Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

Fareler malignite de dahil olmak üzere insan hastalıklarının incelenmesi için klasik model organizma olarak hizmet vermiştir. Memeliler olarak, insanlarla birçok benzerlikleri vardır. Genetik benzerlik onların yüksek derecede insan hastalıklarının genetik kontrolü içine büyük bir fikir sağlamak için fare genomunun transgenik manipülasyon izin verdi^1. Farelerin kullanımı ve deneyleri konusunda geniş deneyim, biyomedikal araştırmalar için tercih edilen model olmalarına yol açmıştır. Ancak, murine modelleri ile ilgili etik ve bilimsel endişelere ek olarak, onlar da oldukça pahalı ve zaman alıcı olabilir^2,3. Tümörlerin gelişimi haftalar hatta aylar sürebilir. Sadece tipik bir kurumda konut tümörler gelişmekte iken binlerce dolar yüzlerce çalıştırabilirsiniz. Yumurtalık kanseri bu dezavantajı bir örnektir çünkü murine modellerinde büyüme kolayca ay sürebilir. Araştırma ilerleme gecikmeler potansiyel yumurtalık kanseri hastalarının ısrarla düşük 5 yıllık sağkalım oranı sadece% 47 (yani, 30 yıl içinde sadece% 10 sağkalım artışı)⁴etkiler. Benzer şekilde, ürolojik kanserler (böbrek, prostat ve mesane kanserleri) Amerika Birleşik Devletleri'nde tüm kanser vakalarının% 19 ve kansere bağlı ölümlerin% 11^{oluşturmaktadır 4}. Böylece, jinekolojik ve ürolojik kanserleri incelemek için vivo yaklaşımında yeni bir yaklaşım, bu model sadece ilk tarama deneylerine uygulansa bile, bir laboratuvarda önemli ölçüde zaman, emek ve para tasarrufu sağlayabilir. Ayrıca, araştırma bulgularının ortaya çıkan ivme önemli ölçüde bu kanserler yıllık tanısı 177.000 bireyleretkileyebilir.

Tavuk CAM modeli yukarıda belirtilen sorunları ele birçok avantaj sunuyor. Anjiyogenez çalışmak için popüler bir model^5,6, tümör hücre li invazyonu^7,8, ve metastaz^7,9, civciv embriyo CAM modeli zaten kanserlerin birçok formları çalışmak için kullanılmıştır, glioma dahil^10,11,12, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom^13,14, lösemi^15,16, pankreas kanseri¹⁷, ve kolorektal kanser¹⁸. Ayrıca, CAM modelleri nöroblastom için üretilmiştir¹⁹, Burkitt lenfoma²⁰, melanom²¹, ve kedi fibrosarkom²². Önceki çalışmalar da mesane kanseri engraftment sundu²³ ve prostat kanseri hücre hatları²⁴, ancak sınırlı protokol detayları ile. Sadece yumurta farelerden çok daha ucuz, ama onlar da son derece tekrarlanabilir sonuçlar^{üretmek 25,26}. Hızlı vaskülatür gelişimi gösterirler ve tümör engraftment birkaç gün gibi hızlı bir şekilde oluşabilir ve açık pencereden uzunlamasına görselleştirilebilir. Yumurta döllenme ve kuluçka arasında 21 günlük zaman dilimi ile, deneyler birkaç hafta içinde tamamlanabilir. Ayrıca, düşük maliyet, sınırlı konut ihtiyaçları ve küçük boyut kolayca fare çalışmaları için engelleyici olacaktır büyük ölçekli deneyler izin verir.

Bu nedenle, jinekolojik ve ürolojik kanserlerin engraftment için CAM modeli optimize etmek için çalıştı. Erken tavuk embriyosu²⁷immünazdurumu nedeniyle, hem fare hem de insan hücreleri kolayca implante edilebilir. Bu nedenle, biz başarıyla yumurtalık, böbrek, prostat ve mesane kanserleri engrafted var. Bu tümör tiplerinin her biri için, CAM kolayca kurulan murine ve / veya insan tümör hücre hatları kabul eder. Daha da önemlisi, taze hasat birincil insan tümör dokuları da ya sindirilmiş hücrelerden veya başarı oranı yüksek katı doku parçaları engraft olabilir. Bu kanser türlerinin ve hücre kaynaklarının her biri optimizasyon gerektirir, burada paylaştığımız.

Burada sunulan tüm deneyler Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Deidentified, primer insan tümörlerinin kullanımı UCLA Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (Protokol numaraları 17-000037, 17-001169 ve 11-001363). UCLA anda, Hayvan Araştırma Komitesi inceleme tavuk embriyoları kullanarak deneyler için gerekli değildir; protokol onayı sadece yumurtadan çıktığında gereklidir. Ancak, hayvanların ötenazi için AVMA Yönergeleri gibi en iyi uygulamalar, etik tavuk embriyoları işlemek ve mümkün olduğunca ağrı önlemek için kullanılmıştır. Araştırmacılar CAM modelleri kullanarak çalışmalar başlamadan önce kendi kurumunda gözetim gereksinimlerini doğrulamak için teşvik edilmektedir.

