Sitofast ve Upstream Kümeleme Yöntemleri FlowSOM ve Cytosplore kullanılarak Yüksek Boyutlu Sitometri Verilerinin Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi

Summary

Cytofast kümeleme çıktıanaliz etmek için kullanılan bir görselleştirme aracıdır. Sitofast iki kümeleme yöntemini karşılaştırmak için kullanılabilir: FlowSOM ve Cytosplore. Sitofast hızla kütle sitometri verilerinin nicel ve nitel bir genel bakış oluşturabilir ve farklı kümeleme algoritmaları arasındaki temel farkları vurgulayabilir.

Abstract

Kitle sitometrisi tarafından üretilen verilerin karmaşıklığı, analitik sonuçları hızla görselleştirmek için yeni araçlar gerektirmiştir. Hücre kümelerinin görselleştirilmesi ve tanımlanması için Cytosplore veya FlowSOM gibi kümeleme yöntemleri kullanılır. Downstream analizi için, yeni geliştirilen R paketi, Cytofast, kümeleme yöntemleri sonuçlarının hızlı bir görselleştirme oluşturabilirsiniz. Sitofast, hücre kümelerinin henotipik karakterizasyonunu dikkate alır, hücre kümesi bolluğunu hesaplar, sonra da grupları nicel olarak karşılaştırır. Bu protokol, tümör mikroortamında bağışıklık sisteminin modülasyonuna dayalı kitle sitometri verilerinin kullanımına Sitofast uygulamalarını açıklar (yani, doğal katil [NK] hücre yanıtı) tümör sorunu üzerine immünoterapi (PD-L1 blok). FlowSOM ve Cytosplore ile Sitofast yararlılığının gösterilmesi gösterilmiştir. Sitofast hızla grup ile ilgili bağışıklık hücre kümeleri ve bağışıklık sistemi bileşimi ile korelasyon görsel temsilleri oluşturur. Kümeleme analizinde farklılıklar gözlenir, ancak gruplar arasındaki ayrım her iki kümeleme yöntemiyle de görülebilir. Sitofast, pd-L1 tedavisinin neden olduğu desenleri gösterir ve daha yüksek miktarda aktif NK hücre alt kümesini içerir ve aktivasyon belirteçlerinin (cd54 veya CD11c) daha yüksek bir yoğunluğunu ifade eder.

Introduction

Kitle sitometrisi (uçuş zamanına göre sitometri veya CyTOF) milyonlarca tek hücrede çok çeşitli hücre içi veya hücre dışı biyobelirteçlerin saptanmasını sağlar. Kitle sitometri verilerinin yüksek boyutlu doğası, MAÇA¹, FlowMaps², FlowSOM³, Phenograph⁴, VorteX⁵ve iskele haritaları⁶gibi hücre kümeleme teknikleri gibi belirli analiz araçlarını gerektirir. Buna ek olarak, çeşitli boyutsallık azaltma tabanlı teknikler geliştirilmiştir (yani, ana bileşen analizi [PCA]⁷, t-dağıtılmış stokastik komşu gömme [t-SNE]⁸, hiyerarşik stokastik komşu gömme [HSNE]⁹, tek tip manifold yaklaşım ve projeksiyon [UMAP]¹⁰, ve difüzyon haritaları¹¹) hız, yorumlama ve yüksek boyutlu veri setleri görselleştirme geliştirmek için.

Yüksek boyutlu akış ve kütle sitometrik verilerin downstream analizi genellikle küme frekansı ve klinik sonuçları ile bağlantılar üzerinde istatistiksel testler gerçekleştirmek için otomatik süreçler yoksun. Daha önce, Cytosplore veya FlowSOMtarafından kümeleme tekniklerigörsel ve nicel downstream analizleri için izin veren Cytofast¹²olarak bilinen bir R tabanlı iş akışı geliştirdi.

