Optogenetik Modüle Kardiyomiyosit Aktivitesinin Elektromekanik Değerlendirilmesi

Özet

Tavşan kardiyomiyositlerinde GtACR1 aktivasyonunun elektromekanik etkilerinin değerlendirilmesi için bir protokol sayılmiyoruz. Hücre izolasyonu, kültür ve adenoviral transdüksiyon ve yama-kelepçe ve karbon-fiber teknikleri ile fonksiyonel deneyler hakkında ayrıntılı bilgi salıyoruz.

Özet

Son yirmi yılda, optogenetik araçlar, kalp de dahil olmak üzere, heyecanlı dokularda hücre tipi spesifik aktiviteyi modüle etmek için güçlü bir araç olarak kurulmuştur. Channelrhodopsin-2 (ChR2) kardiyomiyositlerde (CM) membran potansiyelini depolarize etmek için yaygın bir araç iken, potansiyel olarak etki potansiyellerini ortaya çıkarmak (AP), CM aktivitesinin güvenilir susturulması için etkili bir araç eksik olmuştur. Optogenetik inhibisyon için aniyon kanalrhodopsin (ACR) kullanılması önerilmiştir. Burada, guillardia tetadan gelen doğal ACR GtACR1'in kültürlü tavşan CM'sinde aktive edilmesinin etkilerini değerlendirmek için bir protokol uyguluyoruz. Protokol, tavşan kalbinden CM izolasyonu, 4 güne kadar hücrelerin tohumlanması ve kültürünü, ışık kapılı klorür kanalı için adenovirüs kodlaması yoluyla transdüksiyonu, yama-kelepçe ve karbon fiber kurulumlarının hazırlanmasını, veri toplamayı ve analizini içerir. Tüm hücre yapılandırmasında yama kelepçesi tekniğinin kullanılması, ışıkla aktive edilmiş akımların (voltaj-kelepçe modunda, V-kelepçe modunda) ve AP'nin (akım-kelepçe modu, I-kelepçe) gerçek zamanlı olarak kaydedilmesine olanak tanır. Yama-kıskaç deneylerine ek olarak, hücre içi ortamı bozmadan CM aktivitesinin fonksiyonel değerlendirilmesi için kontraktilite ölçümleri gerçekleştiriyoruz. Bunu yapmak için, hücreler mekanik karbon lifleri kullanılarak önceden yüklenir ve kasılmalar sarcomere uzunluğu ve karbon fiber mesafesi değişiklikleri izleyerek kaydedilir. Veri analizi, I-kıskaç kayıtlarından AP süresinin, V-kelepçe kayıtlarından en yüksek akımların ve karbon fiber ölçümlerinden kuvvet hesaplamasının değerlendirilmesini içerir. Açıklanan protokol, kardiyak doku ve tüm kalplerde optogenetik deneylerin mekanistik bir anlayışının geliştirilmesi için bir ön koşul olan CM aktivitesi üzerine farklı optogenetik aktüatörlerin biyofiziksel etkilerinin test edilmesine uygulanabilir.

Giriş

CH-aracılı fotoakımlar ilk tek hücreli yeşil alg lerin göz bölgesinde kaydedildi^1,2. Chlamydomonas reinhardtii ChR1 ve ChR2'nin genetik klonlama ve heterolog ekspresyonundan kısa bir süre sonra, ChR Xenopus oositleri ve memeli hücrelerinde membran potansiyelini ışıkla değiştirmek için araç olarak kullanılmıştır^3,4. Katyon non-selektif ChR ChR ters potansiyeline negatif bir dinlenme membran potansiyeli ile hücrelerin membran depolarize. Bu nedenle, nöronlar ve CM dahil olmak üzere, optik pacing^5,6sağlayan, uyarılabilir hücrelerde AP ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Katyon ChR tamamlayıcı, ışık tahrikli proton, klorür ve sodyum pompaları^7,8,9 nöronal aktiviteyi inhibe etmek için kullanılmıştır^10,11,12. Ancak, ikincisi sınırlamalar var, yüksek ışık yoğunlukları ve sürekli aydınlatma gerektiren, bir iyon emilen foton başına taşınır gibi. 2014 yılında, Wietek ve ark. ve Berndt ve ark. tarafından yapılan iki bağımsız çalışmada, katyon iletken ChR'nin kanal gözenek^13,14'tekimutasyonlar yoluyla ACR'ye dönüştürülmesi açıklanmıştır. Bir yıl sonra, doğal ACR cryptophyte Guillardia theta keşfedildi (GtACR)¹⁵. Mühendislik ACR artık katyon iletkenlik gösterdi, onlar doğal ACR ile değiştirildi, büyük bir tek kanallı iletkenlik ve yüksek ışık hassasiyeti ile karakterize¹⁵. GtACR klorür¹⁶ters potansiyele karşı membran potansiyelini polarize ederek nöronal aktiviteyi susturmak için kullanılmıştır^17. Govorunova ve ark. kültürlü sıçan ventriküler CM GtACR1 uygulanan ve proton pompası Arch¹⁸gibi daha önce mevcut inhibisyon araçları etkinleştirmek için yeterli değildi düşük ışık yoğunluğu düzeylerinde verimli fotoinhibisyon gösterdi. Grubumuz son zamanlarda CM GtACR1 aracılı fotoinhibisyon depolarizasyon dayalı olduğunu bildirdi ve GtACR1 de kullanılabilir, bu nedenle, CM optik pacing için¹⁹.

Burada GtACR1 fotoaktivasyonunun kültürlü tavşan ventrikül CM'si üzerindeki elektrofizyolojik ve mekanik etkilerini incelemek için bir protokol sürün. Önce hücre izolasyonu, culturing ve transdüksiyonu tanımlıyoruz. Elektrofizyolojik etkiler tüm hücreli yama-kıskaç kayıtları kullanılarak ölçülür. Belirli bir membran gerilimindeki ışık aracılı akımlar V-kelepçe modunda değerlendirilir. Membran potansiyel dinamiği elektriksel veya optik pacing CM (I-kelepçe modu) sırasında ölçülür. Elektriksel olarak tetiklenen AP optik inhibisyonu sürekli ışık uygulaması kullanılarak test edilir. Mekanik etkiler sarcomere uzunluğunun görüntüleme tabanlı takibi ile birlikte karbon lifleri kullanılarak ölçülür. Bunu yapmak için, optik olarak kademeli hücreler, zıt hücre uçlarının yakınındaki plazma zarına iki karbon fiber takılarak mekanik olarak önceden yüklenir. Sarcomere uzunluk değişiklikleri optik veya elektriksel pacing sırasında kaydedilir. Son olarak, fotoinhibisyon hücrelerin elektriksel alan stimülasyonu sırasında ölçülür ve oluşturulan kuvvetler analiz edilir.

