Yöntem makalesi

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

DOI:

10.3791/60548

⸱

9 Şubat 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronlar işlevlerini desteklemek için yüksek enerji için yoğun talepleri var. Aksonları boyunca bozulmuş mitokondriyal taşıma insan nöronlarında gözlenmiştir, hangi çeşitli hastalık durumlarında nörodejenerasyon katkıda bulunabilir. Canlı insan sinirlerinde mitokondriyal dinamikleri incelemek zor olsa da, bu tür paradigmalar nörodejenerasyonda mitokondrinin rolünü incelemek için kritik öneme sahiptir. Burada açıklanan insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSCs) elde edilen ön beyin nöron aksonları mitokondriyal taşıma ve mitokondriyal morfoloji analiz etmek için bir protokoldür. IPSCs iyi kurulmuş yöntemler kullanılarak telensefalik glutamaterjik nöronlar ayrılır. Nöronların Mitokondrisi MitoTracker CMXRos ile boyanmış, ve aksonlar içinde mitokondriyal hareket hücre kültürü için bir kuluçka ile donatılmış bir canlı hücre görüntüleme mikroskobu kullanılarak yakalanır. Hızlandırılmış görüntüler "MultiKymograph", "Bioformat importer" ve "Macros" eklentileri içeren yazılımlar kullanılarak analiz edilir. Mitokondriyal taşımanın mitokondriyal taşımanın miyografları oluşturulur ve anterograd ve retrograd yönlerde ortalama mitokondriyal hız kymograflardan okunur. Mitokondriyal morfoloji analizi ile ilgili olarak, mitokondriyal uzunluk, alan ve en boy oranı ImageJ kullanılarak elde edilir. Özetle, bu protokol nörodejeneratif hastalıkların çalışmalarını kolaylaştırmak için akson boyunca mitokondriyal ticaretin karakterizasyonuve morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal hareketlilik ve dağılım polarize nöronlarda değişken ve özel enerjik taleplerin karşılanmasında hayati bir rol oynamaktadır. Nöronlar, Ca2+ tamponlama ve iyon akımları için yüksek düzeyde enerji gerektiren sinapsoluşumu yoluyla hedeflerle bağlantı kurmak için son derece uzun aksonları genişletebilirler. Mitokondrinin somadan aksona taşınması nöronların aksonal ve sinaptik fonksiyonunu desteklemek için çok önemlidir. Mekansal ve zamansal dinamik mitokondriyal hareket saniyede birkaç mikrometre hızlarda hızlı aksonal taşıma ile yapılır1.

Özellikle, motor veya adaptör proteinleri, kinesin ve dinin in gibi, mitokondri hareketini kontrol etmek için mikrotübüller boyunca hızlı organel taşıma katılmak2,3. Normal nöronal aktivite, nöronal somadan distal aksona (anterograd aksonal taşıma) ve mitokondrinin distal aksondan hücre gövdesine geri geri taşınmasına (retrograd taşıma) yeni monte edilmiş mitokondrinin uygun şekilde taşınmasını gerektirir. Son çalışmalar uygunsuz mitokondriyal ayırma kuvvetle nöronal defektler ve motor nöron dejeneratif hastalıklar ile ilişkili olduğunu göstermiştir4,5. Bu nedenle, nörodejenerasyon da mitokondri rolünü incelemek için, canlı kültürlerde akson boyunca mitokondriyal hareketi incelemek için yöntemler kurmak önemlidir.

