Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hava-Sıvı Arabiriminde Ekili İnsan Akciğer Hücrelerinin Açığa Çıkarılması yla Havadaki Partiküllerin Akut İnhalasyon Toksisitesinin Değerlendirilmesi

6.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60572

⸱

23 Şubat 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology, 2Walther Straub Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Munich, 3Cultex Laboratories GmbH, 4Cultex Technologies GmbH (formerly Cultex Laboratories GmbH), 5seh consulting + services

Bu makalede

Özet

Hava-sıvı arabiriminde (ALI) ekili insan akciğer hücrelerini teşhir ederek, akut pulmoner sitotoksisite ile ilgili havapartiküllerinin taranması ve izlenmesi için sağlam, aktarılabilir ve tahmine dayalı bir in vitro maruziyet sistemi salıyoruz.

Özet

Burada, ALI'de ekili insan akciğer hücrelerinin gazlara, partiküllere veya karmaşık atmosferlere (örn. sigara dumanı) homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan özel olarak tasarlanmış modüler in vitro maruziyet sistemi sunarak gerçekçi fizyolojik insan alveolar bölgenin apikal yüzeyinin havaya maruz kalma. Lineer aerosol kılavuzlu sıralı pozlama modellerinin aksine, radyal akış sisteminin modüler tasarımı, test atmosferinin hücrelere sürekli üretimi ve taşınması için tüm gereksinimleri karşılar, homojen bir dağılım ve parçacıklar ve atmosferin sürekli kaldırılması. Bu maruz kalma yöntemi öncelikle havadaki parçacıklara hücrelerin maruz kalma için tasarlanmıştır, ancak aerosol üretim yöntemi ve maruziyet modüllerinin malzeme bağlı olarak sıvı aerosoller ve son derece toksik ve agresif gazların maruz kalma adapte edilebilir .

Yakın zamanda tamamlanan bir doğrulama çalışması çerçevesinde, bu maruziyet sistemi, havadaki parçacıkların akut pulmoner sitotoksisitesinin nitel değerlendirmesi için aktarılabilir, tekrarlanabilir ve öngörülebilir bir tarama yöntemi olarak kanıtlanmıştır, böylece normalde bu toksikolojik değerlendirmeyi sağlayacak hayvan deneylerini potansiyel olarak azaltmak veya değiştirmek.

Giriş

Toksik havadan bulaşan parçacıkların solunması bir halk sağlığı sorunudur, dünya çapında sağlık riskleri çok sayıda yol ve ölümler milyonlarca yıllık1,2. İklim değişikliği, devam eden endüstriyel gelişme ve artan enerji talebi, tarım ve tüketici ürünleri son yıllarda akciğer hastalıklarının artmasına katkıda bulunmuştur3,4,5,6. Bilgi ve akut inhalasyon toksisitesi ile ilgili solunabilir maddelerin değerlendirilmesi tehlike değerlendirmesi ve risk yönetimi için temel sağlamak, ancak bu bilgiler hala bu maddelerin geniş bir yelpazede için eksik7,8. 2006 yılından bu yana, AB kimyasal mevzuatı REACH (Kimyasalların Kaydı, Değerlendirilmesi, Yetkilendirilmesi ve Kısıtlanması) mevcut ve yeni tanıtılan ürünlerin piyasaya sürülmeden önce soluma rotası da dahil olmak üzere toksikolojik bir karakterizasyondan geçmesini gerektirmektedir. Bu nedenle REACH, alternatif ve hayvansız yöntemlere, "3R" prensibinin uygulanmasına (Hayvan deneylerinin değiştirilmesi, İncelmesi ve azaltılması) ve uygun in vitro modellerin in vitro modellerinin kullanımına odaklanmaktadır9. Son yıllarda, birçok farklı ve yeterli hayvan dışı inhalasyon toksisite testi modelleri (örneğin, in vitro hücre kültürleri, akciğer-on-a-chip modelleri, hassas kesilmiş akciğer dilimleri (PCLS)) amacıyla hava daki parçacıkların akut inhalasyon toksisitesi değerlendirmek için geliştirilmiştir5,7,10,11. In vitro hücre kültürü modelleri açısından, ekili hücreler batık koşullarda veya ALI'de maruz kalınabilir (Şekil 1). Ancak, batık maruziyet çalışmalarının geçerliliği, özellikle partiküllerin havadaki bileşiklerin toksisitesinin değerlendirilmesi açısından sınırlıdır. Batık maruzkalma teknikleri in vivo durumuna karşılık gelmez; hücreleri kapsayan hücre kültürü orta fiziko-kimyasal özellikleri etkileyebilir ve böylece, bir test maddesinin toksik özellikleri12,13. ALI in vitro inhalasyon modelleri test parçacıkları ile hücre kültürü ortamının müdahalesi olmadan test maddeleri hücrelerin doğrudan maruz kalma sağlar, böylece, batık pozlama daha yüksek fizyolojik ve biyolojik benzerlik ile insan maruziyeti taklit12,14.