Protokol Şekil 1'dekiakış şemasında gösterilen aşağıdaki adımları içermektedir: tavşan derin anestezisi, tiopental aşırı doz enjeksiyonu, kalp eksizyonu, Langendorff perfüzyonu ve doku sindirimi, hücrelerin serbest bırakılması için dokunun mekanik ayrışması, CM veriminin mikroskobik analizi, CM'nin culturing'i, adenovirüs tip 5 ile transdüksiyon, kuluçka ve fonksiyonel deneyler takip eder.

Şekil 1: Elektriksel ve optik olarak kademeli CM elde etmek için kullanılan protokolün akış şeması. Kalpler 9-10 haftalık tavşanlardan çıkarılır ve langendorff kurulumu kullanılarak perfüzyon yapılırken kardiyak doku sindirilir. Hücreler mekanik ajitasyon ile serbest bırakılır. CM verimi mikroskop altında sayılır. CM kültürlüdür, adenovirüs tip 5 ile transdüktördür ve transdüksiyon sonrası 48-72 saat fonksiyonel deneyler yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Tüm tavşan deneyleri, Bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması na ilişkin Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/AB direktifinde belirtilen yönergelere göre gerçekleştirilmiştir ve Baden-Württemberg'deki yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, Almanya).

1. Hücre yalıtımı için çözümler

1. Aşağıdaki gereksinimlerin suyu ile hücre izolasyonu için çözümler hazırlayın(Tablo 1) ve Tablo 2'delistelenen iyonik bileşimlere göre .
   NOT: 1 M stok çözeltisinden CaCl₂ ve MgCl₂ eklenir.

	Su gereksinimleri
İletkenlik [μS/cm] 25 °C'de	0.055
Pyrogen [AB/mL]	> 0,001
Parçacık (boyut > 0,22 μm) [1/mL]	≤ 1
Toplam organik karbon [ppb]	> 5
Mikroorganizmalar [CFU/mL]	≤ 1
RNase [ng/mL]	> 0,01
DNase [ng/mL]	> 4

Tablo 1: Su gereksinimleri.

	Fizyolojik tuzlu çözelti (1)	Düşük kalsiyum, yüksek potasyum çözeltisi (2)	Enzim çözeltisi (3)	Çözüm engelleme
NaCl [mM]	137	137	137	137
KCl [mM]	4	14	14	14
HEPES [mM]	10	10	10	10
Kreatin [mM]	10	10	10	10
Taurin [mM]	20	20	20	20
Glikoz [mM]	10	10	10	10
MgCl2 [mM]	1	1	1	1
Adenozin [mM]	5	5	5	5
L-Karnitin [mM]	2	2	2	2
CaCl2 [mM]	1	-	0.1	0.1
Na-Heparin [IU/L]	5000	-	-	-
EGTA [mM]	-	0.096
Kollajenaz tip 2, 315 U/mg [g/L]	-	-	0.6	-
Proteaz XIV [g/L]	-	-	0.03	-
Sığır serum albumin [%]	-	-	-	0.5
Ozmolarite [mOsmol/L]	325 ± 5	345 ± 5	345 ± 5	345 ± 5

Tablo 2: CM yalıtımı için çözümler.

2. Tüm çözümleri 37 °C'de pH 7.4'e ayarlayın ve ozolaritiyi kontrol edin.
   NOT: Kalp eksizyonu ndan hemen önce enzimleri (Kollajenaz tip 2 ve Protaz XIV) çözün. Kullanmadan önce tüm çözeltilere oksijen verin.

2. Langendorff-perfüzyon kurulumuhazırlanması

NOT: Kullanılan kurulum özel yapımdır. Şekil 2'dede belirtildiği gibi, kurulum üç su ceketli rezervuar (1-3), bir spiral karşı akım ısı eşanjörü (4) ve su ceketli perfüzyon kabından (5) oluşmaktadır.

Şekil 2: Tavşan hücresi izolasyonu için optimize edilmiş Langendorff perfüzyon kurulumu. (1-3) (1) fizyolojik tuzlu solüsyon, (2) düşük kalsiyum, yüksek potasyum solüsyonu ve (3) enzim içeren kardiyoplejik solüsyon lu su kaplı rezervuarlar. (4) Spiral karşı akışlı ısı eşanjörü ve (5) su ceketli toplama tankı. Su ceketli sistemin girişi spiral ısı değiştiricidir (ısı eşanjörünün sonunda perfüzyon kanülünü bırakan çözeltilerin sıcaklığı 37 °C'de sabit olmalıdır), ardından perfüzyon kabı ve üç rezervuar dır. Tüm çözeltiler oksijenli (kesik çizgi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Isı değişim sisteminde 38 °C'de su sirkülasyonu yapmak için su banyosunun pompasını açın ve tüm çözümleri 37 °C'ye önceden ısıtın.
   NOT: (4) çıkışındaki sıcaklık 37 °C'de kontrol edilmeli ve sabit olmalıdır.
2. Üç rezervuarı ilgili çözeltiyle doldurun ve her satırı (siyah) ilgili çözeltiyle yıkayın. Çözeltiyi kullanarak hava kabarcıkları olmadan sonundaki ana (mavi) çizgiyi doldurun (1).
   NOT: Çözeltileri önce (10 dk) ve kullanım sırasında oksijene verin. Rezervuar (3) musluk düşük kalsiyum, yüksek potasyum çözeltisi ile hattı doldurun.
3. Kanülde aort etrafında kalp bağlamak için bir dikiş hazırlayın.