Mitokondrinin izlenmesinin incelenmesi ve analiz edilmesinde iki temel zorluk vardır: (1) her çerçevede arka plandan mitokondrinin tanımlanması ve (2) her kare arasındaki bağlantıların analiz edilmesi ve üretilmesi. İlk zorluğun çözümünde, mitokondriyi arka plandan ayırt etmek için yaygın olarak bir floresan etiketleme yaklaşımı kullanılır, örneğin MitoTracker boya veya floresan erimiş mitokondriyal hedefleme proteininin transfeksiyonu (örn. mito-GFP)6,7,8. Çerçeveler arasındaki ilişkiyi analiz etmek için, çeşitli algoritmalar ve yazılım araçları önceki çalışmalarda tanımlanmıştır9. Yakın tarihli bir makalede, araştırmacılar mitokondriyal taşımayı ölçmek için dört farklı otomatik aracı (örneğin, Volocity, Imaris, wrMTrck ve Difference Tracker) karşılaştırdılar. Sonuçlar, pist uzunluğu, mitokondriyal deplasman, hareket süresi ve hız daki farklılıklara rağmen, bu otomatik araçların tedavi sonrası taşıma farkını değerlendirmek için uygun olduğunu gösterdi10. Bu araçlara ek olarak, ImageJ için entegre bir eklenti "Makrolar" (Rietdorf ve Seitz tarafından yazılmış) yaygın mitokondriyal taşıma analiz etmek için kullanılmıştır11. Bu yöntem, hem anterograd hem de retrograd yönlerde hız da dahil olmak üzere mitokondriyal hareketi analiz etmek için kullanılabilecek kymograflar oluşturur.

Mitokondri, hem fizyolojik hem de patolojik durumlara yanıt olarak sayı ve morfolojide sürekli olarak değişen son derece dinamik organellerdir. Mitokondriyal fizyon ve füzyon mitokondriyal morfolojive homeostazı sıkı bir şekilde düzenler. Mitokondriyal fizyon ve füzyon arasındaki dengesizlik son derece kısa veya uzun mitokondriyal ağları neden olabilir, hangi mitokondriyal fonksiyon bozabilir ve anormal nöronal aktiviteler ve nörodejenerasyon neden olabilir. Bozulmuş mitokondriyal ulaşım ve morfoloji alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve kalıtsal spastik parapleji (HSP)12,13,14,15gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklar, yer almaktadır. HSP, kortikospinal sistemin dejenerasyonu ve alt ekstremite kaslarının kontrol altına alınmaması ile karakterize kalıtsal nörolojik hastalıkların heterojen bir grubudur16,17. Bu çalışmada HSP'de mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için iPSC kaynaklı ön beyin nöronlar kullanılmaktadır. Bu yöntem canlı kültürlerde nöronal aksonların mitokondriyal dinamikleri incelemek için benzersiz bir paradigma sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. IPSCs telencephalic glutamaterjik nöronların üretimi

NOT: iPSC'lerin korunması ve bunların telensefalik glutamaterjik nöronlara farklılaşması için ayrıntılı protokol daha önce18açıklananlara benzer. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinin farklılaşması sırasında kritik süreç tanıtıldı ve vurgulanır.

