Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Bu yöntem ayrıntıları, start-to-finish, hücresel malzeme nin en az miktarda kullanarak ortotopik pankreas tümörleri oluşturmak için cerrahi prosedür ve bağışıklık hücresi popülasyonlarının kapsamlı akış sitometri analizi için kurulan tümörlerin sonraki hızlı dissosiyatasyon, T hücre fonksiyonunun ex vivo analizi de dahil olmak üzere.

Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) 5 yıl hayatta kalan hastaların sadece % 8'i ile agresif bir karsinomdur¹. Hastaların %20'sinden azı cerrahi rezeksiyon için uygun^olduğundan,taze hasta örnekleri araştırma için kolayca erişilebilir değildir ve bu nedenle in vivo modelleri bu hastalığı araştırmak için gerekli araçları sağlar. PDAC'ın birden fazla mürin modeli vardır: ortotopik, subkutan, transgenik, intravenöz ve hasta kaynaklı ksenogreft (PDX), burada yaygın olarak tanımlanmış³. Burada açıklanan ortotopik model immünobeceriksiz farelerin pankreas içine syngeneic PDAC hücrelerinin enjeksiyonu sağlar. Bu vahşi tip veya mutant farelerin büyük kohortlar yapılabilir, ve böylece terapötik ajanların karşılaştırılması için uygun maliyetli ve tutarlı bir model sağlar. Daha da önemlisi, ortotopik model tümör hücre büyümesi için cognate mikroortam sağlar ve elimizde metastazlar ve diğerleri⁴ klinik olarak ilgili sitelere (örneğin, karaciğer), daha klinik olarak subkutan veya kimyasal kaynaklı modeller daha alakalı hale. Ortotopik tümörler PDAC temel özellikleri görüntülemek, fibroblastlar ve ekstrasellüler matriks birikimi bir bolluk ile güçlü bir desmoplastik reaksiyon gibi⁵. PDAC transgenik modelleri murine modelinin altın standart ve en yaygın kullanılan KPC modeli, mutant Kras^{G12D / +} ve Trp53^{R172H / +} pankreas özgü Pdx-1-Cre promoter^altındaifade 6. Ek KPC ve diğer in vivo PDAC modelleri^burada7 gözden geçirilir. KPC fareler kendiliğinden sadakatle insan PDAC özellikleri çoğaltır bir hastalık ilerlemesi ile pankreas tümörleri geliştirmek⁶. Ancak, tüm transgenik modellerde olduğu gibi, üreme programı pahalıdır, tümör ilerlemesi değişkendir ve bu nedenle genellikle büyük fare kohortları gerektirir. PDX modelleri hasta kaynaklı tümör hücreleri veya daha sonra ya ortonik ya da daha sık subkutan bağışıklık farelerde yetiştirilen adet kullanın. Ksenogreft modelleri terapötik bileşiklerin taranması için yararlı araçlar sağlar ve hasta heterojenliğini hesaba katar. Ancak, böylece uygulamaları⁸,⁹sınırlayan, tam bir bağışıklık mikroortamı sağlamaz.

Kurulduktan sonra, ortotopik tümörler genellikle büyümek için yaklaşık 1 ay veya daha fazla sürer (kullanılan hücre hattına bağlı olarak) ve kolayca ultrason veya MRI ile progresyon izlemek ve tedavi etkinliğini belirlemek için görüntülenebilir büyük tümörler oluşturmak^4,5,10. Ancak, bir kez üstel büyüme, tümör büyümesinin son aşaması hızlı olabilir, bu yüzden en tedavi rejimleri nispeten erken başlar (örneğin, 14 gün)^11,12. Bağışıklık sistemi tümör gelişiminde kritik bir rol oynar, PDAC dahil, hangi bir immünsupresif tümör t hücrelerinin göreceli azlığı ve miyeloid hücrelerin sık varlığı ile infiltrasyon ile karakterizedir¹³. PDAC T hücrelerinin yüksek varlığı daha iyi bir prognoz^{verir 14,15}. Ancak, tek ajanlar olarak, anti-CTLA-4¹⁶ ve anti-PD-L1¹⁷gibi T hücre immünsupresyonu rahatlatmak bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri, PDAC hastalarında klinik fayda göstermedi, genel T hücre reaktivitesi çok düşük olduğu için büyük olasılıkla. Ancak, ajanlar, anti-CD40 gibi prime T hücre yanıtları, anti-PD-L1/CTLA-4 direnci üstesinden gelebilir^18,19 ve GM-CSF salgılayan allojenik PDAC aşısı ile aşılama (GVAX) PDAC tümörlerin immünjenite artırabilir²⁰, T hücre formları önemli terapötik yol gösterir arttırıcı gösteren.

Antitümöral T hücre yanıtı için kritik t-hücre reseptörü (TCR) ve sitotoksik sitokinler ve granüllerin sonraki üretimi yoluyla tümör kaynaklı antijenlerin tanınmasıdır. T hücre antijen tanıma TCR dizilimi ile belirlenebilir iken, bu yaklaşım pahalı ve zaman alıcıdır. Ancak, tümör-infiltrasyon T hücre alt kümelerinin nicel bir anti-tümöral yanıt iyi bir göstergesi sağlar. Degranülasyon, sitokin üretimi ve diğer sitotoksik faktörler açısından T hücre aktivitesi ex vivo daha ileri incelenmesi daha derin bir fonksiyonel analiz sağlar. Bu tahliller taze tümör örnekleriüzerinde yapılabilir ve T hücre fonksiyonunun birçok parametre akışı sitometri ile hızlı bir şekilde ölçülebilir.

