Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

6.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60619

⸱

23 Kasım 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Program in Molecular and Integrative Biosciences, University of Helsinki, 2Drug Research Program, Division of Pharmaceutical Chemistry and Technology, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki, 3School of Biomedical Sciences and Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada membrana bağlı pirofosfataz (Thermotoga maritimadan) inhibitörleri için 96 kuyu plaka biçiminde mobibdenum mavi reaksiyonu dayalı bir tarama yöntemi salıyoruz.

Özet

Membrana bağlı pirofosfatazlar (mPPases) bakterilerde, arkelerde, bitkilerde ve protist parazitlerde oluşan dimerik enzimlerdir. Bu proteinler pirofosfatı iki ortofosfat molekülüne ayırırlar, bu moleküller proton ve/veya sodyum iyonile birleştiğinde membran boyunca pompalanırlar. Hayvanlarda ve insanlarda homolog protein oluşmadığından, mPPP'ler potansiyel ilaç hedeflerinin tasarımında iyi adaylardır. Burada 96 kuyu plaka sisteminde mobibdenmavi reaksiyon kullanan mPPase inhibitörleri için ayrıntılı bir protokol sayılmaktadır. Termofilik bakteri Thermotoga maritima (TmPPase) mPPase'yi model enzim olarak kullanıyoruz. Bu protokol basit ve ucuzdur ve tutarlı ve sağlam bir sonuç verir. Testin başlangıcından emici ölçüme kadar etkinlik test protokolünü tamamlamak sadece bir saat sürer. Bu çıktıda üretilen mavi renk uzun bir süre için kararlı olduğundan, sonraki tsay(lar) önceki toplu işlemden hemen sonra gerçekleştirilebilir ve emicilik daha sonra tüm gruplar için aynı anda ölçülebilir. Bu protokolün dezavantajı, elle yapılır ve böylece yorucu yanı sıra pipetting ve zaman tutma iyi beceriler gerektirir olabilir. Ayrıca, bu istihda kullanılan arsenit-sitrat çözeltisi sodyum arsenit içerir, toksik ve gerekli önlemler ile ele alınmalıdır.

Giriş

Toplam hücresel proteinlerin yaklaşık %25'i membran proteinleridir ve bunların yaklaşık %60'ı ilaç hedefleri1,2'dir. Potansiyel ilaç hedeflerinden biri3, membrana bağlı pirofosfatlar (mPPases), iki ortofosfat içine pirofosfat hidrolizi ile membran boyunca proton ve / veya sodyum iyon pompa dimerik enzimlervardır 4. mPPases çeşitli organizmalarda bulunabilir5 bakteri gibi, arke, bitkiler, ve protist parazitler, insanlar ve hayvanlar hariç4. Protist parazitlerde, örneğin Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii ve Trypanosoma brucei, mPPases parazit virülans için gerekli 6 ve parazitlerde bu ifadenin nakavt dış temel pH maruz kalma sırasında hücre içi pH bakımında başarısızlığa yol açar7. Omurgalılarda homolog protein ve önemi nedeniyle, mPPases protistal hastalıklar için potansiyel ilaç hedefleri olarak kabul edilebilir3.

Bu çalışmada mPPase inhibitörlerinin in vitro taraması TmPPase model sistemine dayanmaktadır. TmPPase, T. maritima'dan gelen sodyum iyon pompalama ve potasyum iyne bağımlı mPPase olup 71 °C8'deoptimum aktiviteye sahiptir. Bu enzimin faydaları örneğin üretim ve arınma kolaylığı, iyi termal stabilite ve yüksek özgül aktivite vardır. TmPPase pozisyon tam koruma yanı sıra protist mPPases3,9 ve Vigna radiata10 mPPase çözülmüş yapısına tüm katalitik artıkların kimliğini yanı sıra yüksek benzerlik gösterir. Farklı konformasyonlarda TmPPase mevcut yapıları da yapı tabanlı uyuşturucu tasarım deneyi için yararlıdır (sanal tarama ve de novo tasarım olarak).