  1. İnsan embriyonik kök hücre (hESC) orta fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / mL) ile desteklenen fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyiciler üzerinde Kültür iPSCs.
  2. 3 dk dispase (1 mg/mL) ile kuluçkadan sonra, iPSC'leri küçük kümelere ayırın. Daha sonra, kültür iPSC 4 gün boyunca hESC ortamda süspansiyon toplar. Bu zaman noktasına bakın, iPSC'ler askıya alma kültürü olarak başlatıldığında, gün 1 (D1). 4 gün boyunca orta günlük değiştirin.
  3. D5'te, 2 dakika 2 00 x g'de santrifüj den sonra iPSC agregalarını ve nöral indüksiyon medyasında (NIM) 3 gün boyunca kültür toplayın. Kültür hücre her 2 günde bir medyanın yarısını değiştirerek 3 gün boyunca askıya toplanır. Nöral indüksiyon verimliliğini artırmak için NIM ortamına DMH-1 (2 μM) ve SB431542 (2 μM) ekleyin.
  4. D8'de, 2 000 x g'de santrifüjden sonra iPSC agregalarını toplayın ve nim'de %10 FBS (veya laminin kaplı plakalı) ile bir gecede culturing yaparak 6 kuyu plakasına (plaka başına yaklaşık 20-30 agrega) yapışmasını bekleyin. Ertesi gün, eski ortamı çıkarın ve D17'ye kadar her 2 günde bir NIM'e değiştirin.
    NOT: Bu dönemde rozet yapılı columnar hücrelerin oluşumu ile endike olan nöroepitelyal hücrelerin oluşumu gözlenmektedir.
  5. D17'de, kolonilerin merkezindeki nöroepitel hücreleri mekanik olarak izole edin (kolonilerin merkezine küçük bir basınç uygulayarak doğrudan havalanır) veya enzimatik olarak (dispase ile tedavi edilir). İzole nöroepitelyal hücreleri, B27 (1x), cAMP (1 μM) ve IGF (10 ng/mL) ilavesi ile 8 mL NIM içeren tedavi edilmeyen doku kültürü T25 şişesine aktarın.
    NOT: Süspansiyon kültürü hücrelerin kortikal projeksiyon nöral ataları ile zenginleştirilmiş nörosferler oluşturmak için izin verir.
  6. D35'ten sonra, nörosferleri poli-ornitin ve LDEV içermeyen azaltılmış büyüme faktörü bazal membran matrisi(Tablo Malzemeler) üzerine, telensefalik glutamaterjik nöronlar (kortikal projeksiyon nöronları) oluşturmak için kaplanmış 35 mm cam alt tabaklar. Kaplamadan önce, 37 °C'de 2 dakika boyunca 1 mg/mL hücre ayırma çözeltisi ile kuluçkaya yatarak nörosferleri küçük kümelere ayırın.
  7. Hücre ayırma çözeltisini santrifüj ile çıkarın ve 1 mL nöral farklılaşma ortamında (NDM) yeniden askıya alın. Cam alt çanak tabak hücreleri (çanak başına orta 100 μL yaklaşık beş kümeleri) onları takmak için. Daha sonra NDM (çanak başına 1 mL) ekleyin ve NDM'de B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) ve GDNF (10 ng/mL) içeren hücreleri kültüre geçirin.
    NOT: Küçük kümeler iyi hayatta kalır lar ve uzun projeksiyon nöronlarına yol açarlar. Alternatif olarak, hücreler ayrıştırılabilir ve daha iyi ayırma için çanak başına yaklaşık 20.000 hücre yoğunluğunda kaplanabilir.
  8. Tbr1 ve βIII-tubulin belirteçleri immünostaining ile telensefalik glutamaterjik nöronlar karakterize.

2. Telensefalik glutamaterjik nöronların aksonları boyunca mitokondriyal taşımanın incelenmesi

  1. NDM'yi ısıtın ve 37 °C ve %5 CO2olarak belirlenen floresan mikroskobu için kuvözde açın.
  2. Ön beyin nöronların aksonları boyunca mitokondriyi görselleştirmek için, ndm'deki canlı hücrelerdeki mitokondriyi (örneğin, MitoTracker CMXRos) 3 7 °C'de 3 dk boyunca lekelemek için 50 nM kırmızı floresan boya ile nöronları kuluçkaya yatırın. Daha sonra, ısıtılmış NDM ile hücreleri 2x yıkayın. Nöronlar NDM'de kuluçkaya yatmaktadır.
  3. Aksonlarla mitokondriyal taşımayı kaydetmek için, 40x hedefini floresan mikroskopla kullanarak mitokondriyal hareketin hızlandırılmış görüntülerini alın.
    NOT: Kültürü stabilize etmek için, hücreler mitokondriyal boyama sonrasında 20 dakika boyunca kuvözde kuluçkaya yatırıldığında canlı hücre görüntülemesini gerçekleştirin.
  4. Faz alanı altında, morfolojik özelliklere dayalı aksonları tanımlayın (doğrudan nöronal hücre gövdesinden ortaya, dallanma olmadan sabit ince uzun nöritler). Mitokondri anterograd hareket (hücre gövdesinden distal akson) ve retrograd yönde (aksonal terminalhücre gövdesi). Aksonları boyunca mitokondriyal hareketin yönünü ayırt etmek için, açıkça nöronların hücre organları belirlemek. Bu adımda, fotobeyaztlama azaltmak için faz alanı altında aksonları odak.
  5. Hücre gövdesi ve akson ayırt ettikten sonra, maruz kalma süresi ve akson mitokondri odak ayarlayın. Daha sonra, aksonlar içinde mitokondri taşıma yakalamak her 5 sin toplam süresi için 5 dakika, 60 kare verimli. Rastgele her yemek için en az beş konumları yakalamak ve her grup için 3x tekrarlayın.

