Yöntem makalesi

Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

DOI:

10.3791/60651

⸱

28 Ocak 2020

 ,  ,  ,  , 
1Molecular and Medical Pharmacology, University of California Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tavuk koryoallantoik membran modelini jinekolojik ve ürolojik kanser hücre hatlarının ve hasta kaynaklı tümörlerin engraftment için alternatif, nakledilebilir, in vivo modeli olarak sıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare modelleri in vivo kanser çalışmaları için kriter testleri dir. Ancak, maliyet, zaman, ve etik hususlar alternatif in vivo kanser modelleri için çağrılara yol açmıştır. Tavuk koryoallantoik membran (CAM) modeli tümör gelişiminin doğrudan görselleştirilmesine izin veren ve in vivo görüntüleme için uygun olan ucuz, hızlı bir alternatif sağlar. Bu nedenle, jinekolojik ve ürolojik tümörlerin bu modele engrafting için optimize edilmiş bir protokol geliştirmeye çalıştık, burada sunduğumuz. Yaklaşık 7 gün sonra döllenme sonrası, hava hücresi yumurtanın vaskülarize tarafına taşınır ve kabukta bir açıklık oluşur. Daha sonra murine ve insan hücre hatları ve primer dokulardan tümörler engrafted olabilir. Bu genellikle hücre dışı matris ve orta hücresel dağılım önlemek ve hücreler bir vasküler kaynağı işe kadar besin desteği sağlamak için bir karışımı tohumlu vardır. Tümörler yumurtadan çıkmadan 14 gün öncesine kadar büyüyebilir. Ateş böceği luciferase ile transeksif hücreleri yerleştirerek, biyolüminesans görüntüleme membran ve kanser hücresi embriyo yayılmış tümör büyüme hassas tespiti için kullanılabilir. Bu model potansiyel tümörijenite, invazyon, metastaz ve terapötik etkinliğini incelemek için kullanılabilir. Tavuk CAM modeli geleneksel murine modelleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman ve mali kaynaklar gerektirir. Yumurtalar bağışıklık sistemi zayıf ve bağışıklık toleranslı olduğundan, herhangi bir organizmanın dokuları potansiyel olarak insan dokularının implantasyonu için gerekli pahalı transgenik hayvanlar (örneğin, fareler) olmadan implante edilebilir. Ancak, Bu modelin avantajları nın çoğu potansiyel olarak da sınırlamalar olabilir, kısa tümör üretimi süresi ve immün/immün toleranslı durum da dahil olmak üzere. Ayrıca, tavuk koryoallantoik membran modelinde burada engraft sunulan tüm tümör tipleri rağmen, tümör büyüme değişen derecelerde bunu.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fareler malignite de dahil olmak üzere insan hastalıklarının incelenmesi için klasik model organizma olarak hizmet vermiştir. Memeliler olarak, insanlarla birçok benzerlikleri vardır. Genetik benzerlik onların yüksek derecede insan hastalıklarının genetik kontrolü içine büyük bir fikir sağlamak için fare genomunun transgenik manipülasyon izin verdi1. Farelerin kullanımı ve deneyleri konusunda geniş deneyim, biyomedikal araştırmalar için tercih edilen model olmalarına yol açmıştır. Ancak, murine modelleri ile ilgili etik ve bilimsel endişelere ek olarak, onlar da oldukça pahalı ve zaman alıcı olabilir2,3. Tümörlerin gelişimi haftalar hatta aylar sürebilir. Sadece tipik bir kurumda konut tümörler gelişmekte iken binlerce dolar yüzlerce çalıştırabilirsiniz. Yumurtalık kanseri bu dezavantajı bir örnektir çünkü murine modellerinde büyüme kolayca ay sürebilir. Araştırma ilerleme gecikmeler potansiyel yumurtalık kanseri hastalarının ısrarla düşük 5 yıllık sağkalım oranı sadece% 47 (yani, 30 yıl içinde sadece% 10 sağkalım artışı)4etkiler. Benzer şekilde, ürolojik kanserler (böbrek, prostat ve mesane kanserleri) Amerika Birleşik Devletleri'nde tüm kanser vakalarının% 19 ve kansere bağlı ölümlerin% 11oluşturmaktadır 4. Böylece, jinekolojik ve ürolojik kanserleri incelemek için vivo yaklaşımında yeni bir yaklaşım, bu model sadece ilk tarama deneylerine uygulansa bile, bir laboratuvarda önemli ölçüde zaman, emek ve para tasarrufu sağlayabilir. Ayrıca, araştırma bulgularının ortaya çıkan ivme önemli ölçüde bu kanserler yıllık tanısı 177.000 bireyleretkileyebilir.