CD8⁺ ve CD4⁺ T hücreleri bir bağışıklık yanıtı güçlendirmek için IFNγ ve TNFα gibi sitokinler üretmek²¹. IFNa, hedef hücrelerde MHCI upregülasyonuna neden olur, bağışıklık hücrelerinin farklılaşmasına ve işe alınmasına neden olur ve hücre ölümüne yardımcı olur. CD8⁺ T hücreleri tarafından IFNγ üretimi antitümöral yanıtın bir parçası olarak iyi karakterizedir ve tümör regresyonu ile ilişkilidir^22,23. TNFα, CD8⁺ ve CD4⁺ T hücreleri tarafından üretilen başka bir proinflamatuar sitokindir. Bu TCR bağımlı aktivasyon ve T hücrelerinin çoğalmasını artırır, anti-tümöral yanıt yardımcı. TCR katılımı üzerine, sitotoksik CD8⁺ T hücreleri degranülasyon geçirebilir, sitotoksik moleküller içeren önceden oluşturulmuş sekresör lizozomlar hedef hücre bozulmasına neden olmak için immünolojik sinaps içine serbest bırakılır²¹. Bu moleküller Perforin içerir, hedef hücre zarına bağlanan bir protein, daha sonra membran bütünlüğünü bozan ve difüzyon sağlayan²¹ veya endocytoz²⁴ diğer sitotoksik moleküllerin, Granzyme B gibi, doğrudan hedef hücrenin sitoplazma içine gözenekler oluşturan. Granzyme B, hedef hücre içindeki birden fazla proteinin bozulmasını öngören ve hücre ölümüne yol açan bir proteazdır^21. Bu tür moleküllerin salınımı hücre yüzeyine endozozomların ekzositoz gerektirir, endozomal marker CD107a (ayrıca LAMP-1 olarak da bilinir) geçici hücre zarına dahil edilir²⁵.

Sitokin salgısının T hücreleri tarafından ölçülmesi, aynı anda çok sayıda numuneüzerinde kolayca yapılamayacak akış destekli hücre sıralaması veya boncuk bazlı ayırma tahlilleri ile izolasyonlarını gerektirir. Ancak, hücre içi sitokinlerin ölçümü herhangi bir ön izolasyon adımı gerektirmez ve aynı anda birden fazla numune üzerinde kolayca yapılabilir, böylece daha yüksek işlem yaklaşımı sağlar. Sitokinler hızla T hücreleri tarafından salgılanır gibi, hücre içi düzeyleri tespit edilemez olabilir ve böylece T hücresi bazal sitokin üretimini artırmak için stimülasyon gerektirir. Antijen güdümlü sitokin üretimini değerlendirmek için, TCR tarafından tanınan antijen, astarlı bir APC in vitro ile T hücresine sunulmalıdır. Antijen özgüllüğünün bilinmediği durumlarda geniş bir stimülasyon yaklaşımı gereklidir. TCR stimülasyon sitokin üretimi ve proliferasyonu neden hem TCR aktivasyonu ve costimulation sağlayan anti-CD3/28 boncukkullanılarak taklit edilebilir. Ancak, daha uygun maliyetli bir alternatif PMA ve iyonomisin kullanımı, birlikte geniş hücre içi sitokinlerin sentezi ve salınımına yol sinyal yollarını etkinleştirmek. Özellikle, PMA protein kinaz C aktive (PKC) ve iyonomisin hücre içi Ca^{yükseltir 2 +} iyonları, artan hücre sinyaline yol açan. Sitokinlerin hücre içi içeriğini korumak için, bu stimülasyon etkili protein taşıma inhibitörleri brefeldin A ve monensin ile kombine edilebilir, Hangi Golgi proteinleri blok ve böylece ekstrasellüler salınımını önlemek. PMA/ionomisin kullanımı T hücrelerini uyarmak için iyi kurulmuş bir yöntemdir ve hücre dışı salınımlı ve hücre içi sitokinler arasında güçlü bir korelasyon vardır²⁶. PmA ve iyonomisin ile T hücrelerinin uyarılması da hücre zarına lizom ticaretini artırır ve böylece CD107a hücre içine geri dönüştürülmeden önce hücre yüzeyine geçici olarak entegre olur. Stimülasyon sırasında bir anti-CD107a antikor dahil edilerek, degranülasyon aktivitesi²⁵bir belirteç olarak kullanmak mümkündür.

Bu yöntem, tek hücreli süspansiyon sağlamak için tümörleri hızla sindirir. Bu noktada, bireysel popülasyonlar doğrudan akış sitometrisi için lekelenebilir veya aşağı akım yöntemleri ile saflaştırılmış olabilir: akış destekli hücre sıralama veya manyetik boncuk ayırma. Akış sitometri analizi için tek hücreli süspansiyon hazırlanması, birden fazla bağışıklık hücresi popülasyonları ve bunların fenotipik belirteçlerinin yüksek iş lenme analizine olanak sağlayarak, bağışıklık hücre numarası ve fenotipin doğru bir niceliğini sağlar.

Son olarak, burada açıklanan sindirim protokolü hücre yüzeyi belirteçleri kaybını önler ve bağışıklık hücresi canlılığını korur, bağışıklık hücrelerinin daha fazla hücre saflaştırma adımları ve kültür gerektiği gibi geçmesine izin. Ancak, bu yöntem bu sindirim epitel hücreleri elde etmek için test edilmemiştir.