REACH gibi düzenleyici işlemler için, ancak, sadece hayvan modelleri akut inhalasyon toksikoloji alanında mevcuttur, hiçbir alternatif in vitro yöntemleri yeterince doğrulanmış ve resmen şimdiye kadar kabul edilmiştir14. Bu amaçla test modellerinin, test geçerliliğine ilişkin Hayvan TestleriNe Alternatifler Için Avrupa Birliği Referans Laboratuvarı (EURL-ECVAM) ilkelerinin gereklerine göre doğrulanması gerekir15.

Eski bir ön doğrulama çalışması ve yakın zamanda tamamlanan bir doğrulama çalışması cultex RFS maruz kalma sisteminin uygulama alanını ve aktarılabilirliğini, stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini başarıyla göstermiştir13. Bu maruz kalma sistemi, radyal aerosol dağılım konsepti ve test aerosolünün hücreler üzerinde sürekli bir akış halinde iletimi nedeniyle ALI'de hücrelerin gazlara, partiküllere veya karmaşık atmosferlere (örn. sigara dumanı) homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan in vitro hücre tabanlı bir maruz kalma sistemidir16. Bu radyal akış sisteminin temel modülü giriş adaptörü, radyal aerosol dağılımına sahip aerosol kılavuz modülü, numune alma ve soket modülü ve el tekerleği ile kilitleme modülünden oluşur (Şekil 2). Oluşturulan parçacıklar giriş adaptörü ve aerosol kılavuz modülü aracılığıyla hücrelere ulaşır ve örnekleme modülünün radyal olarak düzenlenmiş üç pozlama odasında bulunan hücre kültürü kesici uçlarda birikir. Aerosol kılavuz modülü ve örnekleme modülü harici bir su banyosuna bağlanarak ısıtılabilir17.

Her iki çalışma çerçevesinde tüm maruzkalma deneyleri için A549 hücreleri kullanılmıştır. Hücre hattı A549 çok iyi karakterize ve çok sayıda toksikolojik çalışmalarda tip II alveoler epitel hücreleri için bir in vitro model olarak kullanılmıştır bir insan ölümsüzleştirilmiş epitel hücre hattıdır. Hücreler lamellar cisimler ile karakterizedir, sürfaktan üretimi ve inflamasyon ile ilgili faktörlerin bir dizi18. Ayrıca mukus üretimi nedeniyle bronşiyal epitel hücrelerinin özelliklerini göstermek19. Ayrıca, ONLAR ALI kültürlü olabilir. Bu hücre hattı hücre-hücre temasları bina eksik olmasına rağmen, bu hücrelerin ekimi çok daha uygun, daha az maliyet pahalı ve bunların elde edilen sonuçlar birincil hücrelere göre donör bağımsız20.

A549 hücreleri 6 kuyulu hücre kültürü kesici uçlarda (PET membran, 4.67 cm2, gözenek boyutu 0.4 mm) seri başı 3.0 x 105 hücre yoğunluğu ile tohumlanmış ve batık koşullarda 24 saat ekili olarak eklenmiştir. Hücreler daha sonra havayı temizlemek için üç bağımsız laboratuvarda maruz kaldı ve ALI'de 20 test maddesinden üç farklı maruz kalma dozu (25, 50 ve 100 μg/cm2)alındı. Pozlama dozu, sırasıyla 15, 30 veya 60 dakika sonra hücrelere 25 g/cm2,50 μg/cm2 ve 100 g/cm2 sabit partikül oranı ile sonuçlanan biriktirme süresi ile ilişkilidir. Ancak biriken parçacıklar birikmeden sonra yıkanmamış, ancak 24 saat boyunca hücrelerde kalmıştır. Bu nedenle parçacıkların biriktirme süreleri 15, 30 ve 60 dk idi, ancak hücrelerin maruz kalma toplam 24 saat sürdü. Test maddelerinin biriktirme oranı önceki yöntemlere göre ön deneylerdebelirlenmiştir 17.