Tavuk CAM modeli yukarıda belirtilen sorunları ele birçok avantaj sunuyor. Anjiyogenez çalışmak için popüler bir model5,6, tümör hücre li invazyonu7,8, ve metastaz7,9, civciv embriyo CAM modeli zaten kanserlerin birçok formları çalışmak için kullanılmıştır, glioma dahil10,11,12, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom13,14, lösemi15,16, pankreas kanseri17, ve kolorektal kanser18. Ayrıca, CAM modelleri nöroblastom için üretilmiştir19, Burkitt lenfoma20, melanom21, ve kedi fibrosarkom22. Önceki çalışmalar da mesane kanseri engraftment sundu23 ve prostat kanseri hücre hatları24, ancak sınırlı protokol detayları ile. Sadece yumurta farelerden çok daha ucuz, ama onlar da son derece tekrarlanabilir sonuçlarüretmek 25,26. Hızlı vaskülatür gelişimi gösterirler ve tümör engraftment birkaç gün gibi hızlı bir şekilde oluşabilir ve açık pencereden uzunlamasına görselleştirilebilir. Yumurta döllenme ve kuluçka arasında 21 günlük zaman dilimi ile, deneyler birkaç hafta içinde tamamlanabilir. Ayrıca, düşük maliyet, sınırlı konut ihtiyaçları ve küçük boyut kolayca fare çalışmaları için engelleyici olacaktır büyük ölçekli deneyler izin verir.

Bu nedenle, jinekolojik ve ürolojik kanserlerin engraftment için CAM modeli optimize etmek için çalıştı. Erken tavuk embriyosu27immünazdurumu nedeniyle, hem fare hem de insan hücreleri kolayca implante edilebilir. Bu nedenle, biz başarıyla yumurtalık, böbrek, prostat ve mesane kanserleri engrafted var. Bu tümör tiplerinin her biri için, CAM kolayca kurulan murine ve / veya insan tümör hücre hatları kabul eder. Daha da önemlisi, taze hasat birincil insan tümör dokuları da ya sindirilmiş hücrelerden veya başarı oranı yüksek katı doku parçaları engraft olabilir. Bu kanser türlerinin ve hücre kaynaklarının her biri optimizasyon gerektirir, burada paylaştığımız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan tüm deneyler Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Deidentified, primer insan tümörlerinin kullanımı UCLA Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (Protokol numaraları 17-000037, 17-001169 ve 11-001363). UCLA anda, Hayvan Araştırma Komitesi inceleme tavuk embriyoları kullanarak deneyler için gerekli değildir; protokol onayı sadece yumurtadan çıktığında gereklidir. Ancak, hayvanların ötenazi için AVMA Yönergeleri gibi en iyi uygulamalar, etik tavuk embriyoları işlemek ve mümkün olduğunca ağrı önlemek için kullanılmıştır. Araştırmacılar CAM modelleri kullanarak çalışmalar başlamadan önce kendi kurumunda gözetim gereksinimlerini doğrulamak için teşvik edilmektedir.

1. Yumurtaların hazırlanması

  1. Yumurtaları almadan önce, yumurta kuluçka makinesini üreticinin talimatları doğrultusunda %60-70 nem oranıyla 37,8 °C 'ye (100 °F) kadar birleştirin.
    NOT: Kontaminasyon risklerini en aza indirmek için, nemi kontrol etmek için otoklavlı su kullanılabilir.
  2. Döllenmiş aldıktan sonra, Rhode Island Kırmızı tavuk yumurtası sertifikalı bir laboratuvar sınıf yumurta tedarikçisi, kağıt havlu ile kabukları yüzeyini kuru silin. Hafifçe nemlenmiş kağıt havlu, yapıştırılan malzemeyi çıkarmak için kullanılabilir. Hemen kurulayın.
    NOT: Kabuğu 43.3 °C'nin altındaki sıvı ile ıslatmak yumurtaya bakteri sokabilir. Yumurtaları yıkamayı veya dezenfekte etmeyi tercih ederseniz, sıvının sıcaklığı 43.3-48.9 °C arasında olmalıdır. Yüksek sıcaklıklar yumurtaları kaynatabilir. Dezenfektan seçimi endişeye neden olan mikroorganizmalara göre yapılmalıdır.
  3. Yumurtanın üzerindeki tarihi etiketlemek için bir kalem veya işaretleyici kullanın. Bu geliştirme gün 0 olarak kabul edilir.
  4. Yumurtaları yumurta kuluçka makinesine yerleştirin ve CAM gelişimine izin vermek için en az 7 gün boyunca kuluçkaya yatırın. Otomatik bir rotator kullanılabilir veya yumurtalar günde 180° 2-3x döndürülebilir.

2. Yumurta açma

NOT: YUMURTALARIN aÇILIŞI CAM tam olarak geliştirildiğinde yapılmalıdır. Bu genellikle geliştirme gün 7 veya 8.

