ucuna takın (Şekil 2).
    NOT: PTFE filtre ağız pipet yoluyla hipoklorit çözeltisi dumanı teneffüs önlemek için kullanılmıştır.

3. Embriyo blastomer izolasyonu

NOT: Beyazlatma solüsyonunun kesilmesini ve temas etmesini önlemek için eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.

  1. Mikrokapillerin (kapasite; 10 μL) her ucunu sağ ve sol el ile tutun.
  2. Mikrokapilleri her iki ucuna doğru çekin ve kılcal damarın merkezini bir brülör e doğru getirin ve iki elle çekilmiş kılcal damarlar yapın(Şekil 3A).
  3. Diseksiyon mikroskobu altında forseps ile elle çekilen kılcal damarların uçlarını kırpın ve çekilen kılcal damarı ağız borulama cihazına takın(Şekil 2). İki tür pipet hazırlayın. Pipetler için uç açma boyutları yaklaşık 2x ve 1x C. elegans embriyoların kısa eksen uzunluğu olmalıdır (30 μm) embriyo transferi ve yumurta kabuğu kaldırma için, sırasıyla Şekil 3B-D).
  4. Pipet 45 μL yumurta tuzu çözeltisi çok kuyulu bir slayt kuyusu üzerine(Şekil 4A; alt).
  5. 5-10 yetişkin C. elegans iyi yumurta tuzu çözeltisi içeren üzerine yerleştirin.
  6. Erken C. elegans embriyoları elde etmek için, C. elegans vücudunun sağına ve soluna iki iğne yerleştirerek ve iğneleri birbirinden geçirerek yetişkinleri parçalara ayırır(Şekil 4A; üst şemalar).
  7. Pipet 45 μL hipoklorit çözeltisi iyi içeren yumurta tuzu çözeltisi yanında bir kuyu üzerine(Şekil 4B).
  8. Pipet 45 μL Shelton büyüme ortamı sonraki üç kuyu üzerine kuyu içeren hipoklorit çözeltisi(Şekil 4B)yanında .
  9. 1 hücreli evre ve erken 2 hücreli evre embriyoların, embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damarile ağız borulama ile hipoklorit çözeltisine aktarılması(Şekil 4B).
  10. 40-55 s bekleyin.
  11. Embriyotransferi için elle çizilmiş kılcal damar ile ağız borulama ile shelton büyüme ortamına hipoklorit çözeltisinden embriyolar transfer ederek embriyoları yıkayın(Şekil 4B).
  12. Embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damar ile ağız borulama tarafından Shelton büyüme ortamının yeni bir kuyuiçine embriyolar aktararak tekrar embriyoları yıkayın(Şekil 4B).
  13. Yıkanmış embriyoları, embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damarla ağız borusu ile Shelton'ın büyüme ortamının yeni bir kuyusuna aktarın. Yumurta kabuğunun çıkarılması için elle çizilmiş kılcal damarı kullanarak pipetlemeyi dikkatlice tekrarlayın(Şekil 4C; orta şemalar). Yumurta kabuğu başarıyla çıkarılırsa, embriyonik hücreler daha küresel hale gelecektir(Şekil 4C; sağ).
  14. 2 hücreli evreli embriyonik blastomerleri yumurta kabuğunun çıkarılması için elle çizilmiş kılcal damarla hafifçe ve sürekli pipetleme yaparak ayırın(Şekil 4D).

4. Blastomer ve boncuk ile temas desenleri reconstitution

NOT: Bir hücrenin boncuktan ayrışmasını önlemek ve zamanında görüntü edinimi kolaylaştırmak için görüntüleme mikroskobu altında çalışın.

  1. Ters mikroskop kullanarak gözlemlemek için Şekil 5'teolduğu gibi bir görüntüleme odası hazırlayın.
    1. Kapak tutucuya bir kapak fişi yerleştirin (Şekil 5A).
    2. Sabitlemek için kapağın kenarlarını bantlayın. Bantlı yan taraf 'arka' tarafıdır (Şekil 5A,B).
    3. Kapak tutucuyu 'ön' tarafa çevirin ve hidrofobik kalemle kapak kaymasına bir daire çizin(Şekil 5C).
      NOT: Herhangi bir cam alt çanak da çalışır, embriyolar ağız pipet tarafından manipüle edilebilir sağlanan.
  2. Shelton büyüme ortamını hidrofobik marker tarafından çizilen dairenin içine ekleyin (Şekil 5D).
  3. İzole blastomeri görüntüleme odasına aktarın.
  4. Embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal kullanarak kimyasal olarak işlevsel boncuk küçük bir hacim dağıtın.
  5. Boncuk izole blastomer ekene kadar elle çizilmiş kılcal içine üfleyerek polistiren boncuk konumunu kontrol edin.
  6. Ortamın buharlaşmasını önlemek için bir kapak kayması yerleştirin (Şekil 5E). Canlı görüntüleme yapın.