1. Yumurtaların hazırlanması

1. Yumurtaları almadan önce, yumurta kuluçka makinesini üreticinin talimatları doğrultusunda %60-70 nem oranıyla 37,8 °C 'ye (100 °F) kadar birleştirin.
   NOT: Kontaminasyon risklerini en aza indirmek için, nemi kontrol etmek için otoklavlı su kullanılabilir.
2. Döllenmiş aldıktan sonra, Rhode Island Kırmızı tavuk yumurtası sertifikalı bir laboratuvar sınıf yumurta tedarikçisi, kağıt havlu ile kabukları yüzeyini kuru silin. Hafifçe nemlenmiş kağıt havlu, yapıştırılan malzemeyi çıkarmak için kullanılabilir. Hemen kurulayın.
   NOT: Kabuğu 43.3 °C'nin altındaki sıvı ile ıslatmak yumurtaya bakteri sokabilir. Yumurtaları yıkamayı veya dezenfekte etmeyi tercih ederseniz, sıvının sıcaklığı 43.3-48.9 °C arasında olmalıdır. Yüksek sıcaklıklar yumurtaları kaynatabilir. Dezenfektan seçimi endişeye neden olan mikroorganizmalara göre yapılmalıdır.
3. Yumurtanın üzerindeki tarihi etiketlemek için bir kalem veya işaretleyici kullanın. Bu geliştirme gün 0 olarak kabul edilir.
4. Yumurtaları yumurta kuluçka makinesine yerleştirin ve CAM gelişimine izin vermek için en az 7 gün boyunca kuluçkaya yatırın. Otomatik bir rotator kullanılabilir veya yumurtalar günde 180° 2-3x döndürülebilir.

2. Yumurta açma

NOT: YUMURTALARIN aÇILIŞI CAM tam olarak geliştirildiğinde yapılmalıdır. Bu genellikle geliştirme gün 7 veya 8.