Ortotopik pankreas tümörleri daha önce¹⁰ olarak açıklanan İngiltere Home Office Hayvan ve Bilimsel Prosedürler Yasası 1986 ve Avrupa Direktifi 2010/63/EU uyarınca oluşturuldu. Tüm fareler, herhangi bir dönemde kilo kaybı (> 72 saat veya % 20' de % 15), piloerection, gözlerin daralması, yürüyüş temalı, kambur görünüm, kanama, kızarıklık ve ülserasyon gibi yara enfeksiyonu belirtileri de dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, perioperatif olarak izlendi. Tümör büyümesi palpasyon ile izlendi ve endpoint bulgularına ulaşılıp ulaşıldığını değerlendirmek için emekli solunum, sarılık ve soğuk ekstremiteler gibi ek klinik bulgular da izlendi. Tüm işlemler steril koşullarda yapılmalıdır. Akış sitometri boyama önce kullanılan tüm reaktifler steril koşullarda hazırlanmalıdır.

1. Enjeksiyon için tümör hücrelerinin hazırlanması

1. -20 °C'den bir bodrum zarı alın ve gece boyunca 4 °C'de buzüzerinde yer alın.
   NOT: Bazal membran konsantrasyonu toplu iş lerden toplu aya değişebilir; bu nedenle, çok özel bazal membran toplu tekrarlanabilirlik sağlamak için in vivo test edilmelidir. Yeni bir bodrum zarı bir gecede 4 °C'de buz üzerinde çözülür ve kullanıcı tanımlı aliquots, buz üzerinde ve daha sonra daha fazla -20 °C'de istenilen kadar saklanır. Bu, bodrum membranı kullanırken pipetleme ve donma-erimeen en aza indirir.
   1. Soğuması için steril PBS'yi bir gecede 4 °C'ye yerleştirin.
   2. Soğuması için steril 200 μL ve 1000 μL pipet uçlarını bir gecede -20 °C'ye yerleştirin.
2. Mikoplazma içermeyen, erime sonrası en az 2-10 pasajda ve hasattan önce büyümenin günlük evresinde yetiştirilen tümör hücrelerini kullanın. Bu protokol kadın murine C57BL/6 KPC kaynaklı hücre hattı kullanır: TB32048 David Tuveson laboratuarı tarafından cömert bir hediye olarak sağlanan.
   1. Tümör hücreleri hasat için gerekli olduğunda, madatodan ortayı çıkarın ve PBS'de iki kez hücreleri yıkayın (önceden 37 °C'ye ısıtın).
   2. 37 °C'de 10 dakika (Bir T175 şişesine, 5 mL ekleyin) şişeye 2x tripsin (önceden ısıtılmış 37 °C'ye) ekleyin.
   3. 10 dakika sonra, şişeye hafifçe dokunarak ve orta derecede iyi yeniden sulandırarak hücreleri şişeye eşit hacimli (%10 FBS, 1x penisilin, DMEM'de 1x streptomisin) ekleyin.
   4. Hücreleri 300 x g ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca bir tüp ve santrifüjiçine aktarın.
   5. Hücre sayma için tam ortamda supernatant ve resuspend hücreleri çıkarın.
   6. 300 x g ve RT 5 dakika için tekrar santrifüj hücreleri, ve supernatant kaldırın.
   7. 1x10⁶ hücre/mL konsantrasyonu elde etmek için önceden soğutulmuş PBS hücreleri resuspend.
      NOT: Bu stok konsantrasyonu 5 μl'de 1000 hücreden oluşan son enjeksiyon konsantrasyonunu elde etmek için hazırlanmıştır. Düşük enjeksiyon hacminde daha az sayıda hücre enjeksiyonunun hücre sızıntısını en aza indirgedi ve bu nedenle tekrarlanabilirliğin arttığını gördük, ancak tümör büyümesi hücre hattına bağımlı olabilir, bu nedenle kullanıcılar her hücre hattını optimize etmelidir.
3. Bunun yanı sıra, bir önceden aliquoted bodrum membran aliquot yerleştirin, buz üzerine, kaputun içine.
   1. Enjeksiyon için hazırlanan PBS'de bazal membran, PBS ve tümör hücrelerinin nihai çözeltisi oranı 5:3:2'dir. Bu nedenle, 500 μL'lik bir bodrum zarına önceden soğutulmuş 1000 μL pipet ucu kullanarak önceden soğutulmuş PBS 300 μL ekleyin.
   2. Pipetlemeen en aza indirmek için doğrudan bodrum membran aliquot PBS ekleyin.
   3. P1000'i 300°L'ye ayarlayın ve PBS ve bazmembranını yeniden askıya alın, sıvı durumda ki bodrum zarını korumak için tüpü buzda tutmayı unutmayın.
   4. P1000 ucundan tüm bodrum membranı çıkarma bittiğinde, herhangi bir bodrum membran / PBS pipet ucu aşağı gelmek için izin vermek için tüp ucu bırakın.
   5. 5-10 dakika sonra, p1000 ucu geri tüp içine daha fazla bodrum membran çıkarmak ve buz üzerinde oturup tüp bırakın.
4. PBS'deki 200 μL'lik resuspended tümör hücrelerini alın ve önceden soğutulmuş 200 μL pipet ucu kullanarak doğrudan bodrum zarına ekleyin.
   1. Önceden soğutulmuş p1000 pipet ucunu alın, pipeti 300 μL olarak ayarlayın ve 30-40 kez yeniden askıya alın. Daha büyük bir pipet ucu, düşük hacimli, bodrum membran ucu kadar seyahat ve resuspension sırasında pipet ucu filtresi dokunabilir gibi tercih edilir.
   2. Tümör hücreleri enjeksiyon için hazır. Ameliyat sırasında tümör hücre/bazal membranı buz üzerinde tutun.