Burada TmPPase inhibitörlerinin 96 kuyu plaka biçiminde taranması için ayrıntılı bir protokol sunarız (Şekil 1). Protokol ilk Fiske ve Subbarow11tarafından geliştirilen mobibdenum mavi reaksiyon, kolorimetrik yöntemine dayanmaktadır. Bu yöntem, ortofosfat ve molybdate asidik koşullar altında 12 fosfathomolybdic asit oluşumunu içerir, daha sonra karakteristik mavi renkli fosfathomolybdenum türleri vermek için azalır12.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Protein hazırlama

NOT: TmPPase'nin ifadesi ve arınması başka bir yerde13olarak tanımlanmıştır.

  1. 20 mM 2-(N-morfolino)etanesulfonik asit (MES) pH 6.5, %3.5 (v/v) gliserol, 2 mM dithiothreitol (DTT) ve %0.05 dodecyl maltoside (DDM) içeren reaktivasyon tampon çözeltisinin 10 mL'sini hazırlayın.
  2. 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2,333 mM KCl ve 67 mM NaCl içeren reaksiyon karışımının 10 mL'sini hazırlayın.
    NOT: Mg2+ mPPPAz substrat olarak pirofosfat chelate gereklidir, K+ TmPPase potasyum bağımlı mPPase olduğu gibi enzim aktivitesini artırmak için gereklidir, ve Na+ TmPPase tarafından sodyum iyon translokasyonu sırasında enzim aktivitesi için gereklidir.
  3. Enzim reaktivasyonu için 30 mg/mL lipozom hazırlayın.
    1. 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 ile 1 mM DTT ile 0.3 g L-α-fosfatidilkolin in 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 1 mM DTT ile ekleyin.
    2. Lipozom'u buza koyun ve 1 dakika boyunca 1 saniyelik darbe aralığıyla sonicate edin, 1 dakika duraklayın ve çözelti saydam sarı olana kadar tekrarlayın.
    3. Aliquot lipozomlar, sıvı nitrojen dondurun ve kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.
  4. Enzimi yeniden çalıştırın.
    1. Lipozom çözeltisinin 40 μL'sini DDM'nin 22,5 μL'si ile karıştırın.
    2. Karışımı 55 °C'de 15 dk ısıtın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
    3. Reaktivasyon tampon çözeltisinin 36.5 μL'sini ekleyin, karıştırın ve toplam 0.13 mg/mL konsantrasyon yapmak için 1 μL konsantre protein (13 mg/mL) ekleyin.
      NOT: Protein genellikle saflaştırma dan sonra 10 μL aliquots dondurulur ve kullanmadan önce buz üzerinde çözülür.
  5. Yeniden aktive edilen enzimin 20 μL'sini alın ve reaksiyon karışımının 1.480°L'sine ekleyin, sonra hafifçe karıştırın.
    NOT: Reaksiyon karışımına yeniden aktive edilen enzimin eklenmesi kullanılmadan hemen önce yapılmalıdır.

2. Bileşik hazırlama

  1. Bileşiklerin kullanılabilirliğine bağlı olarak 25−100 mM'lik stok çözeltilerini 50−200 μL'de yapmak için bileşikleri dimetil sülfoksit (DMSO) olarak çözün.
    NOT: Burada kullanılan tüm bileşikler(Şekil 2A) daha önce 9 olarak yayınlanmıştır. Bileşik çözünürlük düşükse, stok konsantrasyonu buna göre ayarlanabilir.
  2. Suda her bileşiğin üç farklı konsantrasyonları hazırlayın.
    NOT: Reaksiyon karışımındaki son konsantrasyonlar sırasıyla 1, 5 ve 50 mikromolar veya 1, 5 ve 20 mikromolar olacaktır.
    1. Çözünen bileşikler için 2 μM, 10 μM ve 100 μM veya alternatif olarak 2 μM, 10 μM ve 40 μM'yi az çözünen bileşikler için vermek için stok çözeltisini mikrotüplerde 1 mL'ye kadar suile seyreltin.
    2. Uygun karıştırma için stok çözeltisi seyreltilmesinden sonra anında bileşik çözelti girdap.
  3. Nephelometre kullanarak bileşik toplama olup olmadığını kontrol edin.
    NOT: Bu üç konsantrasyonda (1 μM, 5 μM ve 20 μM) triplicate olarak incelendi ve 96 kuyu plakasında boşa normalleştirildi.
    1. Çok kanallı bir pipet kullanarak reaksiyon karışımının 75°L'sini her kuyuya dağıtın.
    2. Her bileşiğin 75 μL'sini ekleyin (boş için, bunun yerine 75°L su kullanın) ve 5×'lik yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
    3. Mikroplaka nephelometre kullanarak her kuyu300 V'de ölçün.