5. Önemli reaktiflerin hazırlanması

  1. Yumurta Tuzu Çözeltisi (10 mL): 235 μL 5 M NaCl ve 240 μL 2 M KCl ile 9525 μL dH2O'nun birleştirilmesi.
  2. Hipoklorit Solüsyonu (10 mL): 7,5 mL Clorox (yaklaşık %7,5 sodyum hipoklorit içeren) ile 2,5 mL 10 N NaOH (son sodyum hipoklorit konsantrasyonu yaklaşık %5,625'tir) birleştirin.
    NOT: Birçok yayınlanan yöntemler kitinöz yumurta kabukları sindirmek için kitinaz kullanmış olmasına rağmen, biz hipoklorit çözeltisi11kullanarak bir yöntem benimsemiştir. Kitinaz aktivitelerinin toplu-toplu varyasyonlarından kaçınarak, bu yöntemin daha tekrarlanabilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım olduğuna inanıyoruz.
  3. 0,81 mM İnulin Çözeltisi (40 mL)
    1. DH2O 40 mL için Inulin 0.2 g ekleyin.
    2. Otoklav çözülecek.
      NOT: 4 °C'de 1 ay boyunca saklar.
  4. 0,5 M MES Tampon (500 mL)
    1. 400 mL distile suda (dH2O) 48,81 g MES çözün.
    2. pH'ı 6.0'a ayarlayın.
    3. Toplam hacmi dH2O ile 500 mL'ye getirin.
  5. PBS Çözeltisi (1 L)
    1. 10 kat PBS çözeltisi yapmak için 1 paket PBS premix tozunu 1 L dH2O'da çözün.
    2. 100 mL 10 kat PBS çözeltisini 900 mL dH2O ile birleştirin.
  6. %5 Polivinilpyrrolidone (PVP) Solüsyonu (4 mL)
    1. Steril koşullarda, Drosophila Schneider's Medium 4 mL PVP 0.2 g çözünür.
      NOT: Schneider'ın doku kültürü (TC) kaputunda her zaman Orta stokunu açın. 4 °C'de 1 ay bekletin.
  7. 0,65 mM Rhodamine Red-X stok çözeltisi (2 mL)
    1. Rhodamine Red-X 1 mg ağırlığında.
    2. Çözünmek için 2 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
    3. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
  8. Shelton Büyüme Orta (SGM) (10,25 mL)
    1. Steril koşullar altında, Drosophila Schneider'ın Orta 8 mL, PVP çözeltisi 1 mL, Inulin çözeltisi 1 mL, Bazal Orta Kartal (BME) Vitaminler1 mL, Penisilin-Streptomisin 50 μL ve Lipid konsantresi 100 μL birlikte birleştirin.
    2. Aliquot 325 μL SGM 1.5 mL mikrotüpler içine.
      NOT: 4 °C'de yaklaşık 1 ay bekletin.
    3. Blastomer izolasyongününde, SGM'ye (toplam hacmi 500°L) 175 μL Fetal Sığır Serumu (FBS) ekleyin.
      NOT: FBS'yi -20 °C'de saklayın ve kullanmadan önce eritin. FBS ısı öldürülmeye gerek yoktur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boncuk ların hazırlanması için, GFP-miyozin II ve mCherry-histon 'u ifade eden transgenik suşu için en uygun Rhodamine Red-X succinimidyl esterini belirledik (Şekil 1A-D). Hücre döngüsü ilerlemesinin bir göstergesi olarak mCherry etiketli histon kullandık. Rhodamine Red-X ve mCherry 561 nm lazer ile aydınlatılacak olduğundan, Rhodamine Red-X sinyalinin optimum yoğunluğu hücre ve boncuk eşzamanlı görüntüleme sağlamak için histon ile karşılaştırılabilir. Örneğin, 0.005 μg/mL R...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Basitleştirilmiş hücre temas kalıplarının yeniden yapılandırılması, araştırmacıların morfogenezin farklı yönlerindeki belirli hücre temas modellerinin rollerini test etmesini sağlayacaktır. Bu tekniği, hücre bölünmesi ekseninin yapışkan boncuklar 10 ile fiziksel temas tarafından kontrol altında olduğunu göstermek içinkullandık. Bölünme ekseni belirtimi morfogenez14katkıda bulunarak çok hücreli gelişim için çok önemli olduğu gibi , kök hücre bölünmesi15