Toksisitenin bir göstergesi olarak hücre canlılığı, hücre canlılığı tsayı kullanılarak parçacık birikiminden 24 saat sonra değerlendirildi. Temiz hava kontrollerinin kalitesi, maruz kalma protokolünün optimizasyonu ve iyileştirilmesi, laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik ve bir tahmin modelinin (PM) oluşturulması üzerine özel bir odak noktası kurulmuştur. Hücre canlılığının %50'nin altına düşmesine yol açan maddeler (PM %50) veya %75 (PM %75) herhangi üç maruz kalma dozlarında akut inhalasyon tehlikesi uygulamak için kabul edildi. Sonuçlar daha sonra mevcut in vivo verileri ile karşılaştırıldı (OECD test kılavuzuna göre en az bir güvenilir çalışma dayalı (TG) 403 veya TG 43621,22), genel bir uyum yol 85%, bir özgüllük ile 83% ve 88%23duyarlılık .

Hücre canlılığının ölçülmesinin yanı sıra, sitokin salınımı, ldh tetkik yoluyla hücre lisatının incelenmesi veya membran bütünlüğünün incelenmesi gibi diğer uç noktalar değerlendirilebilir ancak doğrulama çalışması için gerekli değildir. Böylece, maruz kalma sistemi (örneğin, CULTEX RFS) test edilen hava partiküllerinin akut inhalasyon toksisitesinin nitel değerlendirilmesi için bir tahmine dayalı tarama sistemi olarak kanıtlanmıştır, hayvan testleri için umut verici bir alternatif yöntem temsil. Bu pozlama sistemini kullanarak havadaki parçacıklara maruz kalma deneyleri için aşağıdaki protokol önerilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bir pozlama deneyinin protokolü üç günlük bir dönemi kapsar.

1. Gün

1. Genel hazırlıklar ve hücrelerin ekimi

NOT: Maruz kalma deneyleri için insan akciğer adenokarsinomu epitel hücre hattı A549 kullanılmıştır. Hücreler steril koşullarda ele alınmalıdır. ALI'de ekime uygun diğer hücre hatları kullanılabilir.

  1. Büyüme ortamını (Dulbecco'nun Minimum Esansiyel Orta (DMEM), %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 5 μg/mL gentamisin ile birlikte (DMEM, 5 μg/mL gentamisin ve 100 mM nihai HEPES konsantrasyonu ile desteklenmiş) hazırlayın.
  2. Kültür A549 hücreleri büyüme ortamında 37 °C'de %5 CO2içeren nemli bir atmosferde .
  3. Hücre kültürü şişesinde hücreleri 75 cm2 (T-75) 14 mL büyüme ortamında, bölmeden önce %80-90'lık bir kesişme (her 2-3 günde bir) ve 35'lik bir geçişe kadar geliştirin.
  4. Süspansiyon hacmini ve gerekli hücre kültürü uçlarının sayısını (kuvöz kontrolleri ve temiz hava ve parçacık maruziyeti için hücre kültürü ekler gibi üç hücre kültürü ekler) ve hücre kültürü plakaları hesaplayın.
  5. Hücrelerin trypsinizasyonu ve tohumlama önce, 6-iyi plaka her kuyuya temperli büyüme orta 2.5 mL ekleyin. Hücre kültürünü, hücre içermeyen eklerin kuyuların içine dikkatlice yerleştirin ve her hücre kültürü eklemesine 1 mL büyüme ortamı ekleyin. 6 kuyulu plakaları en az 30 dakika kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO2)kuluçkaya yatırın.

2. Hücrelerin tripsinizasyonu

  1. Temper fosfat tamponlu salin (PBS) ve büyüme ortamı 37 °C ve tripsin/EDTA (%0.05/ 0.02%) oda sıcaklığında çözelti.
  2. Hücre kültürü ortamını hücre kültürü şişesinden aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış 8 mL'lik PBS ile dikkatlice yıkayın.
  3. PBS'yi çıkarın, 2 mL tripsin/EDTA ekleyin (%0.05/ 0.02%) hücrelere çözelti ve 37 °C'de kuvözde maksimal 6 dk. için kuluçka. Müfreze işlemini mikroskop altında kontrol edin.
  4. 8 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini nötralize edin, şişenin yan tarafına hafifçe dokunarak hücreleri ayırın ve tekrar tekrar pipetleme yaparak hücreleri yeniden askıya alın.
  5. Hücre süspansiyonuna 50 mL boru aktarın. Daha fazla işlem için hücre numarasını belirleyin (örn. hücrelerin tohumlanması, hücrelerin geçişi).

3. Hücre sayısının belirlenmesi

NOT: Hücre konsantrasyonu hücre sayacı veya sayma odaları kullanılarak belirlendi.