3. Asayi hazirlama için reaktifler

  1. Arsenit-sitrat çözeltisini hazırlayın.
    1. Tartmak 5 g sodyum arsenit ve trisodyum sitrat dihidrat 5 g.
      DİkKAT: Sodyum arsenit toksiktir, bu nedenle uygun koruyucu ekipman kullanın ve özel bir özenle saplanır. Önlem olarak, gerekli tüm güvenlik önlemleri okunmadan ve anlaşılmadan işlemeyin. Bileşiğin veya çözeltisinin tozunu/buharını teneffüs etmemek için sadece bir duman kaputunda teşrinverin. Solunduğunda, temiz havaya geçin ve tıbbi yardım alın. Yutma ve göz/cilt temasından kaçınmak için uygun kimyasal güvenlik gözlüğü, koruyucu eldiven ve giysi takın. Yutulursa, hemen bir zehir merkezi veya doktor /doktor arayın. Deriye veya göze girerse, bol su yla yıkayın ve tıbbi yardım alın.
    2. 100 mL suya çözün.
    3. 5 mL buzul asetik asit ekleyin, karıştırın ve 250 mL su ekleyin.
    4. Işıktan korunan oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Çözüm bir yıldan uzun süredir stabildir.
  2. A çözeltisi ve B çözeltisi hazırlayın.
    1. A çözeltisi için, 0,5 M HCl ile 0,3 g askorbik asit için 10 mL buz soğuk ekleyin. Girdap ederek askorbik asidi çözün.
    2. B çözeltisi için, 70 mg amonyum heptamolybdate tetrahidrat ve girdap çözünmek için buz soğuk su 1 mL ekleyin.
      NOT: Her iki çözümü de kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Sonuç sonuçlarının tutarlılığı için, her iki çözüm de en fazla bir hafta boyunca buzda saklanabilir.
  3. Kalibrasyon için 0 μM, 62,5 μM, 250 μM ve 500 μM konsantrasyonu ile fosfat (Pi)standardını hazırlayın.
    1. Reaksiyon karışımının 370 μL'sini içeren dört mikrotüpe 0 μL, 25 μL, 50 μL ve 100 μL 5 mM Na2HPO4 dihidrat ekleyin.
    2. 1 mL'ye kadar su ile toplayın.

4. Bir 96 kuyu plakası için faaliyet telbettei

NOT: Tişin şematik iş akışı için Şekil 1'e bakınız.