1. %70 etanol ile bir biyogüvenlik kabinini dezenfekte edin. Benzer şekilde dezenfekte ve biyogüvenlik kabine bir yumurta raf, yumurta mumlayıcı, marker, akülü döner alet silikon karbür taş ve dairesel kesme tekerleği ile yerleştirin, 18 G iğne, çeyrek inç vakum boru ile pipet denetleyici, ambalaj bant, ofis makas, kavisli makas, Semken (veya benzeri) forceps, pamuk topları ve 6 x 7 cm şeffaf film pansuman. Mümkün olduğunda steril, tek kullanımlık veya otoklavlı aletler kullanın.
2. Yumurta rotatorunu kapatın. Yumurta rafüzerinde biyogüvenlik kabine içine yaklaşık 1-3 yumurta yerleştirin. Karanlıkta iken, hava hücresini tanımlamak için yumurta kabuğu na yumurta mum yerleştirin. Hava hücresinin yerini işaretleyin.
   NOT: Yumurta mumunun aydınlatma yoğunluğu yumurtanın içini görselleştirmek için çok önemlidir. Hava hücresi veya vaskülatür sürekli görmek zor ise, yumurta mum pilleri değiştirmeyi deneyin.
3. Büyük bir kan damarı ağı bulmak için kabuk üzerinde yumurta mum hareket ettirin. Gerekirse yumurtayı döndürün. İdeal bir damar yumurtanın ortasına yakın dallanma olacaktır. İmplantasyon için kullanılacak vaskülatür üzerine çizmek için bir marker kullanın.
4. Kaputun ışığını aç. Silikon karbür öğütme taşile donatılmış kablosuz döner bir alet kullanarak, doğrudan hava hücresinin merkezi üzerinde kabuk küçük bir delik matkap. Kabuğun çoğu çıkarılana kadar matkap, ancak beyaz, iç membran bozulmamış.
   NOT: Vaskülatür hedeflemeden önce hava hücresi üzerinde sondaj cam ve vaskülatür yerine hava hücresi üzerinde o özel yumurta kabuğu kalınlığı belirleme izin verir. CAM veya vaskülatür bozulursa, yumurta implantasyon için kullanılmaz.
5. Matkap ve vasküler pencere hava hücresi için yapıldığı gibi açılacak başka bir küçük delik açmak (adım 2.4).
6. 18 G iğne kullanarak, hafifçe hava hücresi ve vaskülatür üzerinde beyaz, iç membran delin. Kabuğun içine giremiyorsa, dikkatlice biraz daha delin. Beyaz, iç zarın (CAM hariç) delinmiş alanın tamamı boyunca bozulduğunu sağlayın. Membran parçasının çıkarılması gerekli değildir.
   NOT: Bu adımda CAM veya vaskülatür bozulursa, yumurtayı atın. Delinmiş bir delikten kan veya albumin sızıntısı varsa hasar belirgindir.
7. Kaputun ışığını kapat. Yumurta mumlayıcıkullanarak, hava hücresinin yumurtanın ucundan vaskülatür üzerindeki alana aktarıldığını doğrulayın. Gerekirse, vakum borusunun orijinal hava hücresi üzerinde deliğin etrafına bir pipet denetleyicisine yerleştirilmesini ve hava hücresini hareket ettirebilmek için hafifçe kısa patlamalar halinde emmeuygulayın.
8. Hava-CAM sınırıiçinde yaklaşık 0,5 cm hava hücresinin yeni konumunu ana hatlarını vermek için bir işaretçi kullanın. Yeni hava hücresinin üzerine bir parça ambalaj bandı yapıştırın. Gerekirse, bandı uygun boyuta küçültmek için standart ofis makası kullanın.
   NOT: Bant kabuk üzerinden hava akışını bozabilir ve hava hücresini tam olarak kapatmak için gerekenden daha büyük olmamalıdır.
9. Yeni hava hücresi yukarı bakacak şekilde dönmeden ısınmak için yumurtaları kuvöze geri döndürün. Kalan yumurtaların açılması için 2.2-2.9 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. CAM geliştirme kalitesinden emin değilseniz, yumurta az sayıda kalan yumurta açmadan önce adım 2.16 ile devam etmelidir.
10. Biyogüvenlik kabininde yumurta rafÜzerine taşınan hava hücreleri ile yaklaşık 1-3 yumurta yerleştirin.
    NOT: Açılan yumurtaya kontaminasyon uymasını önlemeye özen gerekir. Bu nedenle, her zaman bir biyogüvenlik kabini içinde yumurta açın ve steril araç ve ekipman mümkün olduğunca kullanın.
11. Dairesel kesme tekerleği ile donatılmış bir akülü döner alet kullanarak, adım 2.8 çizilmiş hava hücresi sınırı üzerinde küçük bir çizgi kesti. Cam veya vaskülatür bozmasını önlemek için gerçek hava-CAM sınırı içinde yaklaşık 0,5 cm olduğundan emin olun. Kabuğu tamamen kesin ama CAM veya vaskülatür bozmak için yeterince derin nüfuz için dikkatli olun.
12. Kavisli makas kullanarak, kabuk bir pencere oluşturmak için kalan hava hücresi etrafında kesti.
    NOT: Çıkarılan kabukta kan veya zar varsa, yumurta implantasyon için uygun değildir. Yumurtaların yüksek bir oranı temiz açılmamışsa, daha iyi CAM oluşumuna izin vermek için kalan yumurtaları açmak için en az 1 gün daha beklemeyi düşünün. Kalan yumurtaların kabukları delinmediyse, kuluçka makinesiiçindeki yumurtaların dönüşüne devam edilmelidir.
13. Embriyonun canlılığını doğrulayın. Canlı embriyolar geniş vaskülatür, berrak albumin, embriyo hareketi veya görünür bir kalp atışı görüntüler.
14. Semken forceps kullanarak, steril bir pamuk topu küçük pamuk parçaları çekin. Kabuk tozunu ve enkazını temizlemek için CAM yüzeyini yavaşça temize çıkarın.
    NOT: Enkazın çıkarılması, yumurtaların açıldığı gün yapılmalıdır.
15. Kabuk açıklığını, 6 x 7 cm şeffaf film pansumanının dörtte biri ile kapatın.
16. Yumurtaları kuvöze geri ver. Yumurtanın açılan pencere yukarı bakacak şekilde güvenli bir şekilde oturur ve CAM'in şeffaf film pansumanına dokunmadığından emin olun. Yumurta raf bir parça kullanın, yumurta rotator kenarı, ya da haddeleme tutmak herhangi bir yumurta prop için başka bir uygun öğe.
17. Kalan tüm yumurtaların açılması için 2.10-2.16 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Yumurtaların açılmasının implantasyonla aynı gün tamamlanması gerekmez. En az 1 gün beklemek, kabuğu açarak canlılığı tehlikeye düşen yumurtaların ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilir.

3. Kanser hücresi süspansiyonunun transplantasyona hazırlanması (seçenek 1)

NOT: Bu işlem, ideal olarak 7 ile 10 arasında gerçekleşmesi gereken implantasyondan hemen önce tamamlanmalıdır. İmplantasyon tarihi yle ilgili daha fazla bilgi için lütfen adım 5 veya 6'nın başındaki notlara bakın. Bu yaklaşım tüm hücre hatları ve kültürlü böbrek kanseri tümör sindirim için kullanılmıştır.