  1. 10 mL izotonik çözelti ile dolu bir bardakta hücre kültürünün süspansiyonunun 100 μL'sini seyreltin. Sallamadan bardağı yavaşça yatırın.
  2. A549 hücrelerinin hücreye özgü ölçüm parametrelerine göre canlı hücre/mL ve hücre canlılığı sayısını belirleyin.

4. Hücre kültürü ekler mikro gözenekli membranlar üzerine hücrelerin tohumlanması

NOT: Pozlama sistemi, farklı tedarikçilerden ve farklı boyutlardaki ticari kesici uçların kullanımını mümkün kılacak özel adaptörlerle donatılmıştır. Bu pozlama deneyleri için 6 kuyulu plakalar ve buna karşılık gelen hücre kültürü kesici uçlar kullanılmıştır. Tüm çalışma adımları steril koşullarda yapılmalıdır.

  1. Steril hücre kültürü koşulları (laminar akış) altında önceden ısıtılmış büyüme ortamı sağlayın.
  2. Hücre süspansiyonunun yeterince yüksek hacmini 3.0 x 105 hücre/mL'lik bir hücre konsantrasyonu ile hazırlayın.
  3. Plakaları 30 dk yumuşattıktan sonra, hücre kültürü içinde orta aspirasyon ekler ve her hücre kültürü eklemek 3.0 x 105 hücre /mL yoğunluğu ile A549 hücrelerinin 1 mL tohum. Hücre süspansiyonuna hafifçe sallayarak dağıtın.
  4. Hücre kültürünü 24 saat (37 °C ve %5 CO2)için hücre süspansiyonu ile inkübed.

5. Test maddelerinin basıldığında

NOT: Test maddeleri tamamen kontrol edilebilir bir hidrolik pres kullanılarak toz kekiçine bastırıldı. Basın paketi, basın paketinin mevcut yağ basıncı (çubuk) olarak görüntülenen maksimum 18 kN kuvvet uygulayabilir. Bilinmeyen test maddelerinin pres koşulları (presleme basıncı, presleme süresi) ön testlerde belirlenmeli ve karakterize edilmelidir. Bir maddenin pres özelliklerine bağlı olarak farklı presleme parametreleri ve presleme pistonu çeşitleri kullanılabilir.

DİkKAT: Zehirli veya tehlikeli maddeleri bastırırken koruyucu ekipman takın.

  1. Basının ön tarafındaki zaman kontrolü ile basma süresini ayarlayın.
  2. Basınçlı hava vanası ile basınçlı hava beslemesini açın. Basınçlı hava basıncını, presin ön tarafındaki basınç regülatörü veya basınçlı hava beslemesinin basınçlı hava vanası kullanarak yaklaşık 2 bara (ön taraftaki basınç göstergesiyle gösterilir) ayarlayın. Çekmeceyi çekin, Basın düğmesine basın ve dijital basınç düğmesine basma basıncını okuyun.
    1. Basınç çok yüksek veya çok düşükse basınç regülatöründeki basıncı okuyun.
  3. Madde kabını toplayın ve cam silindirin doğru ortalanmasını sağlayın (Ek Şekil 1). Madde kabını az miktarda test maddesi ile doldurun. Dalgıç madde kabına yerleştirin ve tozu konteynerde eşit olarak dağıtmak için hafifçe ileri geri çevirin.
  4. Çekmeceye dalgıç ile madde konteyner yerleştirin ve Basın düğmesine basın. Presin hidrolik pistonu pistonunüzerine hareket eder ve set presleme süresi için test maddesine basınç uygular. Çekmeceyi açın ve pistonu çıkarın.
  5. Madde kabı en az yarısı dolana kadar 5.3 ve 5.4 adımlarını tekrarlayın.
  6. Presleme çalışması tamamlandıktan sonra, çekmeceden madde konteyner çıkarın ve gevşek ve birikmiş parçacıkları kaldırmak için baş aşağı çevirin.
  7. Madde kabına aynı gün gerekli değilse, test maddesinin kurumasını veya nemi emmesini önlemek için madde kabını parafilm ile kapatın.

2. Gün

6. Pozlama sisteminin montajı ve çevre ekipmanının bağlanması

NOT: Şekil 3,Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3'tedaha ayrıntılı bir görünüm verilmiştir. Üreticinin talimatlarına göre her iki modülü ve aerosol jeneratörü monte edin.