Burada açıklanan protokol, Cytofast'in R'de kullanımını açıklığa kavuşturdu ve nicel ve nitel ısı haritalarının ve grafiklerinin nasıl üretilebildiğini gösteriyor. Ayrıca gözlenen immün fenotipler ve klinik sonuçlar arasındaki bağlantıların belirlenmesini kolaylaştırır. Bu rapor ayrıca iki farklı kümeleme yordamı kullanarak belirli bir kitle sitometri dataset analizi açıklar: FlowSOM ve Cytosplore. Her iki kümeleme yöntemi ile Cytofast kullanılarak, buna karşılık NK hücrelerinin aktivasyon fenotip PD-L1 immün kontrol noktası blokoğu etkilenir gösterilmiştir.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri LUMC Hayvan Deneyleri Komitesi tarafından onaylandı ve Hollanda ve Avrupa komitelerinin yönergelerine uygun olarak LUMC'nin hayvan deneyleri yönergelerine uygun olarak yürütüldü.

NOT: Deneysel kurulum için C57BL/6 fareler sağ kanadında 0.3 x 10⁶ hücre/200 μL fosfat tamponlu salin (PBS) konsantrasyonunda minür kolon tümörü MC38 ile subkutan olarak aşılandı. Tümörlerin hissedilir olduğu 10 gün sonra fareler PD-L1 bloke edici antikorlarla (klon MIH-5, 200 μg/fare, intra-periton enjeksiyonu) veya sahte tedavi ile tedavi edildi. Tümörler PD-L1 enjeksiyonundan 3 gün sonra rezeke edildi, ex vivo işlendi ve CyTOF kitle sitometrisi tarafından 38 belirteç kullanılarak analiz edildi¹³.

1. Veri Analizi için Ekipman ve Yazılım

NOT: 2,4 GHz veya eşdeğeri, yüklü bellek RAM 6 GB ve 10 GB ücretsiz sabit disk alanı ile bilgisayar (Windows 7 veya daha yeni) ve işlemci I5 kullanın. R paketi Cytofast mevcut işlevleri kullanır: esas olarak flowCore, pheatmap, ve ggplot. R'de yürütülecek komut satırları protokole dahil edilir. R talimatları için kaynak https://education.rstudio.com/bulunabilir.

1. Cytofast paketini yüklemek için, R'yi (sürüm "3.6") başlatın ve aşağıdaki kodu girerek Bioconductor sürüm 3.9'u yükleyin:
   
   if (!requireNamespace("BiocManager", sessizce = TRUE))
   install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("cytofast")
2. Aşağıdakileri çalıştırarak paketin istenilen ortama yüklendiğinden emin olun:
   
   kütüphane(sitofast)

2. Kümeoluşturma

NOT: Cytosplore ve FlowSOM ile Sitofastile iki kümelenme yöntemini sergilemek için, PD-L1 tedavisinden 3 gün sonra tümör mikro ortamında NK hücreleri (CD161⁺) analiz edilir.

1. Tarafından gerçekleştirilen kümelemeCytosplore
   1. Cytosplore'uindirdikten ve yükledikten sonra , .fcs dosyalarını yükleyin (Ek Dosyalar 1.1-1.8 [Cytosplore giriş dosyaları]) Dosyayı tıklayarak | Cytosplore'daFCS Dosya(lar)'ı açın. İstendiğinde kanal olarak benzersiz örnek etiketi ekle'yi tıklatarak kanal olarak benzersiz bir örnek etiketi ekleyin ve hiperbolik arksinh dönüşümü için bir kofaktör seçin (varsayılan değer 5'tir).
   2. H-SNE Çalıştır'ıseçin, HSNE düzeyini 3 çalıştırın ve haritanın oluşturulmasını bekleyin.
      NOT: Bu adım, analiz edilen hücre sayısına ve seçilen HSNE düzeyine bağlı olarak biraz zaman gerektirebilir.
   3. İlk HSNE düzeyinde, CD161 için pozitif hücreleri kontrol edin. CD161⁺ hücreleri seçin ve seçim e doğru Yakınlaştır'asağ tıklayın. İkinci düzeyde, yalnızca CD161⁺ olayları ile üçüncü seviyeye ulaşmak için yordamı tekrarlayın.
   4. Son tSNE haritası oluşturulduktan sonra, cytosplore tarafından tanımlanan kümeleri tSNE haritasına sağ tıklayarak kaydedin ve Kümeleri Kaydet'iseçin. Cytosplore tarafından istendiği gibi çıktı dosyalarının dizini seçin ve bu konumu not edin, çünkü bu dizin daha sonra .fcs dosyalarını R'ye yüklemek için kullanılacaktır.
      NOT: Sigma değeri değiştirilerek alt küme sayısı el ile değiştirilebilir. Sigma değeri varsayılan olarak 30 olarak ayarlanır; ancak, alt kümelerin gerçek sayısı girişe bağlıdır. Burada, Cytosplore her dosya bir alt kümeyi temsil eden 10 farklı alt küme algılamıştır.
   5. Çıktı dosyalarını yeniden adlandırırken basit bir ad (yalnızca karakterler) kullanın, bu da tanımlamayı ve daha fazla işlemeyi kolaylaştırır. Kaydet'i seçerek çıktı dosyalarını kaydet.
      NOT: Kaydedilen sonra, Cytosplore tarafından .fcs dosyaları yla birlikte bir klasör oluşturuluyor ve her dosya Cytosplore'datanımlanan kümelere karşılık geliyor. Bir sonraki adım Cytofastyardımıyla R içine dosyaları yükleme olacak. Burada, oluşturulan çıktı dosyaları Ek Dosyalar 2.1-2.10 (Cytosplore çıktı dosyaları) sağlanır.
   6. Cytosplore tarafından oluşturulan çıktı dosyalarını belirlenen işlevle R'ye yükleyin: sitosploreFCS'i hazırla.
      