3. Hücre izolasyonu

1. Aşağıdaki şırıngaları hazırlayın.
   1. Sedasyon/anestezi için: 0.5 mL/kg vücut ağırlığı esketamine hidroklorür (25 mg/mL) ve 0.2 mL/kg vücut ağırlığı ksilazin hidroklorür (%2) karıştırın.
   2. İki şırıngayı 12 mL NaCl çözeltisi (%0,9) ile doldurun.
   3. 12.5 mg/mL Na-tiopental 6 mL hazırlayın, %0.9 NaCl çözeltisi içinde çözünmüş.
   4. 0,2 mL esketamin hidroklorür (25 mg/mL) şırınga doldurun.
   5. 0,2 mL Na-heparin (5,000 IU/mL) 1 mL 0,9 NaCl çözeltisi (son konsantrasyon 1.000 IU/mL) seyreltin.
2. Sedate / anestezi tavşan (9-10 hafta, Yeni Zelanda beyaz tavşan, kadın veya erkek, ~ 2 kg) esketamin hidroklorür ve ksilazin hidroklorür intramüsküler enjeksiyon yoluyla (adım 3.1.1).
   NOT: Tavşanların tamamen uyuşturulması için en az 10 dk gerekir; tam süresi vücut ağırlığına bağlıdır. Anesteziyi sağ refleksinin kaybıyla doğrulayın.
3. Damarların bulunduğu yeri göğüs ve kulakları tıraş edin.
4. Kulak damarına esnek bir kanül yerleştirin, bantla düzeltin ve %0,9 NaCl çözeltisi ile temizleyin.
5. 1 mL Na-heparin çözeltisini intravenöz olarak enjekte edin ve %0,9 NaCl çözeltisi ile temize çıkarın.
6. 0,2 mL esketamin hidroklorür enjekte edin, %0,9 NaCl çözeltisi ile tekrar temize atın ve apneye kadar Na-tiopental enjekte edin.
   NOT: Tavşan pedal çekme refleksine yanıt vermemelidir.
7. Sol taraftaki göğsü açın ve perikard'ı çıkarın.
8. Kalp eksire olduğunda zamanlayıcıbaşlatın ve fizyolojik tuzlu çözeltide kalbi iki kez yıkayın.
   NOT: Kardiyak dokuda kazara hasar oluşmasını önlemek için yuvarlak uçlu makas kullanın.
9. Fizyolojik tuzlu çözelti ile bir banyoda aort kanüle ve çözelti tüm doku tutmak. Langendorff perfüzyon sistemini (fizyolojik tuzlu çözelti (1), hız 24 mL/dk) açın.
10. Kalbi Langendorff-perfüzyon kurulumuna aktarın, aortu perfusate nozula bağlayın ve kalbi aort çevresindeki dikişle kanüle (< 1 dk) sıkıca bağlayın.
    NOT: Kanüliyi fizyolojik tuzlu çözeltiile önceden doldurun, kanülasyon alanından Langendorff kurulumuna taşıma sırasında kanüle hava kabarcıklarının girmemesini sağlayın, kabarcıksız bağlayın.
11. Tüm kan yıkanana kadar kalbi perfuse (2-3 dk).
12. Düşük kalsiyum, yüksek potasyum çözeltisi (2) geçiş. Kalp atandıktan sonra 2 dakika daha perfuse ve enzim çözeltisine geçin.
13. Enzim çözeltisini, sindirimin başlangıcından 2 dk sonra rezervuara geri vermeye başlayın. 5 dk sindirimden sonra hızı 16 mL/dk'ya düşürün.
14. Doku yumuşak göründüğünde (40-50 dakika sindirim), kanül kapalı kalp kesmek ve sol ventrikül ayırın.
15. Mekanik ayrışma ile serbest hücreleri (yavaşça bir pipet ve doku tutmak için ince bir forseps ile doku ayırarak) çözüm engelleme.
16. Hücre süspansiyonunu bir kafes (gözenek boyutu 1 mm²⁾ve 2 dk 2 22 x g (yerçekimi ivmesi) ile süzerem.
17. Miyosit içermeyen süpernatantı çıkarın ve engelleme çözümünde CM'yi yeniden askıya alın.

4. CM'nin Kültürünün

NOT: Steril koşullarda aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

1. Seyreltik Laminin (Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom bazal membrandan, 1 mg/mL) 1:10 steril fosfat tamponlu salin (Ca²⁺/Mg²⁺olmadan) nihai konsantrasyona 100 g/mL.
2. M199-Medium'da tablo 3'tebelirtildiği gibi eklerle kültür ortamı hazırlayın.

	M199-Medium'da hücre kültürü ortamı
Kreatin [mM]	5
L-Karnitin hidroklorür [mM]	2
Taurin [mM]	5
Na-Pyruvat [mM]	1
İnsülin (sığır pankreası) [U/L]	0.25
Sitozin-β-D-arabinofuranoside [mM]	0.01
Gentamisin [mg/mL]	0.05

Tablo 3: Hücre kültürü ortamı.

3. Steril filtre çözeltisi (0.22 μm) ve %5 Fetal Sığır Serumu ekleyin.
4. Yama-kelepçe deneyleri için otoklav kapakları ø 16 mm, kalınlığı No. 0, culturing doğrudan önce 100 μg/mL lamin ile kaplayın.
5. Karbon fiber deneyleri için Petri çanak yüzeyini poli (2-hidroksietil metakrilat) (poli-HEMA, 0.12 g/mL in 95:5 EtOH:H₂0) ile kaplayın ve katılaştırın.
   NOT: Hücreler poli-HEMA kaplı Petri kapları 'sopa' yok; bu hücre mekaniği çalışmalarında sürtünme-az daralma için çok önemlidir.
6. CM yeniden askıya sonra (~ 10-15 dk) yerleşmiş, supernatant kaldırmak ve sonra kültür ortamda CM yeniden askıya.
7. Neubauer haznesi ve tohumyoğunluğunda 17.500 hücre/mL'lik bir hedef yoğunlukta cm'yi laminin kaplı kapaklarda veya poli-HEMA kaplı Petri kaplarında sayın.
8. 37 °C'de, %5 CO_2'de 3-4 saat kuluçkaya yatırın. Kapaklı tohumlu hücrelerin orta (37 °C) değiştirin.
9. 75 enfeksiyon (MOI) bir çokluğu gtacr1-eGFP için adenovirüs (tip 5) kodlama ekleyin ve 48 saat sonra fonksiyonel deneyler başlar.
   NOT: Transdüksiyondan sonra hücreleri karanlıkta tutun. Mavi veya yeşil ışıkla aktive edilmiş proteinlerle çalışırken kırmızı aydınlatma kullanın. GtACR1-eGFP'yi adenoviral vektöre kodlayan genleri klonlamak için ticari olarak kullanılabilen bir adenoviral dağıtım sistemi (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanılır. Ilgi eklemek, burada GtACR1-eGFP, PCR güçlendirilmiş ve daha sonra bir IN-Fusion Klonlama reaksiyonu bir CMV organizatörü de dahil olmak üzere bir adenoviral vektör ile birlikte. CMV (insan sitomegalovirüs) organizatörü genellikle memeli hücrelerinde transgenlerin aşırı ekspresyonu sürücü için kullanılır. eGFP, Aequorea victoria'dan elde edilen ve maksimum 488 nm ve emisyon maksimum 507 nm olan gelişmiş yeşil floresan proteindir. Adenovirüs (tip 5) charité-universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin, Prof. Dr. Michael Schupp'ta üretildi.
   DİkKAT: Adenoviral transdüksiyon BSL-2 güvenlik seviyesi çalışması olarak sınıflandırılır ve yasal olarak uygun güvenlik önlemleri gereklidir.

5. Fonksiyonel deneyler

NOT: Kayıtlar ters floresan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilir. GtACR1'in birlikte aktivasyonunu önlemek için iletim ışığını kondansatöre kırmızı bant geçişli filtre (630/20 nm) ile filtreleyin.