  1. %70 etanol ile bir biyogüvenlik kabinini dezenfekte edin. Benzer şekilde dezenfekte ve biyogüvenlik kabine bir yumurta raf, yumurta mumlayıcı, marker, akülü döner alet silikon karbür taş ve dairesel kesme tekerleği ile yerleştirin, 18 G iğne, çeyrek inç vakum boru ile pipet denetleyici, ambalaj bant, ofis makas, kavisli makas, Semken (veya benzeri) forceps, pamuk topları ve 6 x 7 cm şeffaf film pansuman. Mümkün olduğunda steril, tek kullanımlık veya otoklavlı aletler kullanın.
  2. Yumurta rotatorunu kapatın. Yumurta rafüzerinde biyogüvenlik kabine içine yaklaşık 1-3 yumurta yerleştirin. Karanlıkta iken, hava hücresini tanımlamak için yumurta kabuğu na yumurta mum yerleştirin. Hava hücresinin yerini işaretleyin.
    NOT: Yumurta mumunun aydınlatma yoğunluğu yumurtanın içini görselleştirmek için çok önemlidir. Hava hücresi veya vaskülatür sürekli görmek zor ise, yumurta mum pilleri değiştirmeyi deneyin.
  3. Büyük bir kan damarı ağı bulmak için kabuk üzerinde yumurta mum hareket ettirin. Gerekirse yumurtayı döndürün. İdeal bir damar yumurtanın ortasına yakın dallanma olacaktır. İmplantasyon için kullanılacak vaskülatür üzerine çizmek için bir marker kullanın.
  4. Kaputun ışığını aç. Silikon karbür öğütme taşile donatılmış kablosuz döner bir alet kullanarak, doğrudan hava hücresinin merkezi üzerinde kabuk küçük bir delik matkap. Kabuğun çoğu çıkarılana kadar matkap, ancak beyaz, iç membran bozulmamış.
    NOT: Vaskülatür hedeflemeden önce hava hücresi üzerinde sondaj cam ve vaskülatür yerine hava hücresi üzerinde o özel yumurta kabuğu kalınlığı belirleme izin verir. CAM veya vaskülatür bozulursa, yumurta implantasyon için kullanılmaz.
  5. Matkap ve vasküler pencere hava hücresi için yapıldığı gibi açılacak başka bir küçük delik açmak (adım 2.4).
  6. 18 G iğne kullanarak, hafifçe hava hücresi ve vaskülatür üzerinde beyaz, iç membran delin. Kabuğun içine giremiyorsa, dikkatlice biraz daha delin. Beyaz, iç zarın (CAM hariç) delinmiş alanın tamamı boyunca bozulduğunu sağlayın. Membran parçasının çıkarılması gerekli değildir.
    NOT: Bu adımda CAM veya vaskülatür bozulursa, yumurtayı atın. Delinmiş bir delikten kan veya albumin sızıntısı varsa hasar belirgindir.
  7. Kaputun ışığını kapat. Yumurta mumlayıcıkullanarak, hava hücresinin yumurtanın ucundan vaskülatür üzerindeki alana aktarıldığını doğrulayın. Gerekirse, vakum borusunun orijinal hava hücresi üzerinde deliğin etrafına bir pipet denetleyicisine yerleştirilmesini ve hava hücresini hareket ettirebilmek için hafifçe kısa patlamalar halinde emmeuygulayın.
  8. Hava-CAM sınırıiçinde yaklaşık 0,5 cm hava hücresinin yeni konumunu ana hatlarını vermek için bir işaretçi kullanın. Yeni hava hücresinin üzerine bir parça ambalaj bandı yapıştırın. Gerekirse, bandı uygun boyuta küçültmek için standart ofis makası kullanın.
    NOT: Bant kabuk üzerinden hava akışını bozabilir ve hava hücresini tam olarak kapatmak için gerekenden daha büyük olmamalıdır.
  9. Yeni hava hücresi yukarı bakacak şekilde dönmeden ısınmak için yumurtaları kuvöze geri döndürün. Kalan yumurtaların açılması için 2.2-2.9 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. CAM geliştirme kalitesinden emin değilseniz, yumurta az sayıda kalan yumurta açmadan önce adım 2.16 ile devam etmelidir.
  10. Biyogüvenlik kabininde yumurta rafÜzerine taşınan hava hücreleri ile yaklaşık 1-3 yumurta yerleştirin.
    NOT: Açılan yumurtaya kontaminasyon uymasını önlemeye özen gerekir. Bu nedenle, her zaman bir biyogüvenlik kabini içinde yumurta açın ve steril araç ve ekipman mümkün olduğunca kullanın.
  11. Dairesel kesme tekerleği ile donatılmış bir akülü döner alet kullanarak, adım 2.8 çizilmiş hava hücresi sınırı üzerinde küçük bir çizgi kesti. Cam veya vaskülatür bozmasını önlemek için gerçek hava-CAM sınırı içinde yaklaşık 0,5 cm olduğundan emin olun. Kabuğu tamamen kesin ama CAM veya vaskülatür bozmak için yeterince derin nüfuz için dikkatli olun.
  12. Kavisli makas kullanarak, kabuk bir pencere oluşturmak için kalan hava hücresi etrafında kesti.
    NOT: Çıkarılan kabukta kan veya zar varsa, yumurta implantasyon için uygun değildir. Yumurtaların yüksek bir oranı temiz açılmamışsa, daha iyi CAM oluşumuna izin vermek için kalan yumurtaları açmak için en az 1 gün daha beklemeyi düşünün. Kalan yumurtaların kabukları delinmediyse, kuluçka makinesiiçindeki yumurtaların dönüşüne devam edilmelidir.
  13. Embriyonun canlılığını doğrulayın. Canlı embriyolar geniş vaskülatür, berrak albumin, embriyo hareketi veya görünür bir kalp atışı görüntüler.
  14. Semken forceps kullanarak, steril bir pamuk topu küçük pamuk parçaları çekin. Kabuk tozunu ve enkazını temizlemek için CAM yüzeyini yavaşça temize çıkarın.
    NOT: Enkazın çıkarılması, yumurtaların açıldığı gün yapılmalıdır.
  15. Kabuk açıklığını, 6 x 7 cm şeffaf film pansumanının dörtte biri ile kapatın.
  16. Yumurtaları kuvöze geri ver. Yumurtanın açılan pencere yukarı bakacak şekilde güvenli bir şekilde oturur ve CAM'in şeffaf film pansumanına dokunmadığından emin olun. Yumurta raf bir parça kullanın, yumurta rotator kenarı, ya da haddeleme tutmak herhangi bir yumurta prop için başka bir uygun öğe.
  17. Kalan tüm yumurtaların açılması için 2.10-2.16 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Yumurtaların açılmasının implantasyonla aynı gün tamamlanması gerekmez. En az 1 gün beklemek, kabuğu açarak canlılığı tehlikeye düşen yumurtaların ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilir.