      dirFCS <- "C:\\Users\\username\\Desktop\\tostudy"
      cfData <- readCytosploreFCS(dir = dirFCS, colNames = "açıklama")
   7. "Zaman" ve "Arka Plan" gibi bazı parametreleri kaldırarak verileri temizleyin. Gereksiz parametreleri ile ilgili sütunun konumunu kontrol edin ve matristen çıkarın.
      
      koladları(cfData@expr)
      cfData@expr <- cfData@expr[,-c(3,4,6,8:10,46:49,51:54)]
      
      NOT: Gereksiz sütunlar oluşturulan matrisin sütun adlarını okuyarak görülebilir. Koladları(cfData@expr) bir kez daha çalıştırarak, yalnızca istenilen parametrelerin elde edilmesini sağlayın.
   8. Önce soy işaretçileri, ardından işlevsel belirteçler görüntülenecek şekilde işaretçileri yeniden sırala.
      
      cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20,
      29,40,5,30,33,11,34,14,19,
      32,28,6,7,4,12,13,17,16,15,
      21,22,24,25,26,27,38,39)]
      
      NOT: Adım 2.1.8 isteğe bağlıdır.
   9. Meta veri dosyasını, klinik bilgileri içeren elektronik tablo metadosyasını yükleyerek Cytosplore'dan oluşturulan verilere bağlayın(Ek Dosya 3).
      
      kütüphane(readxl)
      meta <- read_excel("C:\\Users\\username\\Desktop\\sample_id.xlsx")
      cfData@samples <- data.frame(meta)
      
      NOT: Cytosplore tarafından gerçekleştirilen kümeleme artık tamamlandı. Cytosplore için alternatif bir kümeleme seçeneği FlowSOM ve bölüm 2.2 açıklanmıştır. İki kümeleme adımından biri gerçekleştirildikten sonra görselleştirme adımına devam edin (bölüm 3).
2. Tarafından gerçekleştirilen kümelemeFlowSOM
   1. Aşağıdaki komutu çalıştırarak Önce R'de FlowSOM'u yükleyin:
      
      if (!requireNamespace("BiocManager", sessizce = TRUE))
      install.packages("BiocManager")
      BiocManager::install("FlowSOM")
      kütüphane (FlowSOM)
   2. FlowCore paketini benzer bir yöntem kullanarak yükleyin ve aşağıdakileri çalıştırarak ortama yükleyin:
      
      if (!requireNamespace("BiocManager", sessizce = TRUE))
      install.packages("BiocManager")
      BiocManager::install("flowCore")
      kütüphane (FlowSOM)
   3. Daha önce CD161+ olaylarında, read.flowSet işlevi ile R'de kaplanmış olan Ek Dosyalar 4.1-4.8 (FCS FlowSOM girişi) ile sağlanan ham verileri yükleyin.
      