1. Yama-kelepçe kurulumu
   1. Analogdan dijitale dönüştürücüile birlikte bir amplifikatör kullanın. Akım ve voltaj verilerini kaydetmek için bir veri toplama yazılımı kullanın (bkz. Malzemeler Tablosu).
      NOT: Kaydedilen veriler 10 kHz'de sayısallaştırılır ve 5 kHz'de filtrelenir.
2. Karbon fiber kurulumu
   1. Optik kontrast (karbon fiberler koyu yapılar olarak görünür, striated hücre deseni üzerine overlaid) değişiklikleri izleyerek karbon fiber konumunu ve sarcomere uzunluğu algılamak için bir kamera kullanın. Kurulumun şematik gösterimi Şekil 3'tegösterilmiştir.
      NOT: Sarcomere uzunluğu, striation deseninin güç spektrumunun hızlı Fourier dönüşümü (FFT) kullanılarak gerçek zamanlı olarak hesaplanır.

Şekil 3: Karbon fiber ölçümleri için deneysel kurulum gösteren şema. (Çizim ölçekte değildir). Bir hücreye iki karbon fiber bağlanır ve konumları bir piezo pozisyoner tarafından kontrol edilir. Pacer elektrik selülitleri için kullanılır. Çok renkli LED'ler nesne düzlemindeki hücrelerin aydınlatılmak için ters mikroskobun epifloresan portu ile birleştiğinde. LED güç, dijital analog dönüştürücünün (DAC) dijital çıkışı yla dijital darbeler alan özel bir kontrol kutusu aracılığıyla kontrol edilir. DAC, analog çıkış yoluyla floresan sistem arabirimi ile iletişim kurar. Hücresel görüntüleme için siyah-beyaz kamera (774 piksel 245 satır) sarcomere uzunluğu ve karbon fiber bükme izlemek için bilgisayara bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Zamanlı aydınlatma
   1. Floresan mikroskopisi ve ışık kapılı iyon kanallarının aktivasyonu için, farklı renkte üç LED'den oluşan harici bir özel yapım LED kontrol kutusu aracılığıyla ışık sağlayın (460 nm, 525 nm, 640 nm, bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Veri toplama yazılım protokollerinde oluşturulan harici Time to Live (TTL) darbeleri ile LED'in kontrolüne izin verecek şekilde kontrol kutusu için mikrodenetleyici ve grafik kullanıcı arabirimi (GUI) kodunu değiştirin (bkz. Malzemeler Tablosu). TTL darbeleri dijital analog dönüştürücü aracılığıyla LED kontrol kutusuna iletin.
   3. LED sürücü ve GUI üzerinden darbeler sayısını seçin. GUI komutu aldıktan sonra mikrodenetleyici yeni bir çekirdek üzerinde bir işlem başlatır. Bu süreçte Gui'den bir kontrol anahtarı seti olan TTL girişi ve kontrol anahtarı sürekli olarak kontrol edilecektir.
   4. TTL girişi pozitif olduğunda, mikrodenetleyici LED'i açar ve TTL girişini denetlemeye devam eder. TTL sinyali sıfıra döndüğünde, mikrodenetleyici LED'i kapatır ve bir kişi tarafından bırakılan darbe sayısını azaltır. Herhangi bir noktada kontrol anahtarı yanlışsa veya darbe sayısı sıfırsa, mikrodenetleyici GUI'den yeni bir komut alınana kadar bu işlemi durdurur.
   5. LED'leri doğrudan mikroskobun arka noktasına bağla.
4. Nesne düzlemindeki ışık yoğunluğunun belirlenmesi
   1. Işıklı alanı bir kademe mikrometresi ile ölçün (nesnel büyütme 40x, A = 0,8 mm^2).
   2. Optik güç ölçer kullanın (bkz. Malzemeler Tablosu).
   3. Deneyleriçin ayarları tanımlayın: uyarma dalga boyu (525 nm), nesnel büyütme (40x), uyarma filtresi (530/20 nm) veya ayna ve çeşitli LED giriş gerilimlerinde ışık gücünü [W] okuyun.
   4. Işık gücünü [W] ışıklı alana bölerek [W/mm^2]ışık yoğunluğunu hesaplayın [mm²] (burada: 0,8 mm^2).
      NOT: 10 ms'lik kısa ışık darbe süreleri ve uzun sürelerin belirlenen değeri taşıyıp tutmamalarını kontrol etmek için 5.6 adımdaki ilgili protokollerle gerçek ışık gücünü ölçün(Ek Şekil 1).
5. Yama-kıskaç deneyleri için hazırlık
   1. Aşağıdaki dış ve iç çözeltileri hazırlayın(Tablo 4; su gereksinimleri için bkz. Tablo 1).
   2. Glikozlu ozolarititi 300 ± 5 mOsmol/L' ye ayarlayın.
      NOT: Kayıt günü için iç çözeltiyi buz üzerinde tutun. Dış çözeltiyi oda sıcaklığında tutun. Burada açıklanan yama-kelepçe çözümleri daha önce kullanılan çözeltilere dayanıyordu ve Cl^- konsantrasyon daha düşük, daha fizyolojik^seviyeleredeğiştirildi 7 . İlgili optogenetik aktüatörün iyon seçiciliğinin karakterizasyonu için, ekstra ve hücre içi çözeltilerde majör iyon konsantrasyonlarını (örneğin, Cl^-, Na⁺, K⁺, H^{+ )}değiştirmenizi öneririz¹⁹.
   3. Pipet tutucudan kayıt elektrodu çıkarın ve çok ince zımpara kağıdı ile gümüş klorür tabakasını gümüş telden çıkarın.
      NOT: Bu adımı her ölçüm gününün başında yapın.
   4. Teli 1,5 V pilin pozitif direğine bağlayın ve 10 dakika boyunca gümüş klorür kaplama için 3 M KCl çözeltiye batırın.
      NOT: Negatif kutup, 3 M KCl çözeltisine batırılmış bir referans gümüş telile bağlanır.
   5. Ölçüm odasını hazırlayın: ölçüm odasının çerçevesine silikon gres koyun ve haznenin mühürlü olduğu çerçevenin üstüne bir kapak kayması (çap: 50 mm, kalınlık No. 0) yerleştirin.
   6. Banyoya bir referans gümüş/ gümüş-klorür pelet elektrot koyun ve baş sahne ile bağlayın.
   7. Çekme 1.7 - 2.5 MΩ yama pipetler soda kireç cam kılcal (dış çapı: 1,55 mm, iç çapı: 1,15 mm) bir micropipepuller ile (Malzeme Tablosubakınız).
   8. Veri toplama yazılımı başlatın ve membran testini ayarlayın (15 ms için darbe 10 mV, bazal 0 mV).

	Dış banyo solüsyonu	Dahili pipet çözeltisi
NaCl [mM]	140	-
KCl [mM]	5.4	11
CaCl2 [mM]	1	-
MgCl2 [mM]	2	2
Glikoz [mM]	10	-
HEPES [mM]	10	10
K-Aspartat [mM]	-	119
Mg-ATP [mM]	-	3
EGTA [mM]	-	10
Ph	7.4 (NaOH)	7.2 (KOH)
Ozmolarite (Glikoz ile ayarlayın) [mOsmol/L]	300 ± 5	300 ± 5

Tablo 4: Yama-kelepçe çözeltileri.