3. Kanser hücresi süspansiyonunun transplantasyona hazırlanması (seçenek 1)

NOT: Bu işlem, ideal olarak 7 ile 10 arasında gerçekleşmesi gereken implantasyondan hemen önce tamamlanmalıdır. İmplantasyon tarihi yle ilgili daha fazla bilgi için lütfen adım 5 veya 6'nın başındaki notlara bakın. Bu yaklaşım tüm hücre hatları ve kültürlü böbrek kanseri tümör sindirim için kullanılmıştır.

  1. Ekstrasellüler matriks çözeltisini buz üzerinde erit.
  2. Mekanik ve/veya enzimatik sindirimi kullanarak, yerleştirilen hücre tipine uygun bir yöntem kullanarak tek hücreli süspansiyon elde edin.
  3. İmplantasyon için uygun bir ortama yerleştirilmesi gereken toplam hücre sayısını yeniden askıya alın. Yumurta başına 1-2 x 106 hücreli implantlar tipiktir.
    NOT: Hücre hatlarının implantasyonu için kullanılan ortam genellikle FBS veya serum replasmanı içeren hücreleri birliğe yerleştirmek için kullanılan tam bir ortamdır. Tümör sindirim implantasyonu genellikle aynı kanser türü hücre hatları kültüriçin kullanılan tam orta kullanır. Ancak, deneysel olarak gerekirse orta formülasyonda ayarlamalar yapılabilir. Tümör gelişimi ve büyümesi üzerindeki etkileri ampirik olarak belirlenmelidir.
  4. Kullanılan hücreler için uygun bir santrifüj hız ve zaman kullanarak hücreleri pelet. Tipik hızları 250-300 x g,ve süreleri 5-10 dk.
  5. Borulama ile peletli hücrelerden supernatant çıkarın. Mekanik fiske veya borulama yoluyla artık ortamda hücreleri yeniden askıya. Soğuması için buzüzerine yerleştirin. Uygun büyüklüktebir pipet kullanarak hücrelerin ve ortamın hacmini ölçün.
  6. 1-2 x 106 hücrenin yumurta başına 20-100 μL hacimde, son hücre dışı matriks konsantrasyonu 2,7-4 mg/mL proteinle implantasyon hacimlerini hesaplayın. Bu hesaplamaya göre orta, istenilen büyüme faktörleri veya katkı maddeleri ve hücre dışı matris çözeltisi ekleyin. Yerleştirmeye hazır olana kadar buzda tutun.
    NOT: 3.3 ve 3.6 adımlarında yapılan hesaplamalar için, gruptaki tüm yumurtalar için yeterli hacim sağlamak için en az bir buçuk yumurta implantı hacmi eklenmelidir. Yumurtalık kanseri hücre hatlarının (yani, SKOV3 ve ID8) implantasyonu için yumurta başına 106 hücre yerleştirildi. Renal hücreli karsinom hücre hattı RENCA implantasyonu için, sindirilmiş birincil insan renal hücreli karsinom dan elde edilen kültürlü hücreler, prostat kanseri hücre hatları (yani, CWR, C4-2, ve MyC-CaP) ve mesane kanseri hücre hatları (yani, HT-1376 ve T24), 2 x 106 hücre implante edildi.

4. İmplantasyon için tümör parçalarının hazırlanması (seçenek 2)

NOT: Bu işlem, ideal olarak 7 ile 10 arasında gerçekleşmesi gereken implantasyondan hemen önce tamamlanmalıdır. İmplantasyon tarihi yle ilgili daha fazla bilgi için lütfen adım 5 veya 6'nın başındaki notlara bakın. Primer yumurtalık ve mesane kanserleri tümör parçaları olarak implante edildi.