  1. Su kaynağı ileriye bakacak şekilde pozlama sistemini sağlam ve çift bir yüzeye yerleştirin. Kütle akış kontrol örmelerini aerosol jeneratörü ve temiz hava maruziyeti için modüle bağlı üç yakalı bir şişeile bağlayın.
  2. Akış kontrol cihazını ve vakum pompasını bağlayın. Akış denetleyicilerinden gelen tüpleri aerosol kılavuz modülünün ekleri üzerindeki tüp konektörle bağlayın. Akış kontrol örmelerinin diğer tarafındaki tüpleri vakum pompası ile bağlayın. Akış modülünden akış kontrolörlerinden vakum pompasına doğru iletdiğinden emin olun.
  3. Isıtma su kaynağı ile su banyosu bağlayın. Su kaynağı, su banyosundan aerosol kılavuz modülündeki su girişine gidiyor. Aerosol kılavuz modülünün su çıkışını örnekleme modülünün su girişine bağlayın. Örnekleme modülünün su çıkışından su banyosuna bir bağlantı ile daireyi kapatın.
  4. Elutriator da dahil olmak üzere aerosol jeneratörü pozlama modülüne yakın yerleştirin ve elutriator'un fazla hatlarını ve pozlama ve temiz hava modülünü büyük mikro filtrelerle ve pozlama odalarının küçük mikro filtrelerle emmesini (örn. tek kullanımlık filtreler). Elutriator, üretilen partikül atmosferi için bir rezervuar görevi görmekte ve yaklaşık 7 μm'den daha büyük parçacıkları korurken, daha küçük parçacıklar pozlama modülüne taşınır.
  5. Aerosol üretimini kontrol etmek için kullanılan bilgisayarı bir USB kablosu ve güç kaynağı ile aerosol jeneratörüst USB bağlantı noktasına bağlayın. Güç kaynağı ünitesinin AC güç fişini bir sokete (220-240 V) bağlayın.
  6. Orta besleme ve kaldırma boruları için boruları iki pompa ile bağlayın. Bunun yerine orta kaynağı için bir pompa kullanarak, orta da el ile doldurulabilir.

7. Temiz hava ve partikül maruziyetine hazırlık

  1. En az 30 dakika ısınma süresi için vakum pompasını, akış kontrolörlerini ve su banyosunu (37 °C) açın.
  2. Basınçlı hava kaynağını açın. Kütle akış kontrolörlerini aerosol jeneratöre besleme hattı için 8 L/dk ve üç yakalı şişeye besleme hattı için 3 L/dk olarak ayarlayın. Kütle akış denetleyicilerinin sekmelerini kapatın.
    NOT: Bu değerler test maddesinin özelliklerine bağlı olarak değişebilir.
  3. Modül akışını (1,5 L/dk) ve hazne emmesini (30 mL/dk) düzenlemek için akış denetleyicilerini bilgisayar aracılığıyla ayarlayın.

8. Radyal akış sisteminin sızıntı testi

NOT: Modülün düzgün bir şekilde yeniden monte edilmesini sağlamak için sızıntı kontrolü vakum altında ve her iki modül için (pozlama ve temiz hava modülü) yapılmalıdır.

  1. Giriş adaptörlerini ve kondensrefleyi aerosol kılavuz modülünden çıkarın. Aerosol kılavuz modülündeki üç aerosol besleme deliklerini fişlerle ve örnekleme modülündeki orta besleme bağlantılarını sahte kapaklarla kapatın.
  2. Filtre olmadan vakum hatlarını aerosol kılavuz modülünün tüp konektörüyle bağlayın. El tekerleği kullanarak modülü kapatın ve akış kontrolörlerinin değerini ölçün. Değerler 5 mL/dk'nın altına kapattıktan birkaç dakika sonra azalmalıdır.
  3. Sızdırmazlık kontrolünden sonra, tüm fişleri ve kukla kapakları çıkarın, giriş adaptörünü ve kondensatör reflektörünü aerosol kılavuz modülüne takın ve orta besleme ve kaldırma için boruları bağlayın.