6. Yama-kelepçe ölçümleri için protokoller
   1. -74 mV tutma potansiyelinde V-kelepçe modunda fotoaktivasyon protokolünü kaydedin. 300 ms'lik ışık darbeleri kullanın.
      NOT: Kültürlü CM'nin dinlenme membran potansiyeline yakın V-kelepçe kayıtları nın (I-kelepçeile oluşturulmuş; ellerimizde -79 mV ile -77 mV arasında hem transduced hem de transduced CM¹⁹için) gerçekleştirmenizi öneririz. Yeni izole edilmiş hücreler ortalama istirahat membran potansiyeli -79 mV(Ek Şekil 2, sıvı bağlantı potansiyeli için düzeltilmeden sonra tüm değerler) gösterir.
   2. AP'yi 0 pA'da I-clamp modunda kaydedin.
      1. Elektriksel voltaat için, 10 ms'lik akım darbeleri enjekte edin (rampa dan 10 ms içinde belirlenen değere 0 pA), 0,25 Hz ve AP. Ap'yi eşikten P daha fazla enjeksiyonlarla kaydetmek için eşiği bulun.
      2. Optik pacing için güvenilir AP ortaya çıkarmak için minimum ışık yoğunluğunda 10 ms, 0,25 Hz ışık darbeleri kullanın.
   3. 0 pA'da I-clamp modunda fotoinhibisyonu kaydedin. Adım 5.6.2.1'de açıklandığı gibi AP'yi elicit ve 15 elektriksel tetiklenen AP'den sonra 4 mW/mm^2'de 64 s için sürekli ışık uygulayın.
      NOT: Şekil 6F, sürekli ışık sırasında daha yüksek akım enjeksiyonlarının uygulandığı bir fotoinhibisyon protokolü gösterir. Eşik 1,5 katından başlayarak (burada: 0,7 nA) enjekte edilen akım 0,1 nA (son seviye: 2,2 nA) adımlarında artırıldı. Tüm test akım genlikleri, sürekli ışık uygulaması AP nesil inhibe.
      1. Bir kontrol deneyi olarak, ışık uygulaması olmadan 64 s için elektriksel stimülasyon duraklatın.
7. Yama-kelepçe deneyleri
   NOT: Aşağıdaki deneyleri karanlıkta gerçekleştirin (kırmızı ışık mavi/yeşil ışıkla etkinleştirilen araçlar için kullanılabilir).
   1. Dış çözelti ile ölçüm odasına hücreleri ile coverslip yerleştirin ve floresan CM seçin.
      
8. 1. 1. 
         
      3. 
         
      4. 
         
   2. 1. 
         
      3. 
         
      5. 
         
         
   3. 
      
      3. 
         
      5. 
         
      7. 
         

1. 
   
   1. 
      
2. 1. 
      
   2. 
      
   3. 
      
   4. 
      
      

Sonuçlar

GtACR1-eGFP kültürlü tavşan CM(Şekil 6 insert) ile ifade edildi ve fotoakımlar yama-kelepçe tekniği ile ölçüldü. GtACR1 fotoaktivasyonu -74 mV'de büyük içe doğru yönlendirilmiş akımları gösterir. Şekil 6'da4 mW/mm^2'de bir tepe akımı(I _P)245 pA'dır. AP, sırasıyla 10 ms'lik kısa depolarize ışık darbeleri ile elektriksel olarak(Şekil 6B) veya optik(Şekil 6C)tetiklendi. APD değerlerini analiz eden elektriksel olarak tempolu CM, 0,24 ± 0,08 s'lik APD 20 ve 0,75 ± 0,17 s'lik BIR APD 90, optik tempolu CM 0,31 ± 0,08 s'lik BIR APD 20 ve 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2) apd 90 gösterirken, burada sunulan örnek APD 20_elektrik = 0,17 s; APD 20_optik = 0.27 s ve APD 90_elektrik = 0.61 s; APD 90_optik = 0.68 s; Şekil 6D). Optik tempolu CM daha yavaş AP başlangıcı gösterir (Şekil 6D). CM aktivasyonu, membran potansiyelini klorür ters potansiyeline doğru polarize ederek sürekli aydınlatma (64 s, 4 mW/mm²⁾üzerine inhibe edildi, burada -58 mV (Şekil 6E). Eşik 1,5 kat daha yüksek akım enjeksiyonları AP üretimi ortaya çıkarmak değil (Şekil 6F). Karbon fiber bükmeden oluşturulan tepe kuvvetleri belirlendi (Şekil 7B,C,E). CM, optik pacing(Şekil 7C)sonrasında elektriksel pacing(Şekil 7B) ve 261 μN/mm 2 232 μN/mm² üreşetilmiştir. Uzun süreli yeşil ışık darbeleri kasılmaları inhibe eder (Şekil 7E). 64 s için optik inhibisyonun ardından, tekrarlayan kasılmalar daha düşük bir kontraktil kuvvet oluşturur ve kuvvet değerleri tavşan CM'den gelen diyastolik kalsiyum kaybına uygun olarak ~10 kasılmadan (0,25 Hz, Şekil 7D'de)sonra taban çizgisine doğru gerileşir.

Şekil 6: Elektriksel ve optik tempolu/inhibe CM'nin temsili yama-kelepçe kayıtları. (A) 300 ms, 4 mW/mm²ışık darbesi ile -74 mV'de temsili fotoakım. I_P tepe akımını gösterir. Kesici uçgtacr1-eGFP pozitif hücre gösterir. (B) Temsilci AP kaydı 0 pA'da 10 ms'lik bir akım rampası kullanarak, 0.6 nA'lık bir rampa kullanarak CM. (C) Temsilci AP kaydı nı 10 ms, 0.4 mW/mm²ışık darbeleri kullanarak 0 pA'da kaydettiriniz. (D) Üst grafik, elektriksel (mavi) ve optik (yeşil) aktive CM. AP'nin 10^AP'sinin altkısmını membran potansiyelindeki maksimum değişimle (dV/dt max) hizalanmış olarak gösterir. Alt grafik optik ve elektrikle tetiklenen AP(E_optik-E_elektrik)arasındaki membran potansiyelinin farkını gösterir. (E) Elektrikle tetiklenen AP 64 s, 4 mW/mm²sürekli ışık altında inhibe edildi. (F) AP, sürekli ışık altında eşiğin 1,5 katından (0,1 nA'den 2,2 nA'ye kadar) daha yüksek akım enjeksiyonları ile inhibe edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Optik ve elektriksel olarak tempolu/inhibe CM karbon fiber kayıtlarından elde edilen temsili veriler. (A) Veri toplama yazılımında görüntülenmesi. Resim (I) sarcomere uzunluğu hesaplamak için pencere ile ölçülen CM gösterir. Hücre genişliği turuncu olarak etiketlenir. (1) İlgili frekansaralığı. (2) FFT güç spektrumu hücredeki sarcomere aralığının frekansını gösterir. Ortalama sarcomere uzunluğu en yüksek frekanstan hesaplanır. (3) Sarcomere uzunluk izleme penceresi. (4) Yoğunluk izi. (5) Hamming penceresi ile çarpılarak yapılan yoğunluk izi pencereli yoğunluk izidir. Şema (II) hücrenin eliptik kesitini gösterir. Turuncu genişlik ve kesik mavi kalınlığı. Resim (III) ilgili algılama kutuları ile karbon fiberkonumunu gösterir, kırmızı ve sağ yeşil sol. (6) Yoğunluk izi. (7) Yoğunluk izleme ilk türevi (veri toplama yazılım kılavuzuna bakın). (B) Elektriksel olarak ortaya çıkarılalı kasılmalar temsili iz. Panel (I) sarcomere uzunluğu kısalma gösterir, panel (II) iki karbon lifleri arasındaki mesafe. (C) Optik olarak ortaya konan kasılmalar (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm²⁾temsili eser. Panel (I) sarcomere uzunluğu kısalma gösterir, panel (II) iki karbon lifleri arasındaki mesafe. (D) AP neslinin inhibisyonundan kaynaklanan bir duraklamadan sonra 1'den 11'e kadar daralmadan oluşan pik kuvvet oluşturuldu. (E) Sürekli aydınlatma altında kasılmalar optik inhibisyonu temsilcisi iz (525 nm, 64 s, 6 mW/mm²). Panel (I) sarcomere uzunluğu kısaltma gösterir, panel (II) iki karbon lifleri arasındaki uzunluğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