  1. 1 mL b çözeltisi ekleyin 10 mL çözelti A, girdap ile karıştırın ve çözeltiyi buz üzerinde saklayın.
    NOT: Bu çözüm saydam ve sarı olmalıdır. A + B çözeltisini kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca buzüzerinde tutun. Ancak, uzun süreli depolama sonra kötü gidecek gibi 3 saat içinde çözüm kullanın.
  2. Çok kanallı bir pipet kullanarak trikifat taki tüp şeritlere 40 μL 0 μM, 62,5 mM, 250 μM ve 500 μM Pi standardı ekleyin.
    NOT:P olmayan reaksiyon karışımı boş olarak kullanılacaktır.
  3. Çok kanallı pipet kullanarak tüp şeritlere 25 μL bileşik çözelti ekleyin.
    NOT: Her bileşiğin triplicate üç farklı konsantrasyonu olan yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50)ilk tahmini için yeterlidir. Daha doğru bir IC50 tayini için sekiz farklı bileşik konsantrasyonu kullanılabilir. Sınır tanımayan enzim için bileşik çözelti eşit miktarda su ile değiştirilir. Pozitif kontroller olarak 2.5 μM, 25 μM ve 250 μM imidodiphosphate (IDP) sodyum tuzu kullanıldı.
  4. Çok kanallı pipet kullanarak tüp şeritlere (Pi standardı içeren tüpler hariç) 15 μL mPPase çözeltikarışımı ekleyin.
  5. Boru şeritlerini yapışkan sızdırmazlık levhasıyla kapatın. Her tüp şerit ayırmak için sızdırmazlık levha kesin.
  6. Numuneleri 71 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın. Sonraki adımlarda zaman tüketimini en aza indirmek için numuneleri her şerit arasında 20 s aralığı olan ısıtma bloğuna yerleştirin.
  7. Her şerit için yapışkan sızdırmazlığı açın. Çok kanallı bir pipet kullanarak 10 μL 2 mM sodyum pirofosfat dibasic ekleyin ve 5× için yukarı ve aşağı boru ile karıştırın. Aynı sızdırmazlığı kullanarak tüp şeridini tekrar kapatın.
    NOT: Bu adımı başlangıçta 20 s gerçekleştirmek zor olabilir; ancak, bazı tahliller sonra daha kolay olacaktır.
  8. 71 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
  9. Numuneleri her şerit arasında 20 s aralığı olan soğutma aparatı üzerine yerleştirin. Onları 10 dakika soğutun ama kısa bir süre soğutma 5 dakika sonra her şerit santrifüj, sızdırmazlık levha altında su damlaları decant, sonra soğutma aparatı geri koymak ve sızdırmazlık kaldırın.
    NOT: Soğutma aparatı, su yla doldurulmuş ve en az 1 saat dondurulmuş polistiren Petri kabına (boyut 150 mm × 15 mm) 96 iyi PCR plaka yerleştirilerek yapılabilir. Cihaz, tayın başlamasından yaklaşık 5 dakika önce dondurucudan çıkarılmalıdır. Reaksiyon karışımını donduracak ve renk gelişimini engelleyecek şekilde numune soğutmadan hemen önce soğutma aparatı çıkarmayın.
  10. 10 dk soğuduktan sonra 60 μL çözelti A + B ekleyin, 5× için yukarı ve aşağı borular karıştırarak karıştırın ve 10 dakika boyunca soğutma aparatı üzerinde tüp şeritler tutun.
  11. Arsenit-sitrat çözeltisinin 90 μL'sini ekleyin ve sabit bir mavi renk üretmek için en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
    DİkKAT: Toksisitesi nedeniyle sodyum arsenit içeren tüm çözeltiler her zaman ekstra özenle kullanılmalıdır. Bu nedenle, arsenit-sitrat çözeltisi ilavesi bir duman başlık yapılmalıdır.
  12. Her reaksiyon karışımından 180 μL'yi 96 kuyu polistiren mikroplakaya dağıtın.
  13. Mikroplaka spektrofotometre kullanarak her kuyunun emiciliğini 860 nm olarak ölçün.

5. Sonuç analizi

  1. Her numunenin ve Pi standartlarının ortalama triplicates'i. Ardından arka plan sinyalini ortadan kaldırmak için boş ile çıkarın.
  2. Pi standardı (nmol) miktarına göre emicilik (A860)değerlerini çizerek bir kalibrasyon eğrisi yapın ve aşağıdaki formülü kullanarak eğilim çizgisi işlevini elde etmek için doğrusal bir regresyon gerçekleştirin:
    figure-protocol-1
  3. Yukarıdaki doğrusal regresyon formülüne göre enzimatik reaksiyondan salınan fosfat miktarını (nmol) hesaplayın.
  4. Aşağıdaki formülü kullanarak belirli etkinliği hesaplama:
    figure-protocol-2
    nPi reaksiyondan salınan fosfat miktarı (nmol), t reaksiyon süresidir (min) ve mTmPPPase ise, istiyatuarında (mg) kullanılan saf TmPPPPaz miktarıdır.
  5. Aşağıdaki formülü kullanarak her inhibitör konsantrasyonu için yüzde aktivitesini hesaplayın:
    figure-protocol-3
    saiinhibitör ve SAun ile bir örnek özel aktivite s sınır tanımayan numunenin özgül aktivitesidir.
  6. LogIC50 (tahmin) ve IC50 (tahmin) aşağıdaki formülü kullanarak dört parametredoz-yanıt eğrisi bir doğrusal olmayan regresyon uygun hesaplayın:
    figure-protocol-4
    X'in konsantrasyon kütüğü olduğu (μM), Y aktivite (%), Üst ve Alt y ile aynı birimdeki platolardır (%sırasıyla 0 ve %0), logIC50 X ile aynı log birimlerine sahiptir ve HillSlope = eğim faktörü veya birbiri olmayan tepe eğimi.
    NOT: Montaj için yazılım(Malzeme Tablosu)kullanılır. Sıfırloarithm tanımlı olmadığı gibi inhibitör olmadan örnek için 0,01 μM (0,00 μM yerine) konsantrasyonu kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolde, pirofosfatazların ortak inhibitörü olan IDP ile birlikte sekiz bileşik (Şekil2A)pozitif kontrol olarak test edildi. Her bileşik üç farklı konsantrasyonda (1 μM, 5 μM ve 20 μM) trilikat olarak test edildi. Taramanın iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir , numune ve reaktif hazırlığından başlayarak 860 nm'de emici ölçüme kadar.