  1. Buz üzerinde hücre dışı matris çözeltisi çözül. İstenilen büyüme faktörleri veya katkı maddeleri içeren uygun bir ortamda 2.7-4 mg/mL nihai protein konsantrasyonuna seyreltin. Buzda kal.
    NOT: Tümör parçalarının implantasyonu genellikle aynı kanser türü hücre hatları nın culturing için kullanılan tam orta kullanır. Ancak, deneysel olarak gerekirse orta formülasyonda ayarlamalar yapılabilir. Tümör engraftment ve büyüme üzerindeki etkileri ampirik olarak belirlenmelidir.
  2. Bir neşter veya makas kullanarak, taze tümör parçaları çıkarmak. İdeal boyutlar her iki tarafta 2-5 mm arasında değişir. Dokuları implanta hazır olana kadar ortama daldırın.

5. Yapışmaz halka kullanılarak implantasyon (seçenek 1)

NOT: Kam tam olarak gelişmişse hücreler gelişim gününden itibaren 7'den itibaren implante edilebilir. İmplantasyon tümör gelişimi ve istenen deney için yeterli zaman sağlar kuluçka önce herhangi bir zamanda oluşabilir, ancak embriyobağışıklık hücreleri gün 10 postfertilizasyon27civarında mevcut başlar unutmayın. Tümör büyüme hızı hücre tipine göre önemli ölçüde değişir ve ilgi hücre tipi için ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Yumurtalık kanseri ve prostat kanseri hücreleri yapışmaz halka yöntemi kullanılarak implante edildi. Yapışmaz bir halka olmadığında, pipet ucunun benzer boyutta kesilip kullanılabileceğini unutmayın.

  1. Bir biyogüvenlik kabini ve gerekli tüm araçları dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın: bir yumurta raf, kavisli iris forceps, yapışmaz halkalar (1/ 4 inç iç çapı), cam karıştırmak çubuk, uygun hacim pipetler ve ipuçları, 6 x 7 cm şeffaf film pansuman, ofis makas ve marker veya kalem. Mümkün olduğunda steril, tek kullanımlık veya otoklavlı aletler kullanılmalıdır.
  2. Yumurtaları bir biyogüvenlik kabinine yumurta rafına yerleştirilecek şekilde yerleştirin. Yönetilebilir sayıda yumurta seçin. Altıya kadar tipiktir. Onlarla çalışırken yumurta önemli ölçüde soğumasını izin kaçının.
  3. Saydam film pansumasını kabuktan çıkararak kenarları açık pencereye doğru yuvarlayArak kabuk parçalarını çekmeyi önleyebilirsiniz. Yumurtalar uygun ve sağlıklı olup olmadığını kontrol edin. İdeal yumurta, açılan alanın merkezinde büyük bir kap ve ondan dallanacak daha küçük kaplar olacaktır.
  4. Kavisli iris forceps kullanarak, ideal bir dal noktası üzerinde, geminin üzerinde CAM üzerine steril, yapışmaz halka yerleştirin. CAM'i hafifçe aşındırmak için steril cam bir karıştırma çubuğu kullanın.
  5. 3.6 adımdan hücre süspansiyonuna yapışmaz halkanın ortasına boru layın. Alternatif olarak, 4.2.
  6. 6 x 7 cm şeffaf film pansuman dörtte biri ile açılış mühür. Yumurtaları uygun bir implant adı ile etiketle.
    NOT: Bir grup içindeki yumurtaların numaralanması uzunlamasına gözlemleri kolaylaştırır.
  7. Yumurtayı kuvöze geri ver. Kabuğun açılmasının dik olduğundan ve yumurtanın güvenli olduğundan emin olun.
    NOT: Yumurtalar rotasyon suz bir yumurta kuluçka makinesine geri döndürülebilir. Alternatif olarak, yüksek postimplant canlılığı CO2 devre dışı bırakılmış 37-38 °C hücre inkübatörü ve nem izlemek için bir higrometre ile elde edilebilir, hangi olmalıdır 50%-80.%

6. Yapışmaz halkasız implantasyon (seçenek 2)

NOT: Kam tam olarak gelişmişse hücreler gelişim gününden itibaren 7'den itibaren implante edilebilir. İmplantasyon tümör gelişimi ve istenen deney için yeterli zaman sağlar kuluçka önce herhangi bir zamanda oluşabilir, ancak embriyobağışıklık hücreleri gün 10 postfertilizasyon27civarında mevcut başlar unutmayın. Bu yöntem renal hücreli karsinom hücrelerinin ve mesane kanseri hücrelerinin implante sında kullanılmıştır.