A	Alan
Acr	aniyon kanalrhodopsin
Ap	eylem potansiyeli
Apd	eylem potansiyeli süresi
Cfu	koloni oluşturan birim
Chr	kanalrhodopsin
Cm	kardiyomiyosit
eGFP	gelişmiş yeşil floresan protein
Esd	sistolik hücre deformasyonu sona erdirmek
Ab	endotoksin üniteleri
F	Kuvvet
Fft	hızlı Fourier dönüşümü
GTACR	Guillardia teta aniyon kanalrhodopsin
Guı	grafikkullanıcı arabirimi
I-kelepçe	akım kelepçesi
ıu	uluslararası birimler
Moi	enfeksiyonun çokluğu
poli-HEMA	poli(2-hidroksitil metakrilat)
V-kelepçe	gerilim kelepçesi

Tablo 5: Kısaltmalar listesi.

Ek Şekil 1: Optik güç ölçer ile ışık yoğunluğu ölçümleri. (A) 4 mW/mm^2'de10 ms ışık darbelerinin ölçümü . (B) 4 mW/mm^2'de64 s sürekli aydınlatmaölçümü . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Taze izole CM özellikleri ve kültürde yapısal adaptasyon. (A) AP kaydı yeni izole cm (APD 20 1.11 ± 0.34 s, APD 90 1.96 ± 0.32 s, n = 7, N = 2). Ortalama istirahat membran potansiyeli -79.3 ± 0.8 mV (n = 7, N = 2). (B) Elektriksel olarak tempolu yeni izole cm. Ortalama pik kuvvet 205 ± 78 μN/mm² (n = 7, N = 2) karbon fiber kaydı. (C) Yeni izole edilmiş bir CM'nin konfokal görüntüleri (I); transdükssüz (II) ve transduced (III) CM kültürde 48 saat sonra. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Malzeme: APD ve dinlenme membranı potansiyelini belirlemek için MatLab komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Optogenetik araçlar, ekstremite hücre elektrofizyolojisinin invaziv olmayan bir şekilde modülasyonunu sağlarken, belirli bir deneysel tasarım için mevcut en iyi aracı seçmek için farklı hücre tiplerinde (örneğin, CM) ayrıntılı karakterizasyona ihtiyaç duyarlar. Yama-kelepçe tekniği hücresel elektrofizyolojiyi değerlendirmek için standart bir yöntemdir. Tüm hücre konfigürasyonunda, ışık stimülasyonu/inhibisyonu sonrasında plazma zarı boyunca foto-aktive akımları veya membran voltajındaki zamansal değişimleri kaydetmeolanağı sağlar. Elektriksel uyarma optogenetik manipülasyon da CM kasılmaları etkiler. Optik sorgulamanın miyositlerin mekanik aktivitesi üzerindeki etkilerini ölçmek için sarcomere izleme ve karbon fiber destekli kuvvet ölçümleri kullanıyoruz.

Cm'deki ışık kapılı klorür kanalı GtACR1'in temel etkilerini karakterize eden bir protokol uyguluyoruz. Model sistem olarak, elektrofizyolojik özellikleri (örneğin, AP şekli ve refrakter dönem) insan CM'sinde kemirgen CM'den daha yakından gözlenenlere benzediği için tavşan CM'yi seçtik. Ayrıca, tavşan CM birkaç gün için kültürlü olabilir, yeterince uzun adenoviral teslimat ve GtACR1-eGFP ekspresyonu için. Özellikle, izole CM hücre uçları yuvarlama ve çapraz striation kademeli kaybı da dahil olmak üzere zaman içinde kültür yapısal özelliklerini değiştirmek, T-tübüler sistem ve caveolae^23,24. Buna uygun olarak, fonksiyonel değişiklikler kültürlü CM bildirilmiştir: dinlenme membran potansiyelinin depolarizasyonu, AP'nin uzaması ve hücresel Ca²⁺ kullanımındaki değişiklikler. Kültürdeki hücresel adaptasyonların gözden geçirilmesi için lütfen Louch ve ark.^25'ebakınız. Ek Şekil 2, burada sunulan protokolü kullanarak kültürlü CM(Şekil 6, Şekil 7)gözlenenlerle karşılaştırmak için taze izole CM'nin örnek AP ve daralma ölçümlerini göstermektedir.

Tüm hücreli yama-kelepçe kayıtları, fotoakım özelliklerinin (örn. genlikler ve kinetikler) ve yüksek zamansal çözünürlükte membran potansiyelinde veya AP karakteristiklerinde ışık kaynaklı değişikliklerin doğrudan ölçümlerini sağlar. Ancak, bu tür kayıtların çeşitli sınırlamaları vardır: Birincisi, sitosol iyonik elektrokimyasal gradyanları kontrol etmek için avantajlı olan tüm hücre kayıtlarında pipet çözeltisi ile değiştirilir, ancak hücresel organeller, proteinler ve diğer bileşiklerin yıkanması içsel dezavantajı vardır, böylece potansiyel hücresel elektrik yanıtlarını etkileyen. İkinci olarak, fizyolojik olarak uzun depolarizasyondan kaynaklanan ek iyon kanallarının aktivasyonu gibi yan etkiler (örn. ışık kapılı iyon kanallarının yavaş zaman sabitleri) yöntemimiz sadece APD'deki değişiklikleri algılamaya izin verdiği nden, ancak elektrofizyolojik olarak ilgili hücre bölmelerinde iyonik konsantrasyonların doğrudan ölçümlerini yapmamak nedeniyle değerlendirmek zordur. Bu, floresan göstergeler (örneğin, Ca²⁺ sensörleri) veya iyon seçici elektrotlarla yapılabilir. Daha fazla karakterizasyon ışık yoğunluğu titrasyonları içerebilir, pH-bağımlılık belirlenmesi, farklı membran potansiyellerinde fotocurrent kinetik, ve tekrarlayan ışık stimülasyonu sırasında kurtarma kinetik.