3. Kortikal nöronlarda mitokondriyal taşıma ve morfolojiveri analizi

NOT: Bir görüntü analizi yazılımı (örneğin, ImageJ veya MetaMorph19)kullanarak mitokondriyal taşıma üzerinde toplanan verileri analiz edin. ImageJ hazır olduğundan, MultiKymographile ImageJ kullanarak mitokondriyal taşıma ve morfoloji analizi yapmak , Makrolar, ve parçacıklar eklentileri analiz.

  1. ImageJ kullanarak mitokondriyal taşıma analiz
    1. Mitokondriyal hareketliliğin hızlandırılmış görüntülerini yakaladıktan sonra MultiKymograph eklentisini kullanarak mitokondrinin hızını ve hareketini analiz edin. Görüntüler, daha önce bildirilen bir yöntem20'densonra Fiji yazılımı tarafından analiz edilen .tiff formatında dosyalar olarak kaydedilir.
    2. Fiji yazılımını indirin. Kymographs gelen mitokondriyal hareketli hızı analiz etmek için gerekli olacak eklentileri indirin. Bu dört .class eklentileri ile birlikte Bio-formatları Paketi ve Kymograph Eklentisi indirin: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class ve WalkingAverage.class (Malzeme Tablosu). Bu dosyaları Fiji eklentileri klasörüne taşıyın. Eklentiler klasörüne "tsp050706.txt" eklentilerini indirin. Dosyalar eklentiler klasörüne taşındığında Fiji yazılımını yeniden başlatın.
    3. Fiji yazılımLarını açın. Eklentileriseçin, sonra Biyo-Formatlar İthalatçı ile .tiff serisinin görüntüleri almak Bio-Formatsaltında. Stack görüntülemede Standart ImageJ'i seçtiğinizden emin olun, tüm serileri açseçeneğini seçin, Otomatik Ölçek'iişaretleyin, ardından Tamam'ıtıklatın. Görüntünün üst kısmında görüntülenen piksellerde görüntünün kare numarasına ve boyutuna dikkat edin.
      NOT: Görüntü başına 60 kare alın.
    4. Tüm 60 kare için Görüntü menüsü altında parlaklığı/kontrastı ayarlayarak görüntüleri daha net hale getirin.
    5. Parçalı çizgiyi seçmek ve hücre gövdesinden başlayıp terminal akson'da biten parçalı bir çizgi çizmek için çizgi aracını sağ tıklatın. Eklentileraltında MultipleKymograph seçerek kymograph oluşturun. ÇokLİkOlarak seçildikten sonra çizgi genişliği seçimi istenir. Bunun tek bir sayı olduğundan emin olun. Çizgi genişliği için 1'i seçin. Bu adımdan sonra bir kymograph oluşturulur.
      NOT: Kymograph'tan birkaç önemli bilgi okunabilir. Kymograph y ekseni 60 kare için süre (5 dk) süresidir. X ekseni seçili aksonun konumunu temsil eder.
    6. Mitokondrinin hareket yönünü belirlemek için mimografta çapraz bir çizgi kullanın (anterograd, retrograd veya kararlı). Örneğin, y ekseni boyunca sağa inen bir çizgi anterograd hareketini, y ekseni boyunca sola inen bir çizgi ise retrograd hareketi gösterir. Dikey bir çizgi mitokondride hareket olmadığını gösterir.
    7. Fiji yazılımındaki Makrolar eklentisini kullanarak hareketli mitokondrinin uzaklıklarını, zaman değerlerini ve hızını ölçün. Eklentilere Git | Makrolar | Yükle | tsp050607.txt. Mitokondriyal hareketin iz üzerinde parçalanmış bir çizgi çizin ve her zaman alt bölgeye (y ekseni) çizgiyi çizin.
    8. Çizgiyi çizdikten sonra Eklentiler | Makrolar | tsp gelen hızları okuyun. İzleme boyunca bölümlenmiş bir çizgi çizildiğinden, eklenti çizgiye karşılık gelen parçalı hızları okur.
      NOT: Tüm verilerin birimi pikseldir. dy toplamı başlangıç noktasından tüketilen süredir ve dx toplamı x ekseninde hareket eden mitokondrinin uzaklığı gösterir. dy şimdi ve dx şimdi sırasıyla her segment için dönem zaman ve hareket mesafesini gösterir. gerçek hız her segment için hızı gösterir (dx şimdi / dy şimdi). ortalama hız mitokondriyal hareketli (dx toplamı/dy toplamı) için ortalama hızı gösterir.
    9. Ölçek çubuğunu ölçerek dx birimini şimdi pikselden μm'ye çevirin. Görüntülerdeki ölçek çubuklarını ölçerek birimi pikselden μm'ye dönüştürün. Ölçek çubuğu boyunca bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın ve "Analiz et" altında Ölçü'üseçerek çizginin uzunluğunu ölçün. Bu denemede 1 piksel = 5 saniye olarak pikselden saniyeye kadar olan süreyi değiştirin.