1. Ekstrasellüler matriks çözeltisini buz üzerinde erit.
2. Mekanik ve/veya enzimatik sindirimi kullanarak, yerleştirilen hücre tipine uygun bir yöntem kullanarak tek hücreli süspansiyon elde edin.
3. İmplantasyon için uygun bir ortama yerleştirilmesi gereken toplam hücre sayısını yeniden askıya alın. Yumurta başına 1-2 x 10⁶ hücreli implantlar tipiktir.
   NOT: Hücre hatlarının implantasyonu için kullanılan ortam genellikle FBS veya serum replasmanı içeren hücreleri birliğe yerleştirmek için kullanılan tam bir ortamdır. Tümör sindirim implantasyonu genellikle aynı kanser türü hücre hatları kültüriçin kullanılan tam orta kullanır. Ancak, deneysel olarak gerekirse orta formülasyonda ayarlamalar yapılabilir. Tümör gelişimi ve büyümesi üzerindeki etkileri ampirik olarak belirlenmelidir.
4. Kullanılan hücreler için uygun bir santrifüj hız ve zaman kullanarak hücreleri pelet. Tipik hızları 250-300 x g,ve süreleri 5-10 dk.
5. Borulama ile peletli hücrelerden supernatant çıkarın. Mekanik fiske veya borulama yoluyla artık ortamda hücreleri yeniden askıya. Soğuması için buzüzerine yerleştirin. Uygun büyüklüktebir pipet kullanarak hücrelerin ve ortamın hacmini ölçün.
6. 1-2 x 10⁶ hücrenin yumurta başına 20-100 μL hacimde, son hücre dışı matriks konsantrasyonu 2,7-4 mg/mL proteinle implantasyon hacimlerini hesaplayın. Bu hesaplamaya göre orta, istenilen büyüme faktörleri veya katkı maddeleri ve hücre dışı matris çözeltisi ekleyin. Yerleştirmeye hazır olana kadar buzda tutun.
   NOT: 3.3 ve 3.6 adımlarında yapılan hesaplamalar için, gruptaki tüm yumurtalar için yeterli hacim sağlamak için en az bir buçuk yumurta implantı hacmi eklenmelidir. Yumurtalık kanseri hücre hatlarının (yani, SKOV3 ve ID8) implantasyonu için yumurta başına 10⁶ hücre yerleştirildi. Renal hücreli karsinom hücre hattı RENCA implantasyonu için, sindirilmiş birincil insan renal hücreli karsinom dan elde edilen kültürlü hücreler, prostat kanseri hücre hatları (yani, CWR, C4-2, ve MyC-CaP) ve mesane kanseri hücre hatları (yani, HT-1376 ve T24), 2 x 10⁶ hücre implante edildi.

4. İmplantasyon için tümör parçalarının hazırlanması (seçenek 2)

NOT: Bu işlem, ideal olarak 7 ile 10 arasında gerçekleşmesi gereken implantasyondan hemen önce tamamlanmalıdır. İmplantasyon tarihi yle ilgili daha fazla bilgi için lütfen adım 5 veya 6'nın başındaki notlara bakın. Primer yumurtalık ve mesane kanserleri tümör parçaları olarak implante edildi.

1. Buz üzerinde hücre dışı matris çözeltisi çözül. İstenilen büyüme faktörleri veya katkı maddeleri içeren uygun bir ortamda 2.7-4 mg/mL nihai protein konsantrasyonuna seyreltin. Buzda kal.
   NOT: Tümör parçalarının implantasyonu genellikle aynı kanser türü hücre hatları nın culturing için kullanılan tam orta kullanır. Ancak, deneysel olarak gerekirse orta formülasyonda ayarlamalar yapılabilir. Tümör engraftment ve büyüme üzerindeki etkileri ampirik olarak belirlenmelidir.
2. Bir neşter veya makas kullanarak, taze tümör parçaları çıkarmak. İdeal boyutlar her iki tarafta 2-5 mm arasında değişir. Dokuları implanta hazır olana kadar ortama daldırın.

5. Yapışmaz halka kullanılarak implantasyon (seçenek 1)

NOT: Kam tam olarak gelişmişse hücreler gelişim gününden itibaren 7'den itibaren implante edilebilir. İmplantasyon tümör gelişimi ve istenen deney için yeterli zaman sağlar kuluçka önce herhangi bir zamanda oluşabilir, ancak embriyobağışıklık hücreleri gün 10 postfertilizasyon²⁷civarında mevcut başlar unutmayın. Tümör büyüme hızı hücre tipine göre önemli ölçüde değişir ve ilgi hücre tipi için ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Yumurtalık kanseri ve prostat kanseri hücreleri yapışmaz halka yöntemi kullanılarak implante edildi. Yapışmaz bir halka olmadığında, pipet ucunun benzer boyutta kesilip kullanılabileceğini unutmayın.