      fcs_raw <- read.flowSet(path="C:\\Users\\username\\Desktop\\tocluster", pattern = ".fcs", transformation = FALSE, truncate_max_range = FALSE, seed=123)
   4. Aşağıdaki kodda gösterildiği gibi uygun sütunları seçerek ilgili biyolojik belirteçleri seçin ("Arka Plan" veya "Zaman") seçin ve verileri herhangi bir biyolojik işaretçiye uymayan 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51 sütunlarını kaldırın) arcsinh5 şeklinde dönüştürün. Daha önce Cytosploreile uygulandığı gibi 5 kofaktör uygulayın , aşağıdaki fonksiyonkofaktör = 5 seçerek.
      
      fcs_raw <- fsApply(fcs_raw, fonksiyon(x, cofactor=5){
      colnames(x) <- fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc
      expr <- exprs(x)
      expr <- asinh(expr[,-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,37,38,51)]/ kofaktör)
      exprs(x) <- expr
      return(x)})
   5. FlowSOM işlevini kullanarak verileri kümele. FlowSOM ve Cytosplorekarşılaştırmak için, daha önce Cytosploretarafından verilen çıktı olarak on alt kümelerde veri kümelemek için seçin.
      
      fsom <- FlowSOM(fcs_raw, transformFunction = FALSE, ölçek = FALSE,
      scaled.center = FALSE, scaled.scale = FALSE, silent = FALSE, colsToUse = c(1:37),
      nClus = 10, maxMeta = 10, önemi = NULL, tohum = 123)
      
      NOT: Bu kullanıcı tarafından el ile değiştirilebilir.
   6. Her hücreyi tanımlanan alt kümesine ve örnek kimliğine atayın.
      
      subset_id <- as.factor(fsom$FlowSOM$map$mapping[,1])
      düzeyleri(subset_id) <- fsom$metakümeleme
      baş(subset_id)
   7. Grup atamasını içeren Meta veri dosyasını (Ek Dosya 5'temevcuttur) yükleyin ve .fcs dosyalarına bağlayın.
      
      sampleid <- read_excel("C:\\Users\\username\\Desktop\\sample_id.xlsx")
      sampleid <- na.omit(sampleid)
      
      sampleid$sampleID <- as.factor(sampleid$sampleID)
      sampleid$group <- as.factor(sampleid$group)
      sampleid$CSPLR_ST <- as.factor(sampleid$CSPLR_ST)
      
      sampleid <- as.data.frame(sampleid)
      isimler(sampleid)[3] <- "sampleID"
      sampleID <- lapply(fsom$FlowSOM$metaData, function(x){rep(x[1], her = uzunluk(x[1]:x[2]))})
      attr(sampleID, 'isimler') <- NULL
      sampleID <- as.factor(unlist(sampleID))
      sampleid <- data.frame(sampleid)
      düzeyleri(sampleID) <- yapıştır("ID", 1:dim(sampleid)[1], sep="_")
      
      df <- data.frame(subset_id, sampleID, fsom$FlowSOM$data[, c(1:37)])
      yeniden adlandır <- data.frame(colpar=fcs_raw[[[1]]@parameters@data$desc)
      colnames(df) <- c("clusterID", "sampleID", rename$colpar[c(1:37)])
      df$ clusterID <- as.factor(df$ clusterID)
      df$sampleID <- as.factor(df$sampleID)
   8. Aşağıdaki komut dosyasını çalıştırarak FlowSOM'dan elde edilen veri çerçevesini temel alan bir cfList oluşturun:
      
      cfData <- cfList(numune = sampleid,
      expr = df)
   9. İşaretçilerin Cytosplore çözümlemesi çıktısına benzer şekilde görünmesini yeniden sırala.
      
      cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,34,36,37,10,23,24,31,22,
      38,15,8,3,27,9,11,28,35,26,
      14,33,17,20,21,18,25,29,13,
      30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)]
      
      NOT: FlowSOM tarafından kümeleme artık tamamlandı. Ardından, kümeleme çıktısının görselleştirmesini gerçekleştirin.

3. Görselleştirme: İşlem sonrası Kümeleme Analizi

NOT: Bu adım, her iki kümeleme yöntemiiçin de yaygın olan bir yöntemdir. Bu nedenle, FlowSOM veya Cytosploreile kümelendikten sonra yapılabilir.