    10. Elektronik tablo dosyasında, ortalama hızı hesaplayın ve buna karşılık geriye doğru veya anterograd hareketini etiketlendirin. Ortalama anterograd veya retrograd hareket hızı.
    11. Kymograph dan sabit ve hareketli mitokondri yüzdesini belirleyin. Anterograd veya retrograd hareketli mitokondri tüm periyot21boyunca kökeninden 5 μm ileri veya geri hareket olarak tanımlanır. Mitokondri, 5 dakika boyunca 5 μm'den fazla hareket etmedikleri takdirde sabit olarak kabul edilir.
  2. ImageJ kullanarak mitokondriyal morfolojianalizi
    NOT: ImageJ kullanarak mitokondriyal uzunluk, alan ve en boy oranını ölçerek mitokondriyal morfolojiyi belirleyin. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Aksoniçindeki mitokondriyal uzunluk ve alanı analiz etmek için ImageJ web sitesinden Straighten_.jar eklentisini indirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve eklentilerklasörüne taşıyın. ImageJ yazılımLarını yeniden başlatın.
    2. Dosya altındaki açık işlev aracılığıyla resmi açın ve Resimaltındaki Yazı'yı kullanarak 32 bit lik görüntüyü 8 bit'e dönüştürün.
    3. Aksonlar boyunca parçalı bir çizgi çizin. Eklentilerin altında Düzleştir'i seçin ve Filament/Geniş Çizgi Genişliğiiçin 50 piksel ayarlayın. Bu düzleştirilmiş bir akson üretecektir.
    4. Image altındaki eşiği ayarlayın ve " Alan| Çevre | Fit elips | Şekil tanımlayıcıları.
    5. Çizgi işlevini kullanarak ölçek çubuğunu ölçün ve piksel,bilme mesafesive uzunluk biriminidoldurarak Analiz altında ölçeği ayarlayın. Ardından, bu ölçek ayarını ayarlamak için Global'i seçin.
    6. Alanı belirlemek için Analyze altındaki Parçacıkları Analiz Et'i kullanın. İstem parametreleri boyut (piksel^2) = 0,20-sonsuz, dairesellik = 0,00-1,00 ve show = elipslerdir. Sonuçları Görüntüle'yiseçin.
      NOT: Ölçüm, alan, çevre, uzunluk (majör), genişlik (minör) ve en boy oranı (AR) dahil olmak üzere birden fazla mitokondriyal morfoloji parametrelerinin sonuçlarını verecektir. Karşılık gelen mitokondriyal sayı da listelenir.
    7. Aksonal uzunluğa bölünen mitokondriyal sayıyı kullanarak akson başına mitokondriyal sayıyı (μm) hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada insan iPSC'leri telensefalik glutamaterjik nöronlar olarak farklılaştırılmış, bunlar Tbr1 ve βIII tubulin belirteçleri ile immünboyama ile karakterizedir (Şekil 1A). Mitokondrinin aksonal naklini incelemek için bu hücreler kırmızı floresan boya ile boyandı ve zaman atlamalı görüntüleme yapıldı. ImageJ kolayca kullanılabilir ve elde edilmesi daha kolay olduğundan, mitokondriyal taşıma daha fazla "MultiKymograph" ve "Makrolar" ImageJ eklentileri ile analiz edildi,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, her ikisi de nörodejeneratif hastalıkaksonal dejenerasyon ve mitokondriyal morfoloji çalışma için benzersiz bir platform sağlamak kırmızı floresan boya ve ImageJ yazılımı kullanarak nöronal aksonlarda mitokondriyal taşıma ve morfoloji analiz etmek için bir yöntem açıklanır. Protokolde mitokondri boyama, canlı hücre görüntüleme ve görüntüleri analiz dahil olmak üzere çeşitli kritik adımlar vardır. Bu yöntemde mitokondriyi lekelemek için floresan boya kullanılmıştır. İnsan iPSC kaynaklı nöronlar kolayca çanak ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Spastik Parapleji Vakfı, Blazer Vakfı ve NIH (R21NS109837) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Accutase Hücre Ayırma ÇözümüYenilikçi Hücre TeknolojileriAT104
Biyogüvenlik başlığıThermo Scientific1300 SERİSİ A2
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA-7906
Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)Peprotech450-02
SantrifüjThermo ScientificSorvall Legend X1R/
LamellerChemiglass Yaşam Bilimleri1760-012
Döngüsel AMP (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
Dulbecco'nun F12 besin karışımı ile modifiye edilmiş kartal ortamı (DMEM / F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran MatrisiGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Serumsuz Takviye Edici GıdaGemini400-160