  1. Bir biyogüvenlik kabini ve gerekli tüm araçları dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın: uygun hacim pipetler ve ipuçları, steril 10 cm doku kültürü yemekleri, yumurta raf, 6 x 7 cm şeffaf film pansuman, ofis makası ve marker.
  2. Adım 3.6'da üretilen hücre süspansiyonunun aşı hacmini uygun büyüklükte ki pipet ucuna aspire edin (200 μL tipiktir). Ucun üst kısmını tutarken, pipet ucunu dikkatlice çıkartın ve yatay olarak steril, 10 cm'lik doku kültürü yemeğine yerleştirin.
  3. Her grup için bir tabak ile bir grup içindeki tüm örnekler için adım 6.2'yi tekrarlayın.
  4. Hücre dışı matrisin kısmen polimerize olmasını sağlamak için ipuçlarını 15-30 dakika boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin.
  5. Kuluçka 15 dakika sonra, polimerizasyon için kontrol başlar. Az miktarda sıvı genellikle çanak üzerine yerleştirildiğinde ucundan dışarı sızar. Bu sıvının polimerizasyonu, uç içindeki sıvının polimerizasyon derecesini tahmin etmek için kullanılabilir.
  6. Yumurtaları bir biyogüvenlik dolabına bir yumurta rafına yerleştirilecek şekilde yerleştirin. Yönetilebilir sayıda yumurta seçin. Altıya kadar tipiktir. Onlarla çalışırken yumurta önemli ölçüde soğumasını izin kaçının.
  7. Kenarları açık pencereye doğru yuvarlayarak şeffaf film pansumanını kabuktan çıkarın. Bu, kabuk parçalarını çekmeyi önler.
  8. Yumurtalar uygun ve sağlıklı olup olmadığını kontrol edin. İdeal yumurta, açılan alanın merkezinde büyük bir kap ve ondan dallanacak daha küçük kaplar olacaktır.
  9. Uygun büyüklükteki bir pipetüzerine bir pipet ucu yerleştirin. Kısmen polimerize hücre süspansiyonuna cam üzerine büyük, iyi gelişmiş bir kap üzerinde, ideal olarak bir dal noktası üzerinde zorlamak için pistonu bastırın.
  10. 6 x 7 cm şeffaf film pansuman dörtte biri ile açılış mühür.
  11. Yumurtayı uygun bir implant adı ile etiketleyin.
    NOT: Bir grup içindeki yumurtaların numaralanması uzunlamasına gözlemleri kolaylaştırır.
  12. Yumurtayı kuvöze geri ver. Kabuğun açılmasının dik olduğundan ve yumurtanın güvenli olduğundan emin olun.
    NOT: Yumurtalar rotasyon suz özel bir yumurta kuluçka makinesine geri döndürülebilir. Alternatif olarak, yüksek postimplant canlılığı CO2 devre dışı bırakılmış 37-38 °C hücre inkübatörü ve nem izlemek için bir higrometre ile elde edilebilir, hangi olmalıdır 50%-80.%

7. Ateş böceği luciferase işaretli tümörlerin biyolüminesans görüntüleme

NOT: İmplante edilen hücreler ateş böceği luciferase veya diğer görüntüleme faktörlerini kodlayan gen ile stably transize edilmişse, ortaya çıkan tümörler biyolüminesans görüntüleme kullanılarak görselleştirilebilir. Floresan görüntüleme yumurta kabuğundan yüksek arka plan nedeniyle bozulmamış yumurta tavsiye edilmez. Bu uç nokta analizidir, çünkü kabuğun açılması hayatta kalmayı büyük ölçüde azaltır. Tümörler deneysel ihtiyaçlar ve tümör büyüme hızı için uygun herhangi bir zamanda görüntülenebilir. Ancak, ortalama olarak, yumurta lar 21 gün sonra döllenme sonrası yumurtadan çıkarlar. Bu nedenle, geliştirme gün 18 istenmeyen kuluçka önlemek için uygun bir bitiş noktasıdır.

  1. Gerekirse yumurtaları görüntüleme tesisine taşıyın. 10 cm doku kültürü yemekleri üzerine bant yumurta. 37.8 °C (100 °F) yumurta kuluçka makinesine geri döndürün ve dönüş mekanizması çıkarılabilir veya devre dışı bırakılır. Nem taşıma ve görüntüleme için çok önemli değildir.
  2. Kavisli iris forsepsi kullanarak CAM'i albumin ve embriyo yla temize çıkarana kadar cam'ı kabuğundan hafifçe itin. Geniş uçlu numune forsepsleri kullanarak, tümör görselleştirme için yeterli kabuk açıklığı genişletmek için kabuk parçaları kırmak.
  3. Yumurta albuminine en az 50 mg/mL D-luciferin enjekte edin. Benzer bir D-luciferin hacmi de yapışmaz halka içine veya implante hücreleri içeren alanda CAM yüzeyine borulu olabilir. Bu ideal bir vasküler kaynağı yokluğunda optimum biyolüminesans sağlar. 8 dakika kuluçka.
  4. Yumurtayı anestezik yumurtanın albuminine 20-50 μL isofluran enjekte edin. Ek bir 2 dakika için kuluçka, alternatif olarak, yumurta içeren bir indüksiyon odasına yerleştirilebilir 2-2.5% buharlaşmış isoflurane. Embriyonik hareket sona erdiğinde yeterli anestezi derinliği elde edilir.
    NOT: Yumurtanın ötenazisi için daha büyük hacimlerde izofluran (100°L) kullanılabilir.
  5. Üreticinin talimatlarıyla belirlenen uygun ayarları kullanarak yumurtaları bir biyolüminesans görüntüleme cihazına ve görüntüye yerleştirin. Bu çalışmada 1 dk maruz kalma süresi kullanılmıştır.
  6. Kalan CAM ve embriyo görüntü için, 10 cm doku kültürü çanak içine yumurta açın.
    1. Yumurtanın ortasına yakın bir yerde iki elin parmaklarıyla yumurtayı ve kabuğun açılmasının her iki tarafındaki başparmakları kavrayın.
    2. Yavaşça parmakları ile yumurta içine bastırırken başparmak ile yumurtanın iki yarısı çekin.
    3. Kabuk CAM ve embriyo dan yaklaşık yarısı ayrılmış olduğunda, 10 cm doku kültürü çanak üzerinde baş aşağı yumurta çevirin.
    4. Kabuk yarılarını ayırmaya devam edin. CAM kabuğun içine yapışırsa, CAM'i kabuktan uzaklaştırmak için parmakları hafifçe kullanın.
    5. Embriyo istenirse başka bir tabağa çevrilebilir.
    6. Gerekirse, ek isoflurane adım 7.4 olarak verilebilir.