Yama-kıskaç kayıtlarının aksine, tek hücreli kuvvet ölçümleri, hücre içi ortamlarını etkilemeden bozulmamış miyositlerin hücresel kasılmaları analizini sağlar. Iyon konsantrasyonları üzerindeki ikincil etkiler (örneğin, Ca²⁺) üretilen kuvvet genliği ve dinamiği (örn. maksimum daralma ve gevşeme hızı; burada analiz edilmez) belirlenerek dolaylı olarak değerlendirilebilir. Karbon fiber tekniği ile kuvvet ölçümleri, önceden yüklenmiş hücrelerdeki pasif ve aktif kuvvetler hakkında doğrudan bilgi sağladıkları için serbestçe daralan hücrelere göre avantajlıdır (örneğin, in situ veya in vivo ayarlarına daha çok benzeyen koşullarda). Mekanik ön yükleme özellikle hücresel kontraktür analiz ederken önemlidir, streç kuvvet üretimi ve gevşeme etkiler gibi^26,27.

Optogenetik yaklaşımlar, hem tek CM hem de sağlam kardiyak dokuda hücre zarı potansiyelinin spatiotemporal derecede hassas manipülasyonuna olanak sağlar. Klasik olarak, Hafif kapılı katyon non-selektif bir kanal olan ChR2 membran potansiyelinin depolarizasyonu için kullanılırken, membran hiperpolarizasyonu için ışık tahrikli proton ve/veya klorür pompaları kullanılmıştır. Her iki grup da optogenetik aktüatörler yüksek ekspresyon düzeyleri gerektirir, çünkü ChR2, özünde düşük tek kanallı iletkenlik²⁸ ve ışık tahrikli pompalar emilen foton başına maksimum bir iyon taşır. Ayrıca, CM ChR2 uzun süreli aktivasyonu Na yol açabilir⁺ ve / veya Ca^{2 +} aşırı, ve ışık tahrikli pompalar trans-sarcolemmal H değişebilir⁺ veya Cl^- gradyanlar^29,30. CM aktivitesinin optogenetik kontrolü için alternatif araçlar ararken, son zamanlarda chr2 gibi katyon ChR ile karşılaştırıldığında üstün bir tek kanal iletkenliği ve daha yüksek ışık hassasiyeti ile karakterize doğal anyon channelrhodopsin GtACR1 test etti. GtACR1 aktivasyonunun CM'yi depolarize ettiğini ve ışık darbesi zamanlaması ve süresine bağlı olarak optik volta ve inhibisyon için kullanılabileceğini bulduk. Katyon ChR yerine ACR kullanmanın ek bir avantajı Cl daha olumsuz ters potansiyeli olabilir^- Na⁺ile karşılaştırıldığında , yapay iyon akımları tanıtılan azaltarak. Daha önce de gösterdiğimiz gibi, GtACR1 ile optik pacing DAHA Hızlı GtACR1 mutantlar kullanılarak aşılabilir GtACR1 kanal kapatma yavaş bileşeni nin bir sonucu olarak AP uzama yol açabilir¹⁹. Ancak, AP uzaması daha düşük, daha fizyolojik hücre içi^Cl - konsantrasyonu kullanırken çok daha az belirgindir (Bkz. Şekil 6). Ayrıca, GtACR1 aracılı inhibisyonu ile uzun süreli aydınlatma sonuçları derin membran depolarizasyonu, hangi tekrar ikincil Na^aktive edebilir + ve Ca^{2 +} akını, bu nedenle voltaj kapılı kanalların etkinliğini değiştirerek. Ölçümlerimizde, AP ve kasılma parametrelerinin 1 dakika boyunca ışık kaynaklı inhibisyondan sonra 40 s içinde taban çizgisine gerildiğini görüyoruz (bkz. Kopton ve ark. 2018, Şekil 6, Şekil 7). Işık kapılı K⁺ kanalları CM dinlenme membranı potansiyelini etkilemeden CM susturma için güçlü bir alternatif sunuyoruz^31.

Gelecekte, kardiyak aktiviteyi inhibe etme potansiyelleri için farklı optogenetik araçları nicel olarak karşılaştırmak istiyoruz. Bu amaçla, ACR, ChR2 ve kırmızı-shifted ChR varyantları³²de dahil olmak üzere ışık kapılı iyon kanalları çeşitli test , yanı sıra halorhodopsin veya ışık kapılı adenylyl siklaz bPAC potasyum kanal SthK (PAC-K)³¹ile birlikte hiperpolarize aktüatörler .