1. Bir biyogüvenlik kabini ve gerekli tüm araçları dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın: bir yumurta raf, kavisli iris forceps, yapışmaz halkalar (1/ 4 inç iç çapı), cam karıştırmak çubuk, uygun hacim pipetler ve ipuçları, 6 x 7 cm şeffaf film pansuman, ofis makas ve marker veya kalem. Mümkün olduğunda steril, tek kullanımlık veya otoklavlı aletler kullanılmalıdır.
2. Yumurtaları bir biyogüvenlik kabinine yumurta rafına yerleştirilecek şekilde yerleştirin. Yönetilebilir sayıda yumurta seçin. Altıya kadar tipiktir. Onlarla çalışırken yumurta önemli ölçüde soğumasını izin kaçının.
3. Saydam film pansumasını kabuktan çıkararak kenarları açık pencereye doğru yuvarlayArak kabuk parçalarını çekmeyi önleyebilirsiniz. Yumurtalar uygun ve sağlıklı olup olmadığını kontrol edin. İdeal yumurta, açılan alanın merkezinde büyük bir kap ve ondan dallanacak daha küçük kaplar olacaktır.
4. Kavisli iris forceps kullanarak, ideal bir dal noktası üzerinde, geminin üzerinde CAM üzerine steril, yapışmaz halka yerleştirin. CAM'i hafifçe aşındırmak için steril cam bir karıştırma çubuğu kullanın.
5. 3.6 adımdan hücre süspansiyonuna yapışmaz halkanın ortasına boru layın. Alternatif olarak, 4.2.
6. 6 x 7 cm şeffaf film pansuman dörtte biri ile açılış mühür. Yumurtaları uygun bir implant adı ile etiketle.
   NOT: Bir grup içindeki yumurtaların numaralanması uzunlamasına gözlemleri kolaylaştırır.
7. Yumurtayı kuvöze geri ver. Kabuğun açılmasının dik olduğundan ve yumurtanın güvenli olduğundan emin olun.
   NOT: Yumurtalar rotasyon suz bir yumurta kuluçka makinesine geri döndürülebilir. Alternatif olarak, yüksek postimplant canlılığı CO₂ devre dışı bırakılmış 37-38 °C hücre inkübatörü ve nem izlemek için bir higrometre ile elde edilebilir, hangi olmalıdır 50%-80.%

6. Yapışmaz halkasız implantasyon (seçenek 2)

NOT: Kam tam olarak gelişmişse hücreler gelişim gününden itibaren 7'den itibaren implante edilebilir. İmplantasyon tümör gelişimi ve istenen deney için yeterli zaman sağlar kuluçka önce herhangi bir zamanda oluşabilir, ancak embriyobağışıklık hücreleri gün 10 postfertilizasyon²⁷civarında mevcut başlar unutmayın. Bu yöntem renal hücreli karsinom hücrelerinin ve mesane kanseri hücrelerinin implante sında kullanılmıştır.

1. Bir biyogüvenlik kabini ve gerekli tüm araçları dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın: uygun hacim pipetler ve ipuçları, steril 10 cm doku kültürü yemekleri, yumurta raf, 6 x 7 cm şeffaf film pansuman, ofis makası ve marker.
2. Adım 3.6'da üretilen hücre süspansiyonunun aşı hacmini uygun büyüklükte ki pipet ucuna aspire edin (200 μL tipiktir). Ucun üst kısmını tutarken, pipet ucunu dikkatlice çıkartın ve yatay olarak steril, 10 cm'lik doku kültürü yemeğine yerleştirin.
3. Her grup için bir tabak ile bir grup içindeki tüm örnekler için adım 6.2'yi tekrarlayın.
4. Hücre dışı matrisin kısmen polimerize olmasını sağlamak için ipuçlarını 15-30 dakika boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin.
5. Kuluçka 15 dakika sonra, polimerizasyon için kontrol başlar. Az miktarda sıvı genellikle çanak üzerine yerleştirildiğinde ucundan dışarı sızar. Bu sıvının polimerizasyonu, uç içindeki sıvının polimerizasyon derecesini tahmin etmek için kullanılabilir.
6. Yumurtaları bir biyogüvenlik dolabına bir yumurta rafına yerleştirilecek şekilde yerleştirin. Yönetilebilir sayıda yumurta seçin. Altıya kadar tipiktir. Onlarla çalışırken yumurta önemli ölçüde soğumasını izin kaçının.
7. Kenarları açık pencereye doğru yuvarlayarak şeffaf film pansumanını kabuktan çıkarın. Bu, kabuk parçalarını çekmeyi önler.
8. Yumurtalar uygun ve sağlıklı olup olmadığını kontrol edin. İdeal yumurta, açılan alanın merkezinde büyük bir kap ve ondan dallanacak daha küçük kaplar olacaktır.
9. Uygun büyüklükteki bir pipetüzerine bir pipet ucu yerleştirin. Kısmen polimerize hücre süspansiyonuna cam üzerine büyük, iyi gelişmiş bir kap üzerinde, ideal olarak bir dal noktası üzerinde zorlamak için pistonu bastırın.
10. 6 x 7 cm şeffaf film pansuman dörtte biri ile açılış mühür.
11. Yumurtayı uygun bir implant adı ile etiketleyin.
    NOT: Bir grup içindeki yumurtaların numaralanması uzunlamasına gözlemleri kolaylaştırır.
12. Yumurtayı kuvöze geri ver. Kabuğun açılmasının dik olduğundan ve yumurtanın güvenli olduğundan emin olun.
    NOT: Yumurtalar rotasyon suz özel bir yumurta kuluçka makinesine geri döndürülebilir. Alternatif olarak, yüksek postimplant canlılığı CO₂ devre dışı bırakılmış 37-38 °C hücre inkübatörü ve nem izlemek için bir higrometre ile elde edilebilir, hangi olmalıdır 50%-80.%