2. Tümör hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu

1. 7 gün boyunca hayvan tesisinde fareler acclimate.
   1. Ameliyattan yaklaşık 2 saat önce, karın ve sırtın sol tarafını tıraş edin, sonra ameliyat öncesi analjezik subkutan olarak boynun scruff altında uygulayın (Buprenorfin 50-100 μg/kg).
   2. Fare yi yatırmak için bir ısı mat ve çevredeki ekipman ve fare üzerinden perdeler ile cerrahi alan hazırlayın. Tüm cerrahi araçları sterilize edin; her fare için yeterli araç kümeleri hazırlayın.
   3. Fareyi % 5 izoflurana O₂ odası ile bilinçsiz olana kadar yerleştirin.
   4. Fare, sırt üstü yatan, bir ısı mat üzerine aktarın ve bir maske kullanarak anestezi korumak, genellikle daha düşük bir 2-3% isoflurane.
   5. Derin anesteziyi onaylayın; arka pati sıkıştıve monitör solunum hızı sabit kaldığında pedal-çekilme refleks kaybı ile tespit edilir.
   6. Sadece tıraş kısmı maruz, perde içinde vücut kapağı. Farenin anestezi maskesinde güvenli bir şekilde olduğundan emin olun.
   7. Steril bir pamuk tomurcuk kullanarak, tıraş alanı üzerinde dairesel bir hareket iyot çözeltisi ekleyin: merkezden başlayarak ve kenarına doğru daire çizerek. Taze pamuk tomurcuk ve iyot ile tekrar işlemi tekrarlayın.
2. Pankreas/dalak yerinin (üst-sol kadranda) hemen üzerinde 1 cm'lik bir kesi yapmak için neşter kullanın. Tercih edilirse kesi yapmak için steril makas da kullanılabilir.
   1. Forceps kullanarak deriyi ayırın. Yeni forceps ile, periton duvarı bulmak ve periton duvarı ile başka bir 1 cm kesi yapmak için makas kullanın.
   2. Dalak ile birlikte gelebilecek pankreası, ikinci çift forceps kullanarak vücuttan ayıklayın.
   3. Yavaşça karıştırmak için tümör hücreleri / bazal membran şişe birkaç kez ters.
   4. Cam şırıngayı, bodrum zarında 1.000 tümör hücresi içeren 5 μL'lik olarak hazırlayın ve ısınması için birkaç saniye ısı minyesine yerleştirin.
      NOT: Şırınganın kısa bir Süre ısınması, sızıntı olmadan enjekte edilmesi daha kolay hale getirmek için bodrum zarının katılaşmaya başlamasını sağlayacaktır. Ancak, bu kısa tutulmalıdır, çok uzun bırakılırsa bodrum membranı tamamen katılaşmak ve enjekte edilmez. Cam şırınga kullanımı, düşük hacimli bir şekilde tam olarak enjekte edilmesine olanak tanır.
   5. Onu uzatmak ve pankreas ın merkezine doğrudan iğne eklemek için kuyruk pankreas tutun, görünür kan damarları önlemek için bir çaba ile pankreas kendisi paralel.
      NOT: Pankreasın merkezi geniş bir alana sahiptir ve enjekte edilmesi en kolay olandır. Ancak, pankreas ın baş veya kuyruk da tercih edilirse özellikle enjekte edilebilir.
   6. Yavaş yavaş pankreas içine bodrum membran 5 μL enjekte ve iğne en az 30 s enjeksiyondan sonra katılaşmak ve sızıntıyı önlemek için izin vermek için pankreasta sabit iğne tutun. Küçük bir berrak kabarcık oluşmuş olacak gibi bodrum membran görünür olmalıdır; ancak, görünür olmayabilir.
      NOT: Tümör hücrelerinin/bazal membranın daha büyük hacimleri enjekte edilebilir; ancak, sızıntı nın oluşmadığından emin olmak için tam hacim test edilmelidir.
   7. İğneyi pankreastan çıkarın ve kanama olmadığını doğrulamak için bekleyin. Yavaşça geri karın boşluğuna pankreas eklemek, bodrum membran kabarcık dokunmamaya dikkat.
   8. Periton duvarını bir araya getirin ve gerekirse tek bir dikiş veya iki dikiş yapın.
   9. Cilt kesiğinin iki tarafını bir araya getirin ve gerektiğinde birden fazla kesilen dikiş yapın veya iki cerrahi klip takın.
3. Scruff içine buprenorfin başka bir deri altı enjeksiyon uyguluyor.
   1. Fareyi ameliyat sonrası en az 30 dakika boyunca ısıtılmış 37 °C'lik bir kafese aktarArak vücut ısısını koruyarak taze bir kafese geri aktarın.
   2. Rehidrasyon ve vücut ağırlığı sağlamak için kafeste bulunan bir püre diyeti hazırlayın.
   3. Tavsiye edilen postoperatif analjeziyi yeniden uygulayın ve yara açma, ağrı veya enfeksiyon ve kilo kaybı belirtileriiçin yakından izleyin. Cerrahi klipsler kullanıyorsanız, bunlar 7-10 gün sonra klip sökücü kullanılarak çıkarılabilir.
   4. Yaklaşık 14 gün sonra skar dokusu karın palpe başlamak için yeterince iyileşmiş olacaktır. Fareler uç noktaya ulaşana kadar palpasyon yoluyla tümör boyutunu yakından izleyin.
   5. Sonunda fare servikal çıkış ve ardından decapitation ile itlaf edilir. Deri ve periton boşluğu makas ve pankreas tümörü ile tümör tutmak için forceps kullanılarak excised ve makas çevreleyen doku kaldırmak için açılır.