Cam Alt TabaklarMatTekP35G-0.170-14-C
9'' cam pipetlerVWR14673-043
Glial kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparinSigmaH3149
İnsülin büyüme faktörü 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Nakavt Serum İkame EdiciGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MerkaptoetanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Nörobazal ortamGibco21103-049
Esansiyel Olmayan Amino AsitlerGibco11140-050
N2 NeuroPle Serum İçermez Ek Gemini400-163
Olympus mikroskobu IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Faz kontrast mikroskobuOlympusCKX41/ IX2-SLP
6 kuyulu plakalarCorning353046
Poli-L-ornitin hidrobromür (poliornitin))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Steril 50ml Tek Kullanımlık Vakum Filtrasyon Sistemi 0.22 & mu; m Millipore Ekspresi® Plus MembranMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μ M PVDFMilliporeSCGVU10RE
Tbr1 antikoru (1:2000)ChemiconAB9616
Tripsin inhibitörüGibco17075029
50 ml tüplerPhenixSS-PH50R
15 ml tüplerPhenixSS-PH15R
T25 şişeleri (işlenmemiş)VWR10861-572
Yazılımlar için eklentiler
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji softwarehttps://fiji.sc/
Kymograph Eklentisihttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
75004261 24 kuyulu plakalar Corning 353047

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
  2. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
  3. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
  4. Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
  5. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  6. Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
  7. Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
  8. Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948(2009).
  9. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  10. Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
  11. Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
  12. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  13. Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
  14. Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
  15. Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
  16. Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
  17. Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
  18. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321(2013).
  19. Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
  20. Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
  21. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  22. Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
  23. Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
  24. Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
  25. Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
  26. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  27. Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
  28. De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
  29. Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
  30. Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
  31. Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
  32. Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
  33. Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
  34. Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
  35. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1(2016).
  36. Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
  37. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
  38. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
  39. Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitokondriyal Morfolojinsan iPSC N ronlarCanl H cre G r nt lemeKimograf AnaliziMitoTracker BoyamaAnterograd Retrograd HareketImageJ AnaliziN rodejeneratif Hastal k ModelleriAksonal Transport

İlgili makaleler