7. Ateş böceği luciferase işaretli tümörlerin biyolüminesans görüntüleme

NOT: İmplante edilen hücreler ateş böceği luciferase veya diğer görüntüleme faktörlerini kodlayan gen ile stably transize edilmişse, ortaya çıkan tümörler biyolüminesans görüntüleme kullanılarak görselleştirilebilir. Floresan görüntüleme yumurta kabuğundan yüksek arka plan nedeniyle bozulmamış yumurta tavsiye edilmez. Bu uç nokta analizidir, çünkü kabuğun açılması hayatta kalmayı büyük ölçüde azaltır. Tümörler deneysel ihtiyaçlar ve tümör büyüme hızı için uygun herhangi bir zamanda görüntülenebilir. Ancak, ortalama olarak, yumurta lar 21 gün sonra döllenme sonrası yumurtadan çıkarlar. Bu nedenle, geliştirme gün 18 istenmeyen kuluçka önlemek için uygun bir bitiş noktasıdır.

1. Gerekirse yumurtaları görüntüleme tesisine taşıyın. 10 cm doku kültürü yemekleri üzerine bant yumurta. 37.8 °C (100 °F) yumurta kuluçka makinesine geri döndürün ve dönüş mekanizması çıkarılabilir veya devre dışı bırakılır. Nem taşıma ve görüntüleme için çok önemli değildir.
2. Kavisli iris forsepsi kullanarak CAM'i albumin ve embriyo yla temize çıkarana kadar cam'ı kabuğundan hafifçe itin. Geniş uçlu numune forsepsleri kullanarak, tümör görselleştirme için yeterli kabuk açıklığı genişletmek için kabuk parçaları kırmak.
3. Yumurta albuminine en az 50 mg/mL D-luciferin enjekte edin. Benzer bir D-luciferin hacmi de yapışmaz halka içine veya implante hücreleri içeren alanda CAM yüzeyine borulu olabilir. Bu ideal bir vasküler kaynağı yokluğunda optimum biyolüminesans sağlar. 8 dakika kuluçka.
4. Yumurtayı anestezik yumurtanın albuminine 20-50 μL isofluran enjekte edin. Ek bir 2 dakika için kuluçka, alternatif olarak, yumurta içeren bir indüksiyon odasına yerleştirilebilir 2-2.5% buharlaşmış isoflurane. Embriyonik hareket sona erdiğinde yeterli anestezi derinliği elde edilir.
   NOT: Yumurtanın ötenazisi için daha büyük hacimlerde izofluran (100°L) kullanılabilir.
5. Üreticinin talimatlarıyla belirlenen uygun ayarları kullanarak yumurtaları bir biyolüminesans görüntüleme cihazına ve görüntüye yerleştirin. Bu çalışmada 1 dk maruz kalma süresi kullanılmıştır.
6. Kalan CAM ve embriyo görüntü için, 10 cm doku kültürü çanak içine yumurta açın.
   1. Yumurtanın ortasına yakın bir yerde iki elin parmaklarıyla yumurtayı ve kabuğun açılmasının her iki tarafındaki başparmakları kavrayın.
   2. Yavaşça parmakları ile yumurta içine bastırırken başparmak ile yumurtanın iki yarısı çekin.
   3. Kabuk CAM ve embriyo dan yaklaşık yarısı ayrılmış olduğunda, 10 cm doku kültürü çanak üzerinde baş aşağı yumurta çevirin.
   4. Kabuk yarılarını ayırmaya devam edin. CAM kabuğun içine yapışırsa, CAM'i kabuktan uzaklaştırmak için parmakları hafifçe kullanın.
   5. Embriyo istenirse başka bir tabağa çevrilebilir.
   6. Gerekirse, ek isoflurane adım 7.4 olarak verilebilir.

8. Tümör hasat

NOT: Tümörler deneysel ihtiyaçlara ve tümör büyüme hızına uygun herhangi bir zamanda hasat edilebilir. Ancak, ortalama olarak, yumurta lar 21 gün sonra döllenme sonrası yumurtadan çıkarlar. Bu nedenle, geliştirme gün 18 istenmeyen kuluçka önlemek için uygun bir bitiş noktasıdır.

1. Tümörü forceps ile kavrayın. Makas kullanarak (bahar iris makas iyi çalışır) veya bir neşter, cam dikkatle çıkarmak tümör.
2. Tümör ateş böceği luciferase geni ile transize edilmişse, görüntülemesi zor tümörlerin başarılı bir şekilde çıkarılmasını doğrulamak için regörüntüleme yapılabilir.
   NOT: Eksileri olan tümörler belirli bir deneyiçin uygun herhangi bir yöntemle analiz edilebilir. Tümörler cam veya farelere yeniden implante edilebilir. Tümör kimliğini doğrulamak için tümörler düzeltilebilir, parafin gömülü olabilir ve hematoksilin ve eozin veya immünohistokimyasal boyama ile incelenebilir.