8. Tümör hasat

NOT: Tümörler deneysel ihtiyaçlara ve tümör büyüme hızına uygun herhangi bir zamanda hasat edilebilir. Ancak, ortalama olarak, yumurta lar 21 gün sonra döllenme sonrası yumurtadan çıkarlar. Bu nedenle, geliştirme gün 18 istenmeyen kuluçka önlemek için uygun bir bitiş noktasıdır.

  1. Tümörü forceps ile kavrayın. Makas kullanarak (bahar iris makas iyi çalışır) veya bir neşter, cam dikkatle çıkarmak tümör.
  2. Tümör ateş böceği luciferase geni ile transize edilmişse, görüntülemesi zor tümörlerin başarılı bir şekilde çıkarılmasını doğrulamak için regörüntüleme yapılabilir.
    NOT: Eksileri olan tümörler belirli bir deneyiçin uygun herhangi bir yöntemle analiz edilebilir. Tümörler cam veya farelere yeniden implante edilebilir. Tümör kimliğini doğrulamak için tümörler düzeltilebilir, parafin gömülü olabilir ve hematoksilin ve eozin veya immünohistokimyasal boyama ile incelenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şimdiye kadar, biz yumurtalık, böbrek, prostat ve mesane kanserleri için başarılı olması implantasyon bu yöntemi bulduk. Her biri implantasyon için belirli koşulları belirlemek için optimize edilse de, esneklik olabilir. Test edilen tümör tiplerinden yumurtalık kanseri büyümesi çok daha az belirgindi ve genellikle biyolüminesans görüntüleme yardımı olmadan görülemese de(Şekil 1). Ancak, CAM sertleşme implantasyon alanında forceps ile hissedilebilir. Bu biyolü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAM modeli kullanılarak tümör genişlemesi ve engraftment in vivo hayvan modelleri mevcut daha hızlı ve doğrudan gözlemlenebilir tümör büyümesi sağlar. Buna ek olarak, özellikle bağışıklık sistemi zayıf farelerin maliyeti ile karşılaştırıldığında, ekipman ilk satın alma tamamlandıktan sonra maliyetleri önemli ölçüde daha düşüktür. Tavuk embriyolarının ilk, bağışıklık sistemi kolayca insan ve murin dokusunun engraftment izin verir. Bu güçlü olsa bile, CAM modeli sınırlamaları var. Uzun süreli tedavi çalışmaları garanti edi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar dr Fuyuhiko Tamanoi ve Binh Vu bu yöntem üzerinde ilk eğitim için teşekkür etmek istiyorum. Dr. Eva Koziolek ile yapılan görüşmeler bu yaklaşımın optimizasyonunda etkili olmuştur ve çok beğenilmiştir. Bu çalışma aşağıdaki kaynaklardan kaynak olmadan mümkün olmazdı: Tütün Ile İlgili Hastalık Araştırma Programı Doktora Sonrası Bursu (27FT-0023, ACS), Savunma Bakanlığı (DoD) Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), Tütünle İlgili Hastalık Araştırma Programı Yüksek Etki Pilot Ödülü (27IR-0016) ve UCLA kurumsal desteği, JCCC Tohum Hibesi (NCI/NIH P30CA016042) ve LW Araştırma Başkan Yardımcısı Ofisinden 3R Grant dahil.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
-010 Teflon (PTFE) Beyaz 55 Duro Shore D O-RinglerO-Ring StoreTEF010Hücre tohumlama için yapışmaz halka. 1/4 "ID X 3/8" OD X 1/16 "CS Politetrafloroetilen (PTFE).
C4-2ATCCCRL-3314İnsan prostat kanseri hücre hattı.
CWR22Rv1CWR hücreleri, Dr. David Agus'un (Güney Kaliforniya Üniversitesi Keck Tıbbı)
Sitokeratin 8/18 Antikoru (C-51)Novus BiologicalsNBP2-44929-0.02mgİnsan yumurtalık CAM tümörlerinin immünohistokimyasal analizi için 1:100 oranında seyreltmede kullanılır.
D-Luciferin Ateşböceği, potasyum tuzuGoldbioLUCK-1G
Hassas Ameliyat Makası; Kıvrımlı; keskin-keskin; 30 mm bıçak uzunluğu; 4-3/4 inç Toplam UzunlukRoboz CerrahiRS6703Bu bir örnek olarak verilmiştir. Benzer herhangi bir kavisli makas da işe yarayacaktır.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Alet KitiDremel8050-N/18Bu kit gerekli tüm aletleri içerir.
Döllenmiş tavuk yumurtası (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)AA Lab Eggs Inc.N/AYerel bir yumurta tedarikçisinin tanımlanması gerekecektir, çünkü bu tedarikçi yalnızca bölgesel olarak teslimat yapar.
HT-1376ATCCCRL-1472İnsan mesane kanseri hücre hattı.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Yumurta Kuluçka Makinesi Combo KitKuluçka AmbarıHB1588D-YOK-1102-1588-1357Diğer yumurta kuluçka makineleri kullanılabilir, ancak güvenilirliklerinin doğrulanması gerekir. İmplantasyondan sonra, CO2 devre dışı bırakılmış bir hücre inkübatörü de kullanılabilir.