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz tavsiye için James Priess ve Bruce Bowerman teşekkür ve C. elegans suşları, Don Moerman, Kota Mizumoto ve Yaşam Bilimleri Enstitüsü Görüntüleme Çekirdek Tesisi ekipman ve reaktifler, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim C. elegans bakımı ve el yazması eleştirel okuma paylaşımı için sağlayan. Çalışmalarımız Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), (RGPIN-2019-04442) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1- (3-Dimetilaminopropil) -3-etilkarbodiimid hidroklorürAlfa AesarAAA1080703Boncuk hazırlığı için
Aspiratör Tüpü TertibatıDrummond21-180-13Blastomer izolasyonu için.
Caenorhabditis elegans suşu: N2, vahşi tipCaenorhabditis Genetik MerkeziN2Bu çalışmada kullanılan suşu
Caenorhabditis elegans suşu: KSG5, genotip: zuIs45; itIs37evdeKSG5Bu çalışmada kullanılan
Edilmiş Mirkopipetler, 10 & LDrummond21-180-13Blastomer izolasyonu için
Karboksilat ile modifiye edilmiş polistiren boncuklar (30 & mikro; m çapı)KISKER BiotechPPS-30.0COOHPBoncuk hazırlama için
CD Lipid KonsantresiYaşam Teknolojileri11905031Blastomer izolasyonu için. Doku kültürü davlumbazında çalışın.
CloroxCloroxN. A.Blastomer izolasyonu için. Hipoklorit tedavisi iyi çalışmadığında yeni bir şişe açın.
Lamel tutucuEvdeN.A.Blastomer izolasyonu için.
Diseksiyon mikroskobu: M standlı Zeiss Stemi 508. Işık kaynağı dahili LED'dir. Göz merceğinin büyütme oranı 10X'tir.Carl ZeissStemi 508Blastomer izolasyonu için.
Fetal Sığır Serumu, Nitelikli Tek Atış, Kanada menşeiliGibcoA3160701Blastomer izolasyonu için. Doku kültürü davlumbazında çalışın.
Genel Kullanım ve Hassas Kayma Hipodermik İğneler, 25 gaugeBD14-826AABlastomer izolasyonu için
InulinAlfa AesarAAA1842509Blastomer izolasyonu için
MEM Vitamin Solüsyonu (100x)Gibco11120052 Blastomer izolasyonu için.
MES (İnce Beyaz Kristaller)Fisher BioReagentsBP300-100Boncuk hazırlama için
Multitest Slayt 10 KuyuMP BiyomedikalICN6041805Blastomer izolasyonu için
PBS, Fosfat Tamponlu Salin, 10 x TozFisher BioReagentsBP665-1Boncuk hazırlığı için
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15140148 blastomer izolasyonu.
PolivinilpirolidonFisher BioReagentsBP431-100Blastomer izolasyonu için
Potasyum KlorürBioshopPOC888Blastomer izolasyonu için
Rhodamine Red-X, Süksinimidil Ester, 5-izomerMoleküler ProblarR6160Boncuk hazırlığı için
Schneider ' s Drosophila Steril OrtamGibco21720024Blastomer izolasyonu için. Doku kültürü davlumbazında çalışın.
Sodyum KlorürBioshopSOD001Blastomer izolasyonu için
Sodyum Hidroksit Çözeltisi, 10 NFisher ChemicalSS255-1Blastomer izolasyonu için
Dönen disk konfokal mikroskop: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert ters çevrilmiş dürbün, Quant EM 512 kamera, 63X NA 1.4 Plan apokromat objektif lensi. Sistem Slidebook 6.0 ile kontrol edildi.Akıllı Görüntüleme İnovasyonuN.A.Canlı görüntüleme için
Şırınga Filtreleri, PTFE, Non-SterilBasix13100115Blastomer izolasyonu için.
Tygon S3 Laboratuvar Hortumu, Formülasyon E-3603, İç çap 3.175 mmSaint Gobain Performans Plastikleri89403-862Blastomer izolasyonu için.
Tygon S3 Laboratuvar Hortumu, Formülasyon E-3603, İç çap 6,35 mmSaint Gobain Performans Plastikleri89403-854Blastomer izolasyonu için.
Kalibre

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624(2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C Elegans EmbryoBlastomere IsolationPolystyrene BeadsCell Contact ReconstitutionEggshell RemovalCapillary PreparationFluorescent LabelingLive ImagingSpindle OrientationCell Division Axis

İlgili makaleler