3. Pankreas tümörlerinin sindirimi

1. Buz soğuk PBS diseksiyon pankreas tümörü, metastatik site tümörleri veya sağlıklı pankreas dokusu yerleştirin ve buz üzerinde saklayın.
   1. Tümörü Petri kabına aktarmak için keperleri kullan.
   2. 50 mL'lik bir tüpe 5.0 mL sindirim ortamı (2 mg/mL Kollajenaz, 0.025 mg/mL DNase RPMI) ekleyin; enzim aktivitesinin oluşmasını önlemek için buz üzerinde saklayın.
      NOT: Bu protokolde ≥1 ünite/mg FALGPA ve > 125 kollajen sindirim ünitesi (CDU)/mg katı aktivitesi olan Kollajenaz Tip V kullanır. Kollajenaz ve DNase aliquots -20 °C'de saklanabilir ve kullanılmadan önce buzüzerinde çözülebilir. Her ikisi de steril RPMI'de tamamen çözündüğünde, kirletici maddeleri temizlemek için 0,2 μm'lik bir filtreden geçirilebilirler. Kollajenaz, malzeme kaybını önlemek için filtrelemeden önce tamamen çözünmelidir.
   3. Petri kabındaki tümörü örtmek için bu çözeltinin küçük bir aliquot'u alın.
   4. Küçük parçalar halinde tümör kesmek için steril neşter ve forceps kullanın, uzunluğu kabaca daha az 3 mm.
   5. Tümör parçalarını tüpe kazıyın ve tüm parçalar sindirim ortamına batırılana kadar tüpü nazikçe ters çevirin. Diğer tümör örnekleri bir toplu olarak hazırlanması gerekiyorsa buz üzerinde saklayın.
   6. 37 °C'de 20 dakika boyunca sallayarak bir cihaza aktarın. Tümörün tüm parçaları batık ve tüp kenarına sıkışmış değil emin olun. Sallayarak mümkün değilse, o zaman sindirime yardımcı olmak için her 5 dakikada bir örnek girdap.

4. Sindirilmiş tümörden tek hücreli süspansiyon hazırlanması

1. Sindirim adımından hemen sonra, enzim aktivitesini yavaşlatmak için tüpü buza yerleştirin.
   1. 20 mM'lik son konsantrasyonu elde etmek için EDTA ekleyin ve kısa bir süre girdap numunesini karıştırın. Bu enzim aktivitesini daha da yavaşlatacaktır.
   2. Tüpü açın ve taze RPMI orta ile tüp kapağı kapalı herhangi bir tümör sindirmek durulayın.
   3. Buz üzerinde, 50 mL açık bir tüp üzerinde 70 m'lik bir süzgeç (süzgeç boyutu istenildiği gibi değiştirilebilir) hazırlayın.
   4. Önceden orta ile filtre ıslak.
   5. Sindirilmiş hücreleri yeniden askıya alın ve tüpün kenarlarını 25 mL'lik bir şerit veya daha büyük bir şerit kullanarak yıkayın. Şeridin daha geniş açılması kalın sindirim kolayca geçmesi ne izin vermek için önemlidir.
   6. 25 mL'lik şeridi kullanarak tüm sindirimi süzgeçe aktarın.
   7. 1 mL şırınga piston kullanarak filtrenin üstüne tümörü püre. Mash sadece doğrudan yukarı ve aşağı hücrelere kesme stresini en aza indirmek için.
   8. Hücreleri sürekli olarak RPMI ile süzgeçten yıkayın. Hücreleri itmek için yeterli güçle yıkamak için emin olun.
   9. Püre için hala malzeme varsa, ancak RPMI üzerinden floş durur, süzgeç doymuş olacaktır. Bu nedenle, örneği yeni bir filtreye aktarın ve devam edin.
      NOT: Sonunda filtrede yalnızca hücre dışı matris bileşenleri kalır, tüm tek hücreler geçmiş olmalıdır.
2. Tüpü 300 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin.
   1. Hücre peletini tam bir RPMI'de dikkatlice yeniden askıya alın ve yeterli şekilde askıya alınamayan hücre dışı matrisveya büyük hücre kümelerini çıkarmak için doğrudan başka bir filtreden geçirin.
   2. Bu noktada, herhangi bir stimülasyon gerekiyorsa, hemen Adım 6.1 atlayarak akış sitometri analizi için izole hücreleri leke. Alternatif olarak, dondurucu ortamda (FBS'de %10 DMSO) yeniden askıya alın ve -80 °C'de saklayın ve ardından sıvı nitrojende uzun süreli depolama yapın.
      NOT: Donma adımı daha sonraki bir tarihte bağışıklık hücrelerinin arınmasını sağlayabilir; ancak, bağışıklık hücresi alt kümelerinin nicelleştirilmesi, hücre numaralarının ve fenotipin donma/çözülme işleminden etkilenmediğini doğrulamak için optimizasyon gerektirebilir. Ex vivo T hücre stimülasyonu en iyi taze tümör örnekleri üzerinde yapılır. Bu noktada örnek daha boncuk tabanlı ölü hücre kaldırma veya gerekirse bağışıklık hücresi zenginleştirme tahlilleri ile saflaştırılabilir.