Şimdiye kadar, biz yumurtalık, böbrek, prostat ve mesane kanserleri için başarılı olması implantasyon bu yöntemi bulduk. Her biri implantasyon için belirli koşulları belirlemek için optimize edilse de, esneklik olabilir. Test edilen tümör tiplerinden yumurtalık kanseri büyümesi çok daha az belirgindi ve genellikle biyolüminesans görüntüleme yardımı olmadan görülemese de(Şekil 1). Ancak, CAM sertleşme implantasyon alanında forceps ile hissedilebilir. Bu biyolüminesans görüntüleme yokluğunda olası tümör büyümesini belirlemenize yardımcı olabilir, daha fazla doğrulama histoloji veya başka bir uygun yöntem ile gerekli olsa. Diğer in vivo modellerde görülen morfolojileri gösteren insan ve murin hücre hatlarının başarılı bir şekilde engraftment elde ettik(Şekil 1A ve 1B). Buna ek olarak, tümör parçalarının implantasyonu mümkün oldu(Şekil 1C, mavi ok tümörü gösterir). Bu durumda implante tümör yüksek dereceli, metastatik, yumurtalık seröz karsinomu olan bir hastadan geldi. Ortaya çıkan tümörler morfolojik olarak menşe tümörlerine benzemektedir ve sitokeratin 8/18 gibi cam ve tavuk embriyonik dokularından ayırt edilmelerine izin veren insana özgü proteinleri ifade ederler.

Tümör engraftment ve büyüme optimize ederken, uygun büyüme faktörleri veya hormonlar implantasyon sırasında eklenebilir. Örneğin, implantasyon sırasında insan foliküluyarıcı hormonunun (FSH) üç ünitesi (U) ile takviye edildiğinde, tümör boyutunda (total radiance akısı ile ölçüldüğü gibi) ince ve önemsiz bir artış gözlenmiştir (Şekil 1D). Yumurtalık kanseri büyümesi için FSH seçimi ID8 hücrelerinde FSH reseptörü ekspresyonu ve FSH yüksek düzeyde genellikle postmenopozal kadınlarda bulunan, yumurtalık kanseri vakalarının çoğunluğunu oluşturan kaynaklanıyor. Benzer yaklaşımlar CAM modelinin yarar geliştirmek için diğer zor kanser türleri için kabul edilebilir. Ayrıca, FSH sadece hücre implantasyonu sırasında eklenmiştir. Büyüme faktörü veya hormonun yenilenmesi, katkı maddesinin uygun miktarda, etkisini artırabilecek, yapışmaz halkaya uygun miktarda boru ile gerçekleştirilebilir.

Böbrek kanseriiçin RENCA gibi yerleşik hücre hatlarından 2 x 106 berrak hücreli renal hücreli karsinom hücrelerinin implantasyonu hızlı, sağlam tümör oluşumu nu ortaya çıkarmış olsa da, düşük hücreli dozlarda da kullanılabilir(Şekil 2A, 10 gün postimplantasyon). Ortaya çıkan tümörler morfolojik olarak vivo modellerde standart fare ile elde edilen tümörlere benziyordu28. Renca hücrelerinin firefly luciferase ile işaretlenmiş implantasyonu biyolüminesans görüntülemeizin. Primer insan tümörleri de implante edilebilir. Tümör parçaları devam etti ve önemli bir büyüme göstermeden vaskülatür işe. İn vitro olarak genişletilen primer, berrak hücreli renal hücreli karsinomdan kaynaklanan sindirilmiş hücrelerin implantasyonu, kurulan hücre hatlarına benzer şekilde büyüdü(Şekil 2B). Renal hücreli karsinom hücreleri yapışmaz halka yöntemi veya yapışmaz halka olmadan yöntem kullanılarak tohumlanabilir.

Birden fazla insan ve murine prostat kanseri hücre hatları CAM engraftment için test edildi(Şekil 3). Her biri 2 x 106 hücre yapışmaz halka kullanılarak implante edildiğinde iyi büyüdü. Ortaya çıkan tümörlerin histolojik değerlendirilmesi her hücre hattı için beklentiler ile tutarlıydı. Ayrıca, firefly luciferase ile işaretlenmiş hücrelerin implantasyonu biyolüminesans görüntüleme ile tümör tanımlaması na izin verebilmiştir(Şekil 3A).

Mesane kanseri CAM modelinde kurulan hücre hatları ve primer insan dokusu parçalarından kurulmuştur(Şekil 4). Hücre hatları yapışmaz halka olmadan 2 x 106 hücre ile implante iyi büyüdü(Şekil 4A ve 4B),halka ile implantasyon başarılı olmasına rağmen. Primer insan tümörü doku parçalarından implante edilebilir(Şekil 4C). Sunulan olgu yüksek dereceli, kas dışı invaziv, ürotelyal karsinomu olan bir hastadan ortaya çıkmıştır. Devam eden tümör sindirim optimizasyonu nedeniyle sindirilmiş hücrelerin implantasyonu henüz denenmemiştir. Ortaya çıkan CAM tümörlerin kanser hücreleri orijinal tümörün morfolojisi muhafaza, ancak değişmiş bir stromal bileşeni ile. Tümör büyümesi renal hücreli karsinom ve prostat kanseri için daha az oldu, ama yine de kolayca görülebilir.