Bu protokolün sonunda, Çözelti A + B ve arsenit-sitrat eklendikten sonra, çözeltiler gözlemlenebili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada Vidilaseris ve ark14dayalı bir 96 iyi plaka formatında T. maritima membran bağlı pirofosfatse için inhibitörleri basit tarama için ayrıntılı bir protokol rapor . Bu protokol ucuz dur ve asidik koşullarda ortofosfat ve molybdate oluşan ve farklı bir mavi renk 12 ile fosfathomolybdenum türlerine indirgenmiş12fosfathomolybdic asit, dayanmaktadır. Bu yöntem diğer protokoller üzerinde tercih edilir, daha hassas malakit yeşil test16gibi , B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Jane ve Aatos Erkko Vakfı ve BBSRC (BB/M021610) adrian Goldman hibe tarafından desteklenmiştir, Finlandiya Akademisi (No. 308105) Keni Vidilaseris, (No. 310297) Henri Xhaard ve (No. 265481) Jari Yli-Kauhaluoma ve Helsinki Üniversitesi Araştırma Fonları Gustav Boije af Gennäs için. Yazarlar bernadette Gehl'e proje sırasında ki teknik yardımları için teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yapışkanlı sızdırmazlık levhasıThermo ScientificAB0558
Amonyum heptamolibdat tetrahidratMerckF1412481 636
Askorbik asitSigma-Aldrich95212-250G
BioLite 96Well Çok ÇanaklıThermo Scientific130188
Dimetil sülfoksit (DMSO)Merck1167431000
8 oyuklu PCR Tüp Şeritleri 0.2 ml kapaksız (120)Nippon genetiğiFG-028
Dodesil maltozit (DDM)MelfordB2010-100G
EtanolMerck1009901001
Buzlu asetik asitMerck1000631011
Hidroklorik asitSigma-Aldrich258148-500ML
İmidoidifosfat sodyum tuzSigma-AldrichI0631-1G
L-&alfa;-Soya fasulyesi lesitininden fosfatidil kolinSigma429415-100GM
Magnezyum klorürSigma-Aldrich8147330500
Çok Plakalı 96 Kuyulu PCR PlakalarıBio-RadMLL9651
MultiSkan GoThermo Scientific10680879
Nepheloskan Tırmanış (Tip 750)Labsystems
Polistiren Petri kabı (boyut 150 mm x 15 mm)Sigma-AldrichP5981-100EA
Potasyum klorürMerck104936
Prism 6 yazılımıGraphPad
QBT2 Isıtma bloğuHibe Aletleri
Sodyum meta-arsenitFisher Chemical
Sodyum fosfat dibazik (Pi)SigmaS0876-1KG
Sodyum pirofosfat dibazikFluka71501-100G
Trisodyum sitrat dihidratFluka71404-1KG
12897692

Kaynaklar

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
  2. Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
  3. Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
  4. Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
  5. Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
  6. Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
  7. Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
  8. Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
  9. Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
  10. Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
  11. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
  12. Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
  13. Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
  14. Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
  15. He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
  16. Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
  17. Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Molibden Mavisi ReaksiyonuEnzim Aktivite AnaliziLipozom ReaktivasyonuArsenit Sitrat zeltisi96 Kuyucuklu Plaka SistemiMikroplaka Spektrofotometresinhibit r Tarama ProtokolPirofosfat Hidrolizi
Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.