ID8Ticari olarak mevcut değildir, lütfen PMID: 10753190'ye bakın.
Incu-Bright Cool Light Yumurta CandlerKuluçka Ambarı1102Diğer mumcular da kullanılabilir; Ancak, test ettiklerimiz arasında bu tercih edilir. Bu mumcu, yukarıda belirtilen inkübatör kitine dahildir.
İris Forseps, 10cm, Kavisli, Tırtıklı, 0.8mm uçlarDünya Hassas Aleti15915Bu bir örnek olarak verilmiştir. Benzer kavisli forsepsler de işe yarayacaktır. Bu yöntem için birden fazla marka kullanılmıştır.
IsofluranKesme Makinesi, Dağıtma 0010250
IVIS Lumina II, In Vivo Görüntüleme Sistemi, Perkin, Elmer,
Matrigel, Membran, Matris, HC; LDEV-FreeCorning354248Hücre dışı matris çözeltisi
MyC-CaPATCCCRL-3255Murin prostat kanseri hücre hattı.
Taşınabilir Pipet Yardımı XP Pipet Kontrol CihazıDrummond Scientific4-000-101Benzer herhangi bir pipet kontrol cihazı uygun olacaktır.
PrecisionGlide Hipodermik İğnelerBD305196Bu bir örnek olarak verilmiştir. Herhangi bir 18G iğne benzer şekilde çalışır.
RENCAATCCCRL-2947
Semken ForsepsGüzel Bilim Araçları11008-13Bu bir örnek olarak verilmiştir. Benzer herhangi bir forseps veya araştırmacının tercihine uygun başka bir stil uygun olacaktır.
SKOV3ATCCHTB-77İnsan yumurtalık kanseri hücre hattı.
Numune forsepsElektron Mikroskobu Bilimleri72914Bu bir örnek olarak verilmiştir. Biyolüminesans görüntüleme için kabuğu çıkarmak için kullanılan forseps, 3 mm genişliğinde uçlar ile yaklaşık 12,8 cm uzunluğundadır.
Steril Pamuk ToplarıFisherbrand22-456-885Bu örnek olarak verilmiştir. Herhangi bir steril pamuk topu yeterli olacaktır.
Lastik ile Karıştırma Çubukları Policeman; 5 mm çap, 6 inç uzunlukUnited Scientific SuppliesGRPL06Bu bir örnek olarak verilmiştir. Benzer herhangi bir cam karıştırma çubuğu da işe yarayacaktır.
T24ATCCHTB-4İnsan mesane kanseri hücre hattı.
Tegaderm Şeffaf Pansuman Orijinal Çerçeve Stili 2 3/8" x 2 3/4"Moore Medical21272
Doku Kültürü Kapları, 10 cm çapındaCorning353803Bu örnek olarak verilmiştir. Benzer, steril 10 cm'lik bir tabak kullanılabilir. Doku kültürü tedavisi gerekli değildir.
Tygon Clear Laboratuvar Tüpü - 1/4 x 3/8 x 1/16 duvar (50 fit)TygonAACUN017Bu bir örnek olarak verilmiştir. Benzer büyüklükteki herhangi bir boru da işe yarayacaktır.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
  2. Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
  3. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
  4. Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).
  5. Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
  6. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  7. Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  8. Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935(2015).
  9. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
  10. Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
  11. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  12. Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12(2017).
  13. Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
  14. Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26(2016).
  15. Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815(2011).
  16. Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
  17. Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686(2017).
  18. Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004(2019).
  19. Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28(2018).
  20. Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339(2014).
  21. Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
  22. Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201(2017).
  23. Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
  24. Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991(2017).
  25. Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
  26. Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
  27. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  28. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CAM ModeliT m r TutunmasBiyol minesans G r nt lemeH cre D MatriksYumurta Kabu u DelmeVask ler PencereKanser H cre S spansiyonuTerap tik Etkinlikmm ntoleran Model

İlgili makaleler