9. Aerosol üretimi

  1. Bilgisayarı ve yazılımı başlatın (Ek Şekil 4). Bilgisayarın masaüstündeki aerosol jeneratör başlat düğmesine çift tıklayarak aerosol jeneratör yazılımı başlatın. İleti penceresi görüntülenir ve ayarların sıfırlanıp sıfırlanmaması gerektiğini sorar. Yazılım o gün ilk kez başlatılırsa Evet'i tıklatın. Slayt Konumu ve Kazıyıcı Konumu değerlerini varsayılan değerlere ayarlayın. Slayt Konumu ve Kazıyıcı Konumu değerlerini tutmak için Hayır'ı tıklatın veya slayt başlangıç konumunda değil.
  2. Aerosol jeneratör üst merkezi açılış bulunan boru, içine bir madde kazıyıcı vida.
    NOT: Pres özelliklerine bağlı olarak farklı madde kazıyıcı tipleri kullanılabilir.
  3. Madde kazıyıcı en düşük konumda değilse, Homing Mode düğmesini kullanın.
  4. Madde kabını preslenmiş test malzemesi ile madde kazıyıcının üzerine ters çevirin. Madde kabının camının öne dönük olduğundan emin olun. Madde kabındaki iki deliğin aerosol jeneratör üst iki pim üzerine uygun olduğundan emin olun. Kilitleme plakasını madde kabının üzerine yuvaya yerleştirin ve siyah vidayı sıkın.
  5. Besleme (0,24 ila 20 mm/sa) ve Döndürme (1 ila 800 devir/saat) değerlerini istenilen ayarlarla değiştirin. Parçacık konsantrasyonu, Yem değerini veya taşıyıcı gaz akış hızını artırarak veya azaltarak değiştirilebilir.
  6. Madde kazıyıcı preslenmiş madde yakın olana kadar madde konteyner ile slayt aşağı itmek için aşağı oklar kullanın.
  7. Basınçlı hava kaynağını aerosol jeneratörüne kütle akış kontrolörüne dokunarak açın ve Başlat düğmesine tıklayarak aerosol üretimini başlatın. Uzun bekleme sürelerinden kaçınmak için Besleme hızını 15-20 mm/s olarak ayarlayın.
  8. İnce toz bulutunu küçük bir el feneriyle gözlemleyerek doğru parçacık oluşumunu kontrol edin (Elutriator'un cam tüpünün arkasından aşağıdan konumlandırılmış). İlk aerosol buharı sürekli olarak Elutriator'a ulaştığında Besleme değerini istenilen ayarlara geri çevirin ve Durdur düğmesine tıklayın.

10. Pozlama deneyleri

  1. Orta beslemeyi önceden ısıtmalı pozlama ortamıyla çalıştırın ve modül açıkken alt borular kapsana kadar örnekleme modüllerini doldurun. Orta pompayı kullanın veya orta pompayı manuel olarak doldurun (bireysel maruz kalma haznesi 25 mL).
  2. Pozlama modülüne kör hücre kültürü ekler (hücresiz ekler) ekleyin. Alt borular orta ile kaplanmış ve kesici uçların alt tarafı orta ile temas edene kadar pozlama ortamıaşağı pompalayın.
  3. Aerosol jeneratörünü çalıştırın, pozlama modülünü kapatın ve pozlama modülünü aerosol jeneratörün pozlama modülü çıkışına bağlayın. Aerosol jeneratöre, kararlı bir parçacık oluşumunu sağlamak için pozlamabaşlamadan önce en az 20-30 dakika bir teslim süresi verin.
  4. Kuluçka sonrası plakaları kuluçka kontrolleri için hazırlayın ve kurşun süresi boyunca maruz kalan hücre kültürü ekler. Kuyu başına 1,5 mL büyüme ortamı ekleyin ve kuvözdeki plakaları kuluçkaya yatırın (37 °C, %5 CO2).
  5. Kurşun süresinden sonra, Elutriator'un pozlama modülü çıkışını kauçuk bir fiş ile kapatın ve kör kesici uçları çıkarın. Alt borular orta ile kapsana kadar pozlama ortamını (pompayı kullanarak veya manuel olarak) yeniden doldurun. Şimdi, kütle akış denetleyicisi (3 L/dk) musluğu ile temiz hava modülüne basınçlı hava beslemesini de açın
  6. Bir cızırdayan yardımıyla 6-kuyu plakaları hücre kültürü ekler çıkarın. Hücre kültüründen büyüme ortamını dikkatlice dökün, kesici uçları devirerek ve bir pipet kullanarak artık sıvıyı atın. Uçları her iki modülün pozlama odalarına, pozlama ve temiz hava modülüne yerleştirin.
  7. Modülleri kapatın ve pozlama modülünü aerosol jeneratörün pozlama modülü çıkışına ve temiz hava modülünü aynı anda taşıyıcı gaz kaynağına bağlayarak pozlama deneylerine başlayın.
    NOT: Parçacık konsantrasyonu, Yem değerini, taşıyıcı gaz akış hızını veya maruz kalma süresini artırarak/azaltarak değiştirilebilir.
  8. Deney tamamlandıktan sonra pozlama ve temiz hava modüllerini kesin ve pozlama modülü çıkışını kapatın.
  9. Dur düğmesine tıklayarak basınçlı hava beslemesini ve aerosol jeneratörü durdurun.
  10. Pozlama ve temiz hava modüllerini açın ve hücre kültürünü nisbeten bir cızırdama kullanarak hazırlanan kuluçka sonrası plakalara aktarın. 6 kuyulu plakaları ALI'de 24 saat (37 °C, %5 CO2)için kuluçkaya yatırın.
    NOT: Daha fazla maruz kalma denemeleri planlanıyorsa 10.5 -10.10 adımlarını tekrarlayın.
  11. Maruz kalan hücre kültürü ekler aynı koşullar altında ALI inkübatör kontrolleri olarak kullanılan hücre kültürü kesici uçlar asansör ve 24 saat (37 °C,% 5 CO2) için inkübat.
  12. Madde kabını kaldırmak için Homing Mode düğmesini kullanın. Sağ üst köşedeki X'e tıklayarak aerosol jeneratör yazılımını kapatın ve bilgisayarı kapatın.
  13. Tüm pozlama deneylerini tamamladıktan sonra aerosol jeneratörü ve her iki pozlama modüllerini temizleyin. Test maddesi önümüzdeki günlerde daha fazla kullanılacaksa madde kabını parafilm ile kapatın.