5. Ex vivo stimülasyon için hücreleri hazırlama

1. Tam ortamda 2 x 10⁶/ 100 μL konsantrasyonelde etmek için hücreleri sayın (RPMI 10% FBS, 1X penisilin ve 1X streptomisin).
   NOT: Kaplanmış toplam hücre sayısının yüksek olması, bu örnekte analiz edilecek yeterli T hücresi olmasını sağlar. Ancak, sayı, örnek kullanılabilirliğine ve T-hücre ilgi alt kümelerinin nadir doğasına bağlı olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir.
   1. U dipli 96 kuyulu bir plakadaki 100 μL'lik hücre plakası.
   2. PMA/ ionomisin 2x preparat içeren komple orta 100 μL ekleyin (üretici tarafından tavsiye edilen sırasıyla, sırasıyla 0,081 μM ve 1,34 μM nihai konsantrasyonelde etmek için).
      NOT: Degranülasyon/eksoz ölçümü varsa, burada medyada floresan bir anti-mouse CD107a da yer alır. CD107a içermeyen bir denetim örneği de yapılmalıdır.
   3. 37 °C inkübatöre %5 CO₂ ile 1 saat için yerleştirin.
   4. Brefeldin A ve monensin 10x hazırlanmasının 20 μL'sini ekleyin (1,06 μM ve 2,0 μM'lik son konsantrasyonu elde etmek için( üretici nin önerdiği gibi) tam ortamda.
      NOT: Brefeldin A ve monensin protein taşıma inhibitörleridir ve böylece sitokinlerin hücre dışı salınımını engellerler, vb. akış sitometrisi ile saptanmasına izin verilir. ELISA veya benzeri yöntemlerle supernatant içine sitokin salınımını ölçme ise - o zaman bu adım atlanabilir.
   5. Plakayı %5 CO₂ ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin.

6. Akış sitometrisi için hücre dışı ve hücre içi boyama

1. Plakayı çıkarın ve tüm malzemeyi buz üzerine yerleştirilen V dipli bir tabağa aktarmak için her kuyuyu yeniden askıya alın.
   NOT: Epitel hücreleri, makrofajlar ve diğer yapışık hücreler yeniden sulandırılarak tam olarak alınamayabilir. Ancak downstream analizi sadece T hücrelerinde olduğundan, bu bir sorun değildir.
   1. 6.1.1 Plakayı 300 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin (belirtilmedikçe sonraki adımlar için kullanın).
   2. Plakayı tek bir keskin hareketle ters çevirerek süpernatant'ı çıkarın.
2. Buz gibi PBS'de hazırlanan düzeltilebilir bir canlılık boyasının 50°L'sinde yeniden askıya alın. Yeniden askıya alırken, kabarcıklar yapmamak için pipeti daha düşük bir ses düzeyine ayarlayın.
   1. Karanlıkta, 4 °C'de 20 dk kuluçka.
   2. Yıkama adımı: 100 μL FACS tampon, santrifüj ekleyin ve supernatant çıkarın.
3. Facs tamponunda (% 0,5 BSA, PBS'de 2,0 mM EDTA) 50 μL anti-CD16/CD32 (2,5 g/mL) ile her kuyunun fc reseptörlerine spesifik olmayan bağlanmasını engelleyin.
   1. Karanlıkta, 4 °C'de 15 dakika kuluçka.
4. Facs arabelleğifluorochrome-konjuge anti-mouse CD45, CD3, CD4 ve CD8 (daha fazla hücre dışı belirteçleri istenildiği gibi eklenebilir) her iyi iyi mastermix doğrudan ekleyin.
   1. Karanlıkta, 4 °C'de 30 dk kuluçka.
   2. Yıkama adımı: 100 μL FACS tampon, santrifüj ekleyin ve supernatant çıkarın.
5. 100 μL 1x Hücre içi (IC) fiksasyon tamponu ekleyin ve karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   1. Santrifüju RT'de hazırlayın.
6. 100 μL FACS tampon, 300 x g ve RT 5 dakika santrifüj ekleyin ve supernatant çıkarın. 300 x g5 dakika için 1x permeabilizasyon tampon ve santrifüj ile tekrarlayın; sonra supernatant kaldırın.
7. Florokrom konjuge anti-fare IFNγ, TNFα ve 1x permeabilizasyon tamponunda hazırlanmış diğer hücre içi belirteçlerin 50 μL'lik 1x mastermixini ekleyin.
   1. Karanlıkta RT'de 1 saat kuluçka.
   2. Yıkamak için 100 μL permeabilizasyon tamponu ekleyin. Sonra 300 x g ve RT 5 dakika santrifüj ve supernatant çıkarın.
   3. Yıkamak için 100 μL FACS tampon ekleyin, 300 x g ve RT 5 dakika santrifüj ve supernatant çıkarın.
8. Bu son santrifüjden sonra, akış sitometresi için uyumlu bir hacimdeki hücreleri yeniden askıya alın. BU FACS tüplerin boyutuna bağlı olarak değişebilir.
   1. Bu hacmi satın alma için uygun FACS tüplerine aktarın.
   2. Işıktan kaplayın ve buzdolabında saklayın ve numuneleri 24 saat içinde edinin.