1. Isı eşlemlerini oluşturmadan önce, aşağıdaki kodda gösterildiği gibi işlev hücre Counts'u kullanarak örnek başına sayım tablosunu oluşturun. Bazı kümeler diğerlerinden daha az hücre içerdiğinden, örnekler arasındaki dağılımkolayca görülebilsin diye işlev hücre Sayıları içinde "ölçek = DOĞRU" belirterek küme başına verileri ölçeklendirin.
   
   cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, ölçek = TRUE)
   
   NOT: Veriler artık görselleştirilebilir.
2. Isı haritası ile görselleştirin.
   NOT: Bu paketin ana işlevlerinden biri, oluşturulan kümelerin fenotipini ve örneklere göre heterojenliğini görselleştirmek için kullanılan sitoHeatmaps'tir.
   
   sitoHeatmaps (cfData, group="group", legend=TRUE)
3. Boxplots ile görselleştirme
   NOT: Veriler, sitoBoxplots işlevini çağırarak nicel bir şekilde temsil edilebilir. Bu işlevin çıktısı her küme için her örneklemin oranını temsil eder.
   1. Adım 3.1'de yapılan hücre sayısını oluşturun, ancak her kümenin sıklığını elde etmek için verileri ölçeklendirmeyin.
      
      cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = FALSE)
      sitoBoxplots(cfData, grup = "grup")
4. Median yoğunluklu sinyal histogramı ile görselleştirme
   NOT: Veriler ortanca yoğunluklu sinyal histogramını temsil ederek de görselleştirilebilir.
   1. CD45, CD11c ve CD54: Üç işaretleyicinin ifade yoğunluğunu görselleştirin.
   2. Aşağıdaki satırı arayarak istenen işaretçilerin adlarını denetleyin. İşaretçi adlarını not edin ve msiPlot işlevine ekleyin.
      
      isimler(cfData@expr)
      
      NOT: Burada CD45, CD11c ve CD54'e odaklanın. İşaretçilerin tam yazımını kontrol edin ve gerekirse ayarlayın:
      
      msiPlot(cfData, markers = c("89Y_CD45", "167Er_CD11c"," 164Dy_CD54"), byGroup='group')

Results

İş akışı Cytofast (Şekil 1)analiz yazılımı (örneğin, FlowSOM veya Cytosplore)tarafından kümelenmiş verilerin nicel ve nitel bir genel bakış sağlamak içindir. Sitofast, analizde tanımlanan ve işaretifadesini temel alan tüm kümelerin ısı haritası da dahil olmak üzere çeşitli olası çıktılar çalıştırAr(Şekil 2 ve Şekil 3). Üstteki dendrogram, tanımlanan kümeler arasındaki hiyerarşik benzerliği temsil eder. Üst panel, her örnekteki karşılık gelen alt kümelerin göreli miktarını gösteren başka bir ısı haritası görüntüler. Sağdaki dendrogram, örnekler arasındaki benzerliği gösterir ve örnekler arasındaki Öklid uzaklıkları üzerinde yapılan hiyerarşik kümelemeyi temel eder. Kombine ısı haritaları FlowSOM ve ardından Şekil 2'de Cytofast ve Şekil 3'te Cytofast için gösterilmiştir. Sitofast ayrıca verileri nicel olarak sunmak ve sonuçları Şekil 4 ve Şekil 5'tegösterildiği gibi boxplots (sitoBoxplots işlevini kullanarak) görüntülemek için de kullanılabilir.