3. Gün

11. Hücre canlılığı

NOT: WST-1 tpatı kullanılarak mitokondriyal aktivite ölçülerek parçacık birikiminden 24 saat sonra hücre canlılığı belirlendi. Test üreticinin protokolüne göre yapıldı. Hücre canlılığı diğer hücre canlılık testleri (örneğin, XTT) kullanılarak da belirlenebilir.

  1. Temper büyüme ortamı nı 37 °C'de ısıtın ve ışıktan korunan WST-1 çözeltisini eritin. Kuyu başına 2,5 mL büyüme ortamına sahip uygun sayıda yeni 6 kuyulu plaka hazırlayın ve kuvözdeki plakaları kuluçkaya yatırın.
  2. Büyüme ortamında yeterli miktarda WST-1 1:7 seyrelterek WST-1 seyreltme hazırlayın
  3. Yeni hazırlanmış 6-iyi plakalar maruz kaldıktan sonra hücre kültürü ekler 24 saat ekler. Her hücre kültürü eklemek için taze hazırlanmış WST-1 çözeltisi 1 mL ekleyin. Çözeltiyi hücrelerüzerinde homojen bir şekilde dağıtmak için plakaları dikkatlice sallayın. Hücre kültürü 1 saat (37 °C, %5 CO2)ile 6 kuyulu plakaları kuluçkaya yatırın.
  4. Her 6 kuyudan 96 kuyulu bir tabağa triplicates içinde supernatant 100 μL aktarın. Mikroplaka okuyucu kullanarak 650 nm referans dalga boyu ile 450 nm'de emiciliği ölçün.

12. İstatistik

  1. Bireysel inkübatör kontrollerinin hücre canlılığını %100'e normalleştirin.
  2. Maruz kalan hücrelerin canlılığını bireysel kuvöz kontrollerine göre ifade edin. Test maddelerinin sitotoksisitesi ilgili kuvöz kontrolleri ile karşılaştırıldı ve toksisitenin bir göstergesi olarak kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CULTEX RFS, ALI'deki hücrelerin doğrudan ve homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan özel olarak tasarlanmış modüler in vitro pozlama sistemidir. Eski bir ön doğrulama çalışması nda, bu maruz kalma sisteminin genel uygulanabilirliği ve aktarılabilirliği, stabilitesi ve tekrarlanabilirliği başarıyla gösterilmiştir. Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı tarafından finanse edilen yakın tarihli bir araştırma projesinde, maruz kalma sistemi başarıyla doğrulandı ve test edilen bileş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Birçok hayvan dışı inhalasyon toksisite testi modelleri son yıllarda inhale edilebilir parçacıkların akut inhalasyon tehlikesi hakkında bilgi edinmek ve 3R prensibine göre hayvan deneylerini azaltmak ve değiştirmek amacıyla geliştirilmiştir25.