Son noktada yüksek sayıda uygulanabilir, güvenilir yumurta sağlamak için, kuluçka ve yumurta açarken dikkatli olunmalıdır. İmplantasyondan önce veya sonra inkübatör koşulları yetersiz ise, embriyonun canlılığı tehlikeye atılabilir. Önemli embriyonik ölüm oluşursa, üreticinin talimatlarına göre kuvöz koşullarını giderin. Deneyimlerimize göre, sıcaklık ve nem stabilitesi tam değerlerinden daha önemli görünün. Bu nedenle, değiştirilmiş, hücre kültüründe aşılanmış yumurtakuluçka, CO2 kuluçka nem kontrol su doldurmak için daha sık açılması gereken küçük, özel yumurta kuluçka yumurta istinat üzerinde üstün canlılık elde bulundu. İnoculated yumurtatümör muayenesi için kaldırılır sıklığı en aza indirmek de embriyo canlılığını artırabilir.

CAM implantasyonunun bir diğer endişesi de CAM'in aşılamadaki bütünlüğüdür. Cam kabuğu açtıktan sonra sağlam değilse, yapışmaz halka ve implante hücreler embriyonun albuminiçine batar (adım 2.12'den sonraki nota bakın). Bu kanser hücresi dağılımneden olur. Bazı tümörler hala oluşabilir, ancak yumurtalık kanseri gibi komşu kanser hücrelerinden önemli büyüme ve sağkalım sinyali alan kanserler, bu koşullar altında güvenilir bir şekilde tümör oluşturmaz. İmplantasyon için yapışmaz halkalar kullanılırsa, CAM'in arızası yüzüğün albumine batırılmasıyla tanımlanabilir. Bu durum, halka ve implante edilmiş hücrelerin embriyonik hareketle yumurtanın dibine taşındığı durumlardan ayırt edilmelidir. Bu gibi durumlarda, halka CAM ve kabuğun alt arasında bulunacaktır. Embriyonik hareket kontrol edilemez. Ancak, halka yerleşimi embriyonun implante edilen hücreleri bozmasını zorlaştırabilir. Adım 2.7'de oluşturulan hava ceninin kenarlarına yerleştirilen halkaların, alanın ortasına yerleştirilenlere göre embriyo tarafından hareket ettirilmesi daha olasıdır.

Şekil 1: Yumurtalık kanserinden temsili tümör gelişimi. Yumurtalık kanseri hücreleri başarıyla implante şunlardır: (A) insan SKOV3 hücre hattı, (B) murine ID8 hücre hattı, ve (C) primer tümörler. Temsilci hematoksilin ve eozin boyama uygun olarak biyolüminesans görüntüleme ile birlikte sunulmaktadır. Primer tümör parçasının(C)hematoksilin ve hem CAM tümörühematoksilin ve eozin boyamasının implantasyonundan kaynaklanan CAM tümörü için, ortaya çıkan CAM tümörünün sitokeratin 8/18 (CK 8/18) boyaması ile birlikte, hem CAM tümörü hematoksilin ve eozin boyama dahildir. İlk paneldeki mavi ok tümörü gösteriyor. (D) 3U FSH'li ve 3U FSH'siz implantların tümör boyutu, biyolüminesans görüntülemeden kaynaklanan toplam akı olarak hesaplanır (tedavi edilmeyen ler için n = 3 ve FSH destekli için n = 4). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Açık hücreli renal hücreli karsinomdan temsili tümör gelişimi. İmplantasyonu sonucu tümörler (A) murine renal hücreli karsinom hücre hattı, RENCA, veya (B) sindirilmiş bir insan primer tümör elde kültürlü hücreler. (B)içinde eksire tümöre bitişik ölçüm ölçeği 1 mm işaret gösterir. (A) ve (B)histolojisi hematoksilin ve eozin boyama gösterir. In (A), firefly-luciferase işaretli RENCA hücrelerinin temsili biyolüminesans görüntüleme de gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Prostat kanseri hücre çizgilerinden temsili tümör gelişimi. İnsan prostat kanseri hücre hatlarının(A) CWR ve (B) C4-2 ile birlikte mor hücre hattı(C) MyC-CaP implantasyonu sonucu oluşan temsili tümörler ve hematoksilin ve eozin boyama. Firefly luciferase işaretli CWR hücrelerinden çıkan tümörlerin biyolüminesans görüntüleme gösterilir (A). Eksireverilen tümörlerin bitişiğindeki ölçüm ölçeğinde 1 mm işaret gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Mesane kanserinden temsili tümör gelişimi. Kurulan insan mesane kanseri hücre hatlarıimplantasyonu sonucu temsili tümörler (A) HT-1376, (B) T24, ve (C) primer insan mesane tümörü. Sonuçolarak ortaya çıkan CAM tümörü ve primer tümörün hematoksilin ve eozin boyamalarında gösterilmiştir. Eksireverilen tümörlerin bitişiğindeki ölçüm ölçeğinde 1 mm işaret gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.