Benzer kümeler iki farklı yöntem arasında bulundu (örneğin, Cytosplore'dan 8 küme FlowSOM'danküme 10'a karşılık gelir), ve PD-1 ve LAG-3 gibi bazı inhibitör belirteçlerin birlikte ekspresyonu her iki yöntemde de görülebiliyordu). Her iki kümeleme yöntemi de PD-L1 ilearasında ayrımcılığa izin verdi. PBS fareleri tedavi etti. Buna karşılık, her iki yöntem arasındaki bazı farklar vurgulanabilir. FlowSOM 2 küme (MHC-II⁺), Sitosplore ise sadece bir küme (MHC-II^+dim)gösterir tanımlar. Bunun nedeni, NK hücrelerinin CD161⁺ hücrelerde el ile kaplandığı ve daha sonra FlowSOMtarafından işlendiği ilk gating stratejisidir. Ancak, Cytosplore cd45⁺ popülasyondan hücreleri otomatik olarak ilk HSNE düzeyinde, daha sonra daha yüksek hiyerarşik düzeyde kümelenmiş olan geçit. Böylece, Cytosplore NK hücre alt kümelerini manuel gating'in CD161'e odaklanmalarından daha hassas bir şekilde tanımlamıştır. Bununla birlikte, sağdaki dendrogramda gösterildiği gibi örneklerin hiyerarşik kümelemesi korunmuş ve iki grup (PD-L1 ve PBS) arasındaki ayrımın seçilen kümeleme yöntemine bağlı olmadığını göstermiştir.

Küme sayısı her iki yöntem kullanılarak el ile tanımlanabilir. Cytofast, kullanıcının verilerinin heterojenliğini değerlendirmesini sağlar ve verilerin bölünmesi gereken küme lerin sayısını nasıl seçeceğinizi anlamanızı sağlar. Sitofast paketinde msiPlot işlevi (adım 3.4.2) gibi diğer özellikler, grup başına her işaretçinin ortanca sinyal Yoğunluğu (MSI) çizimini gösterir(Şekil 6 ve Şekil 7). Bu işlev, PD-L1 işlem görmüş grubun NK hücrelerindeki CD54 veya CD11c ifadesindeki artışlar gibi genel değişikliklerin algılanmasını sağlar. İsteğe bağlı özellikler, çubuk grafiklerde veri görüntüleme ve diğer veri gösterim yöntemleri gibi Cytofast paketine dahil edilebilir. İkincisi R tarafından oluşturulabilir ggplot araçları, eklenmesini gerektirir.

Şekil 1: Cytofast paketinin iş akışı. Veriler, immünoterapi ile tedaviden 3 gün sonra tümörden alınan kitle sitometrisi ile oluşturuldu veya tedavi edilmedi. İki farklı kümeleme tekniği karşılaştırıldı: Sitosplore ve FlowSOM. Sitofast iki teknik arasındaki farklılıkları görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Cytosplore'densonra Cytofast tarafından analiz edilen grup başına küme genel bakışı ve küme bolluğu. İmmünoterapiden 3 gün sonra (PD-L1) tanımlanan tüm NK hücre kümelerinin (Sitosploretarafından otomatik olarak tanımlanan CD161⁺ hücreler) ısı haritası. Gösterilen veriler Cytosplore kümeleme dayanmaktadır ve tedavi edilmemiş ve PD-L1 tedavi gruplarından biraraya. ArcSinh5 dönüştürülmüş ifade işaretçisi düzeyleri gökkuşağı ölçeğinde görüntülenir. Alt panelde, her numunenin göreceli bolluğu yeşil-mor ölçekle temsil edilir. Sağdaki dendrogram, alt küme frekanslarına göre örnekler arasındaki benzerliği temsil eder. Frekans ölçeği ortalamanın dağılımını temsil eder. Düşük veya yüksek frekans, sırasıyla yeşil veya mor bir renkle temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: FlowSOM'dansonra Cytofast tarafından analiz edilen grup başına küme genel bakışı ve küme bolluğu. İmmünoterapiden (PD-L1) 3 gün sonra tanımlanan tüm NK hücre kümelerinin (CD161⁺ olaylarüzerinde önceden geçitli) ısı haritası. Gösterilen veriler FlowSOM kümeleme dayanmaktadır ve işlenmemiş ve PD-L1 tedavi gruplarından biraraya toplanır. ArcSinh5 dönüştürülmüş ifade işaretçisi düzeyleri gökkuşağı ölçeğinde görüntülenir. Alt panelde, her numunenin göreceli bolluğu yeşil-mor ölçekle temsil edilir. Sağdaki dendrogram, alt küme frekanslarına göre örnekler arasındaki benzerliği temsil eder. Frekans ölçeği ortalamanın dağılımını temsil eder. Düşük veya yüksek frekans, sırasıyla yeşil veya mor bir renkle temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Cytosploretarafından tanımlanan kümelerin boxplots ile Sitofast gösterimi. Her kümenin sıklığı iki gruba (PBS ve PD-L1) ayrılmış bir kutu çiziminde temsil edilir. Tek bir nokta bir fareye karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: FlowSOMtarafından tanımlanan kümelerin boxplots ile Sitofast gösterimi. Her kümenin sıklığı iki gruba (PBS ve PD-L1) ayrılmış bir kutu çiziminde temsil edilir. Tek bir nokta bir fareye karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Sitosploretarafından otomatik olarak kapılanmış NK hücrelerinden sinyal yoğunluğu çizimlerinin dağılımı. Sinyal yoğunluklarının dağılımı üç özel belirteç için bir histogramda gösterilir: CD45, CD11c ve CD54. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: FlowSOMtarafından otomatik olarak kapılanmış NK hücrelerinden gelen sinyal yoğunluğu çizimlerinin dağılımı. Sinyal yoğunluklarının dağılımı üç özel belirteç için bir histogramda gösterilir: Cd45, CD11c ve CD54, PBS ve PD-L1 gruplarına göre ayrılmış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosyalar 1.1-1.8. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosyalar 2.1-2.10. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosya 3. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosyalar 4.1-4.8. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosya 5. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Discussion