Burada sunulan protokol CM elektromekanik özellikleriderinlemesine karakterizasyonu için kullanılabilir. Esas olarak diğer türlerden CM ve hastalıklı miyokardyumizole CM için de geçerlidir. Optik stimülasyon, kişinin cm'yi farklı frekanslarda hızlandırmasına olanak tanır ve karbon fiber daralma deneyleri sırasında farklı ön yükler test edilebilir. İlginç bir deney, hastalık progresyonu sırasında kardiyak doku remodeling gelişimi sırasında gözlenebilir, istirahat membran potansiyelinde kademeli artış taklit etmek, eşik altı depolarizasyon için düşük yoğunluklu aydınlatma kullanmak olacaktır. Son olarak, fonksiyonel ölçümler uyarma-daralma kaplini hakkında daha fazla bilgi edinmek için Ca²⁺ görüntüleme ile veya farklı ilaçların CM aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için farmakolojik müdahalelerle kombine edilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Equipment - Hücre izolasyonu/Kültürleme/Transdüksiyon
Adeno-X Adenoviral Sistem 3 CMV	TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, ABD
Aort kanülü	Radnoti		4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm
Lameller & oslash; 16 mm, Kalınlık No. 0	VWR International GmbH, Leuven, Belçika	631-0151	Borosilikat Cam
Griffin İpek, Siyah, 2 m Uzunluk, Boyut 3, 0,5 mm	Samuel Findings, Londra, İngiltere	TSGBL3
İnkübatörü	New Brunswick, Eppendorf, Schö nenbuch, İsviçre	Galaxy 170S
Langendorff-perfüzyon kurulumu	Zitt-Thoma Laborbedarf Glasblä serei, Freiburg, Almanya		Özel yapım
Langendorff-pump	Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zü zengin, İsviçre	ISM444
Mesh: Naylon Monodur filtre bezi	Cadisch Precision Meshes Ltd		800 & m delikler, 1 m genişliğinde
Neubauer odası	VWR International GmbH, Leuven, Belçika	717806
Tavşan, Yeni Zelanda Beyaz	Charles Nehri	Zorlanma Kodu: 052
Makas	Aesculap AG, Tuttlingen, Almanya	BC774R	Bauchdeckenschere ger. 18cm
Steril filtre, 0.22 & mikro; m	Merck, Darmstadt, Almanya	SLGP033RB
Equipment - Yama kelepçesi
Amplfier	AxonInstruments, Union City, CA, Amerika Birleşik Devletleri	Axopatch 200B
Lamel & oslash; 50 mm, Kalınlık No. 1	VWR International GmbH, Leuven, Belçika	631-0178	Borosilikat Cam
Sayısallaştırıcı Axon Digidata	Molecular Devices, San José, CA, Amerika Birleşik Devletleri	1550A Filtre
(530/20)	Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya	11513878	BZ:00
Filtre (630/20)	Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, Amerika Birleşik Devletleri	227155
Headstage	AxonInstruments, Union City, CA, Amerika Birleşik Devletleri	CV203BU
Interface	Scientifica, Uckfield, Birleşik Krallık	1U Raf, 352036
LED 525 nm	Luminus Devices, Sunnyvale, CA, Amerika Birleşik Devletleri	PT-120-G
LED kontrol yazılımı	Essel Araştırma ve Geliştirme, Toronto, Kanada
LED kontrol sistemi	ısmarlama
Mikropipet Çektirme	Narishige Co., Tokyo, Japonya	PP-830
Mikroskop ters çevrilmiş	Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya	DMI4000B
Motorlu Mikromanipülatör	Scientifica, Uckfield, Birleşik Krallık	PatchStar
Optik güç ölçer	Thorlabs, Newton, NJ, Amerika Birleşik Devletleri	PM100D
Silikon Gres	RS Bileşenleri, Corby, İngiltere	494-124
Gümüş telli	A-M Sistemleri, Sequim, WA, Amerika Birleşik Devletleri	787500	Gümüş, Çıplak 0.015 '', Kaplamalı 0.0190 '', Uzunluk 25 Feet
Soda kireç cam kılcal damarlar	Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Danimarka	160213 BRIS, ISO12772	1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm
Yazılım Axon pClamp	Molecular Devices, San José, CA, Amerika Birleşik Devletleri	Sürüm 10.5
Yazılım MatLab2017	The MathWorks, Inc.
Sahne mikrometresi	Graticules Optics LTD, Tonbridge, İngiltere	1 mm
Ekipman - Prof. Jean-Yves
fiberler		BZ:00
	Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya	11513878
Filtresi (630/20)	Chroma Teknolojisi, Bellows Falls, Vermont, Amerika Birleşik Devletleri	227155
Floresan Sistemi Arayüzü	IonOptix, Milton, MA Amerika Birleşik Devletleri	FSI-800	2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm
Kuvvet Dönüştürücü Sistemi	Aurora Scientific Inc., Ontario, Kanada	Kuvvet için 406A
Cam kılcal damarlar ölçümler	Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, Amerika Birleşik Devletleri	GC200F-10
Arayüzü Ulusal Aletler	Ulusal Enstrümanlar, Budapeşte, Macaristan	BNC-2110
LED 525 nm	Luminus Cihazları, Sunnyvale, CA, Amerika Birleşik Devletleri	PT-120-G
LED kontrol kutusu	Essel Araştırma ve Geliştirme, Toronto, Kanada
LED kontrolü sistem	ısmarlama
Mikrodenetleyici	Parallax Inc., Rocklin, California, Amerika Birleşik Devletleri	Pervane
Mikropipet Çektirme	Narishige Co., Tokyo, Japonya	PC-10
Mikroskop ters	çevrilmiş Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya	DMI4000B
MyoCam-S kamera	IonOptix, Dublin, İrlanda
MyoCam-S kamera Gücü	IonOptix, Milton, MA, Amerika Birleşik Devletleri	MCS-100
MyoPacer Alan Stimülatörü	IonOptix İşbirliği, Milton, MA, Amerika Birleşik Devletleri	MYP100
Piezo Motor	Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Almanya	E-501.00
Silikon Gres	RS Bileşenleri, Corby, İngiltere	494-124
Yazılım Axon pClamp	Molecular Devices, San José, CA, Amerika Birleşik Devletleri	Sürüm 10.5
Yazılım IonWizard	IonOptix, Dublin, İrlanda	Sürüm 6.6.10.125
Yazılım MatLab2017	The MathWorks, Inc.
Sahne mikrometresi	Graticules Optics LTD, Tonbridge, İngiltere	1 mm
Kimyasallar
Adenozin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	A9251-100G
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	A7030-50G
CaCl2	Honeywell Fluka, Muskegon, MI, ABD	21114-1L
L-Karnitin hidroklorür	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	C9500-25G
Kollajenaz tip 2, 315 U/mg	Worthington, Lakewood, NJ, ABD	LS004177
Kreatin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	C0780-50G
Sitozin-β- D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	C1768-100MG
EGTA	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya	3054.3
Esketamin hidroklorür, Ketanest S 25 mg / mL	Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Almanya	PZN-07829486
Fetal Sığır Serumu	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	F9665
Gentamisin 50 mg / mL	Gibco, Yaşam Teknolojileri, Waltham, MA, ABD	15750-037
Glikoz	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	G7021-1KG
Heparin-Sodyum, 5.000 IU / mL	Braun Melsungen AG, Melsungen, Almanya	PZN-03029843
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	H3375-1KG
İnsülin (sığır pankreas)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	I6634-50MG
K-aspartat	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	A6558-25G
KCl	VWR International GmbH, Leuven, Belçika	26764.260	1 mg / mL
KOH	Honeywell Fluka, Muskegon, MI, ABD	35113-1L
Laminin bazal membran	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	L2020-1MG
M199-Orta	Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	M4530
Mg-ATP	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	A9187-1G
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	63069-500ML
NaCl	Fisher Scientific, Loughborough, Leics., Birleşik Krallık	10428420
NaCl Çözeltisi% 0.9, İzoton Kochsalz-Lö sung 0.9	Braun Melsungen AG, Melsungen, Almanya	3200950
NaOH	AppliChem GmbH, Darmstadt, Almanya	A6579	Ca 2 + < / sup> / Mg2 + < / sup>
Na-piruvat	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	P2256-100MG
Fosfat Tamponlu Tuzlu	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	D1408-500ML
Poli (2-hidroksietil metakrilat)	Sigma, Poole, Birleşik Krallık	192066
Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri'nden	P5147-1G
Taurin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	T0625-500G
Tiyopental Inresa 0.5 g	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Almanya	PZN-11852249
Ksilazin hidroklorür, Rompun 2%	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Almanya	PZN-01320422