Pankreasiçine 1000 TB32048 hücre enjekte ettikten sonra, ortotopik tümörlerin gelişmesi yaklaşık 30 gün sürer (Şekil 1A,B). Ameliyat sırasında ki bazal membran sızıntısı, deri de belirgin bir şekilde görülebilen periton duvarında büyük tümörlerin doğrudan oluşmasına neden olabilir (Şekil 1C). Bu fareleri çalışma dan çıkaracağız. Ancak iyi cerrahi becerilerle sızıntı sıklığı en aza indirilir. Uç noktada hasat edilen ortotopik tümörler C57BL/6 yabani tip farelerde önemli boyutlara kadar büyüyebilir(Şekil 1D). Hasat edilen ortotopik tümörler tek hücreli süspansiyon elde etmek için kollajenaz/ DNase'de 20 dakika sindirimi gerektirir(Şekil 2). Bu noktada, tümör kaynaklı hücreler 2 x 106 hücre/iyi bir U-dipli plaka plakalı olabilir. Kaplanmış hücre sayısı, numune içindeki T hücrelerinin yaygınlığına bağlı olarak değiştirilebilir; T hücreleri yüksek yoğunluktaise hücre numarası düşürülebilir. Kontrol dalak veya lenf düğümü örnekleri de stimülasyon için bu noktada kaplanmış olabilir. Her kuyu PMA ve iyonomisin ile 5 saat süreyle uyarılır ve 1 saat kuluçkadan sonra, sitokinlerin hücre dışı salınımını engellemek için brefeldin A ve monensin eklenir (Şekil 2). Kuluçkadan sonra, akış sitometrisi ile analiz için hücre dışı epitoplar ve hücre içi sitokinler için numuneler lekelenir(Şekil 2).

Ortotopik tümör taşıyan farelerden elde edilen dalak ve tümör örnekleri akış sitometrisi ile incelendi. Dalak ve ortotopik tümörler için akış sitometri analizinde kullanılan gating stratejisi, FSC-A, SSC-A, FSC-A/FSC-H ve SSC-A/SSC-W tarafından doublets kullanılarak enkaz hariç, sonra ölü veya apoptotik hücreler fikse edilebilir canlılık boyaiçin pozitif olarak(Şekil 3A). Bağışıklık hücreleri daha sonra CD45+olarak kaplanır ve T hücreleri cd3+ olarak daha fazla kapılı hangi CD4+ ve CD8+ alt kümeleri tanımlanır(Şekil 3A). Bir floresan eksi bir (FMO) gating için arka plan floresansını belirlemek için yapılır ve bir brefeldin A / monensin sadece kontrol sitokinlerin bazal üretimini belirlemek için yapılır(Şekil 3B-D).

IFNγ için brefeldin A/ monensin ile inkübasyon hem dalak hem de tümör örneklerinde FMO kontrolü üzerinde IFNγ'de artış alamamıştı. Ancak PMA ve iyonomisin eklenmesi hem dalak hem de tümör kaynaklı CD4+ ve CD8+ T hücrelerinde saptanabilen hücre içi IFNa%'sını arttırmıştır.

Pozitif kontrol olarak kullanılan splenik CD4+ ve CD8+ T hücreleri, tümöre sızan T hücre alt kümelerine göre nispeten daha yüksek IFNγ üretimine sahiptir, ortalama 6.60 ± 1.5 % ve 12.97 ± % 3.4 ile karşılaştırıldığında 4.81 ± 1.0 % ve 4.13 ± %1.3 tümör içinde immünsusuyon oluştuğunu gösterir(Şekil 3B ve 4A). TNFα için de aynı stratejiyi kullanarak, yüksek oranda splenik CD4+ T hücrelerinin hücre içi TNFα (e.93 ± %2.3) için pozitif olduğunu, tümöre infiltrasyon yapan CD4+ T hücrelerine (".45 ± %5.4) göre olduğunu gördük. Splenik ve tümöre infiltrasyon sağlayan CD8+ T hücreleri benzer düzeylerde TNFα üretirler (sırasıyla % 25.15 ± 3.7 ve 19.91 ± %5.1)(Şekil 3C, Şekil 4B).

Son olarak, CD107a sitotoksik granüller ve sitokinlerin ekzositoz sırasında hücre yüzeyinde geçici olarak ifade edilen bir endozomal belirteçtir, gibi, sitotoksisite için bir vekil marker olarak kullanılır. Stimülasyon sırasında CD107a için boyama yararı tüm geçici hücre yüzeyi ifade CD107a floresan-antikor tarafından yakalanan olmasıdır. CD107a bazal düzeyleri brefeldin A/ monensin tedavi edilen hücrelerde gösterilir. Splenik CD8+ T hücreleri için, PMA/ iyonomisin ile stimülasyon saptanan CD107a düzeyini artırır,CD8 + hücrelerde en güçlü upregülasyon ile 23.95 ± 3.5% CD107a+idi , tümör efiltrasyon CD8 % 5.8 ± 1.9 ile karşılaştırıldığında+ splenik CD8 gösteren+ degranulation daha yüksek bir oranda vardı. Diğer taraftan, splenik ve tümöre infiltrasyon cd4+ 9.37 ± % 1.5 ve 11.50 ± % (Şekil 3D ve 4C)karşılaştırılabilir düzeyde CD107a ifade etti.

Genel olarak bu sonuçlar ortotopik tümörler pankreas içine tümör hücrelerinin çok düşük sayıda (1.000) enjeksiyonu oluşturulabilir vurgulamak. Bu tümörler hızla ex vivo stimülasyon için T hücrelerinin izolasyon için sindirilir. Hücre içi sitokinlerin saptanması mümkündür ve sekonder lenfoid organlardaki T hücrelerine kıyasla infiltrasyon ağının bazal düzeyini vurgular.