Sitofast, tedaviye özel hücresel alt kümeleri vurgulayarak ve ölçerek sitometrik verilerin hızlı ve küresel bir şekilde araştırılmasını sağlayan hızlı bir hesaplama aracıdır. Açıklanan protokol, Cytosplore veya FlowSOMile kümeleme analizlerini daha fazla işlemeyi amaçlamaktadır. Diğer kümeleme çözümleme araçları Cytofastiçin uygundur, ancak bu bir alt kümeye her hücre atamak için Cytofast kullanımını gerektirir. Sitofast, ancak, bir kümeleme yöntemi değildir ve bu nedenle kullanmadan önce kümeleme yordamları gerektirir.

Burada yapılan analizler, tümör mikroortamındaki bazı CD161⁺ NK hücre alt kümelerinin PD-L1 blokuna duyarlı olduğunu göstermiştir. Bu durum, hem Cytosplore hem de FlowSOM kullanılarak kümelenme yöntemleri olarak gözlenen fenotip ve bolluk değişiklikleri ile kanıtlanmıştır. Her iki yöntem de ana NK hücre kümesini (CD11b⁺ NKG2A⁺) biraz farklı frekanslarda (Cytosploreiçin %15-%20, FlowSOMiçin %30-%40) ayırdı. Şekil 2 ve Şekil 3'ün sağ panellerinde görüntülenen dendrogramlar benzer sonuçlar gösterdiğinden, bolluk ve bu yaklaşımdaki farklılıklar küresel deseni etkilemedi. Bu nedenle Cytofastkullanarak PD-L1 ile tedavi edilen ve işlenmemiş fareleri NK hücre kümesi fenotip ve bolluk analizlerine dayanarak ayırmak (seçilen kümeleme yönteminden bağımsız) mümkündür.

Kaydedilen parametrelere bağlı olarak, protokolde değişiklik yapılması gerekir. Özellikle, kümeleme çözümlemesi yapılırken zaman ve arka plan gibi belirli parametrelerin kaldırılması gerekir. Buna ek olarak, her hücrenin bir alt kümeye atanması önemlidir. CfData işlevi sadece cfList içine örnek başına küme başına ham hücre sayıları ekler. Bu adımdan itibaren, sitoheatmap bölüm 3 açıklandığı gibi inşa edilebilir.

Sitofast başarıyla farklı kümeleme yöntemleri¹³karşılaştırmak için bir görselleştirme ve nicelik aracı olarak kullanılmıştır. Bu R paketi, klinik değişkenleri kullanarak küme grupları arasındaki ilişkileri test edebilen globaltest¹⁴gibi gelişmiş özelliklerle de uyumludur. Gelecekte, daha derinlemesine görselleştirme ve niceleme için en küresel araç ve diğer algoritmalar Cytofast ile entegre edilebilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bilgisayar	Dell	NA	NA