Hücre kültürü modelleri açısından, hücrelerin maruz kalma batık koşullar altında veya ALI yapılabilir. Batık koşullar altında hücrelerin maruz fiziko-kimyasal özellikleri ve böylece, bir test maddesinin toksik özelliklerini etkile...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

YAZARLAR AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT ve DS ifşa etmek için hiçbir şey var. Cultex Technology GmbH (eski adıyla Cultex Laboratories GmbH) bu makalede kullanılan enstrümanlar (örneğin CULTEX RFS, CULTEX DG) üretmektedir. NM bu çalışma sırasında Cultex Laboratories GmbH'nin bir çalışanıydı. Ok Cultex Technology GmbH (eski Cultex Laboratories GmbH) bir çalışanıdır. Cihaz için pct/EP2009/007054 patenti Cultex Technology GmbH'nin kurucusu Prof. Dr. Ulrich Mohr (eski adıyla Cultex Laboratories GmbH) tarafından saklanmıştır.

Teşekkürler

Bu çalışma Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Almanya (Grant 031A581, alt proje A-D)) ve Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Araştırma Eğitim Grubu GRK 2338).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücreler< / güçlü >
A549ATCCCCL-185
< güçlü > Hücre kültürü ortamı ve malzemeleri< / güçlü >
DMEMBiochrom, Berlin, AlmanyaFG 0415büyüme ortamı olarak kullanılır
DMEMGibco-Invitrogen, Darmstadt, Almanya22320maruz kalma ortamı olarak kullanılır
FBS superiorBiochrom, Berlin, AlmanyaS 0615
Gentamisin (10mg/mL)Biochrom, Berlin, AlmanyaA 2710
HEPES 1MTh. Geyer, Renningen, AlmanyaL 0180
PBSBiochrom, Berlin, AlmanyaL 1825
Tripsin/EDTA (%0,05/%0,02)Biochrom, Berlin, AlmanyaL 2143
Hücre kültürü materyali
CASY BardaklarıRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, AlmanyaREF 05651794
Hücre kültürü plakalarıCorning, Wiesbaden, Almanya35166 utangaç ve oyuklu plakalar
Corning Transwell hücre kültürü ekleriCorning, Wiesbaden, Almanya345024 mm uçlar; 6-&utangaç; kuyu plakaları; 0.4 ve mikro; m
Chemicals
CASYtonRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, AlmanyaREF 05651808001
Basınçlı Hava (DIN EN 12021)Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleiß heim, Almanya2290152
WST-1Abcam, Cambridge, Birleşik Krallıkab155902
Instruments + equipment
CASY Hücre SayacıSchä rfe System GmbH, Reutlingen, Almanya
Sirkülasyon termostatıLAUDA, Lauda-Kö nigshofen, AlmanyaEcoline RE 100
CULTEX HyP - Hidrolik PresCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX geçmeli manşonCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radyal Akış Sistemi Tip 2 (partikül maruziyeti modülü)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radyal Akış Sistemi Tip 2 (temiz havaya maruz kalma modülü)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX tedarik
Akış kontrolörü 0-30 ml/dak (IQ-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Akış kontrolörü 0-1,5 l/dak (EL-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filtreler (büyük)Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, AlmanyaLP-050Munktell Steril Filtre; Partikül tutma verimliliği > %99,999Filtreler
(küçük)Parker Hannifin Corporation, Mainz, Almanya9933-05-DQBalston tek kullanımlık filtre
Orta pompaCole-Parmer GmbH, Wertheim, AlmanyaIsmatec IPC Yüksek Hassasiyetli Çok Kanallı Dispenserdijital peristaltik pompa
Mikroplaka Okuyucu Sonsuz M200 ProTecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Almanya
Vakuum pompasıKNF, Freiburg, AlmanyaN86 KT.18
Vö gtlin kütle akış kontrolörü 0,2-10 l/dakTrigasFI GmbHVö gtlin red-y kompakt regülatör, Tip-No: GCR-C3SA-BA20
Su BanyosuLAUDA, Lauda-Kö nigshofen, AlmanyaEcoline Staredition RE 104

Kaynaklar

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).
  3. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  4. LANUV Nordrhein-Westfalen. Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  5. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  6. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  7. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  8. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  9. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  10. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  11. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  12. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  13. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  14. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  15. Eskes, C., Whelan, M. Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, Springer International Publishing. (2016).
  16. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  17. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  18. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  19. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  20. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  21. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  22. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  25. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).
  26. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  27. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  28. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2018).
  29. OECD. Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , OECD Publishing. Paris. (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

In Vitro MaruziyetRadyal Ak SistemiAerosol retimiPartik l BirikimiH cre Canl l AnaliziWST1 Sol syonu
Hava-Sıvı Arabiriminde Ekili İnsan Akciğer Hücrelerinin Açığa Çıkarılması yla Havadaki Partiküllerin Akut İnhalasyon Toksisitesinin Değerlendirilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.