Şekil 1: Ortotopik pankreas tümörlerinin üretimi. (A) In vivo deneylerin programı. (B) Karın boşluğunda (solda) ve eksizyon sonrası (sağda) görülen ve tümörün ikiye bölündüğü ortotopik tümörlerin makroskopik görünümü. (C) Ameliyat sırasında bazal membran sızıntısı nın kanıtlandığı, deriden (üst fotoğraf) görülebilen tümörlerin gelişmesine ve periton duvarında (alt fotoğraf) oluşmasına neden olabilir. (D) Ortotopik pankreas tümörü ağırlıkları uç noktaya ulaşmış farelerden hasat edilir (n=22). Her veri noktası tek bir fareyi temsil eder, çubuk grafik ± SEM anlamına gelir. Bu şekildeki veriler daha önce yayınlanmış çalışma10değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ex vivo T hücre stimülasyonu için ortotopik tümörlerin işlenmesi şeması. Hasattan sonra pankreas tümörleri Kollajenaz (2 mg/mL) ve DNase (0.025 mg/mL) ile 37 °C'de 20 dakika hızla sindirilir. Bunu takiben hücreler tam RPMI ortamlarında 2 x 106/mL'de yeniden askıya alınır ve U dipli bir plakaya kaplanır. PMA ve iyonomisin bir stimülasyon kokteyli 5 saat için eklenir, hangi noktada anti-fare CD107a antikor da kültüre eklenebilir. 1 saat kuluçkadan sonra hücre içi aktarım blokerleri, brefeldin A ve monensin eklenir. Ex vivo stimülasyondan sonra hücreler 20 dk 4 °C'ye fikse edilebilir canlıboya (PBS)ile boyama için v-dipli bir plakaya aktarılır. Hücreler FACS tamponu içinde yıkanır ve anti-CD16/32 (FcR blok) 15 dakika (FACS tampon) için inkübe edilir ve daha sonra ekstrasellüler floresan konjuge antikorlar ile inkübe 30 dakika (FACS tampon). Hücreler FACS tamponu içinde tekrar yıkanır ve 20 dakika hücre içi fiksasyon tamponunda tekrar askıya alınır. Bundan sonra hücreler FACS tamponunda bir kez ve 1x permeabilizasyon tamponunda bir kez yıkanır. Hücreler hücre içi floresan konjuge antikorlarda RT'de 1 saat (1x permeabilizasyon tamponu içinde) için yeniden askıya alınır. Hücreler 1x permeabilizasyon arabelleğinde bir kez yıkanır ve 24 saat içinde akış sitometresini satın almak için FACS arabelleğinde yeniden askıya almadan önce FACS arabelleğinde bir kez yıkanır.

Şekil 3: Ex vivo uyarılmış dalak ve tümör kaynaklı T hücrelerinin akış sitometri analizi. (A) Dalak (pozitif kontrol) ve ortotopik tümör örnekleri için kullanılan akış sitometri gating stratejisi. Hücreler FSC-A/SSC-A kullanılarak enkazdan ayırt edilir ve tek hücreler FSC-A/FSC-H ve SSC-A/SSC-W kullanılarak daha da izole edilir. Ölü veya apoptotik hücreler düzeltilebilir canlılık boya -FVD506 kullanılarak dışlanır ve bağışıklık hücreleri CD45+tarafından kapılı . Bu CD3+ T hücreleri ve CD4+ ve CD8+ alt kümeleri aşağıdaki tanımlanır. Veriler Bir BD Fortessa'dan elde edildi. (B) IFNγ + CD4+ ve CD8+ T hücrelerini ölçmek için kullanılan gating stratejisi. Tam uyarılmış numunelerde (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) arka plan floresansını belirlemek için floresan eksi bir (FMO) kontrolü kullanılır. Bazal sitokin üretimini belirlemek için sadece brefeldin A/monensin kontrolü (sadece B+M) kullanılır. Tam uyarılmış örnek daha sonra % IFNγ+ T hücrelerini hesaplamak için kullanılır. (C) TNFα + CD4+ ve CD8+ T hücrelerini ölçmek için kullanılan gating stratejisi. Arka plan floresanını belirlemek için tam uyarılmış numunelerde (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) FMO kontrolü kullanılır. Bazal sitokin üretimini belirlemek için sadece brefeldin A/monensin kontrolü (sadece B+M) kullanılır. Tam uyarılmış örnek daha sonra % TNFα+ T hücrelerini hesaplamak için kullanılır. (D) CD107a + CD4+ ve CD8+ T hücrelerini tanımlamak için kullanılan gating stratejisi. Arka plan floresanını belirlemek için tam uyarılmış numunelerde (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) FMO kontrolü kullanılır. Bazal degranülasyonu belirlemek için sadece brefeldin A/monensin kontrolü (sadece B+M) kullanılır. Tam uyarılmış örnek daha sonra % CD107a+ T hücrelerini hesaplamak için kullanılır. FlowJo Sürüm 10.6.1'de tüm akış sitometri verileri analiz edildi. Bu şekildeki veriler daha önce yayınlanmış çalışma10değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Ex vivo dalak ve tümör kaynaklı T hücre aktivitesinin nicelleştirilmesi. CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin pozitif oranı (A) IFNγ+ (B) TNFα+ ve (C) CD107a+ ortotopik tümör taşıyan farelerin dalak (n=4) ve tümör (n=7) olarak ölçüldü. Her veri noktası tek bir fareyi temsil eder ve hata çubukları ortalamayı gösterir ± SEM. İstatistiksel anlamlılık * = p<0.05 ve *** = p<0.001 ile eşleşmeyen bir t-testi kullanılarak test edilmiştir. Tüm veriler Prism 8 kullanılarak analiz edildi. Bu şekildeki veriler daha önce yayınlanmış çalışma10değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.