Yöntem makalesi

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

DOI:

10.3791/60728

⸱

17 Mayıs 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mühendislik askorbat peroksidaz (APEX) veya Escherichia coli biotin ligaz BirA (BioID olarak da bilinir) kullanılarak yapılan yakınlık etiketleme (PL) teknikleri memeli hücrelerindeki protein-protein etkileşimlerinin (PPI) belirlenmesinde başarıyla kullanılmıştır. Ancak, APEX tabanlı PL'de toksik hidrojen peroksit (H2O2)gereksinimleri, biotin ile daha uzun kuluçka süresi (16-24 saat) ve BioID tabanlı PL'de daha yüksek kuluçka sıcaklığı (37 °C) bitkilerdeki uygulamalarını ciddi şekilde sınırlar. Yakın zamanda açıklanan TurboID tabanlı PL BioID ve APEX birçok sınırlamaları giderir. TurboID, oda sıcaklığında (RT) sadece 10 dakika içinde proteinlerin hızlı bir şekilde etiketlemesine olanak tanır. TurboID'nin faydası hayvan modellerinde gösterilmiş olsa da, yakın zamanda TurboID tabanlı PL'nin bitkilerde bioid ile karşılaştırıldığında ilgi çekici bir proteine yakın proteinlerin etiketedilmesi nde daha iyi performans gösterdiğini gösterdik. Burada sağlanan bir model olarak nükleotit bağlayıcı lösin zengintekrar (NLR) protein ailesinin N-terminal Toll/interlökin-1 reseptör (TIR) etki alanı kullanarak protein etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir adım adım protokoldür. Yöntem vektör yapımı, protein ekspresyonu yapılarının agroinfiltrasyonu, biotin tedavisi, protein ekstraksiyonu ve tuzsuzlaştırma, niceleme ve biyotinylated proteinlerin afinite saflaştırma ile zenginleştirilmesi açıklar. Burada açıklanan protokol, Nicotiana ve diğer bitki türlerinde ilgi çeken diğer proteinleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PpIs çeşitli hücresel süreçlerin temelidir. PpIs tanımlamak için geleneksel yöntemler maya-iki-hibrid (Y2H) tarama ve immünopresidkütle spektrometresi ile birleştiğinde (IP-MS)1. Ancak, her ikisi de bazı dezavantajları muzdarip. Örneğin, Y2H taraması hedef bitki veya hayvan türlerinin Y2H kütüphanesinin kullanılabilirliğini gerektirir. Bu kütüphanelerin inşaatı emek yoğun ve pahalıdır. Ayrıca, Y2H yaklaşımı heterolog tek hücreli ökaryotik organizma mayasında gerçekleştirilir, bu da yüksek ökaryotik hücrelerin hücresel durumunu temsil etmeyebilir.

Buna karşılık, IP-MS geçici veya zayıf PPI yakalama düşük verimlilik gösterir, ve aynı zamanda düşük bolluk veya yüksek hidrofobiklik ile bu proteinler için uygun değildir. Reseptör benzeri kinazlar (RLKs) veya NLR bağışıklık reseptörleri ailesi gibi bitki sinyal yollarında yer alan birçok önemli protein düşük seviyelerde ifade edilir ve genellikle geçici olarak diğer proteinlerle etkileşime girer. Bu nedenle, büyük ölçüde bu proteinlerin düzenlenmesi altında mekanizmaların anlaşılmasını kısıtlar.

Son zamanlarda, yakınlık etiketleme (PL) yöntemleri mühendislik askorbat peroksidaz dayalı (APEX) ve mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (BioID olarak bilinen) geliştirilmiş ve PPIs çalışması için kullanılmıştır2,3,4. PL prensibi, bir hedef proteinin labile biotinyl-AMP (bio-AMP) oluşumunu katalizler bir enzim ile kaynaşmış olmasıdır. Bu serbest biyo-AMP PL enzimleri tarafından serbest bırakılır ve hedef protein in çevresine diffüz, 10 nm5tahmini yarıçapı içinde birincil aminlerde proksimal proteinlerin biyotinylation sağlayan 5 .

Bu yaklaşım, geçici veya zayıf PPI yakalama yeteneği gibi geleneksel Y2H ve IP-MS yaklaşımları üzerinde önemli avantajlara sahiptir. Ayrıca, PL kendi yerli hücresel ortamlarda hedef proteinproksimal proteinlerin etiketleme sağlar. Farklı PL enzimleri farklı sistemlere uygularken benzersiz dezavantajları vardır. Örneğin, APEX BioID'ye göre daha yüksek etiketleme kinetik leri sunsa ve memeli sistemlerinde başarılı bir şekilde uygulansa da, bu yaklaşımda toksik hidrojen peroksit (H2O2)gereksinimi bitkilerdeki PL çalışmaları için uygun değildir.

Buna karşılık, BioID tabanlı PL toksik H kullanımını önler2O2, ama etiketleme oranı yavaş (biyotinylation tamamlamak için 18-24 h gerektiren), böylece geçici PPIs yakalama daha az verimli hale. Ayrıca BioID tarafından verimli PL için gereken yüksek kuluçka sıcaklığı (37 °C) bitkiler4gibi bazı organizmalara dış stres getirir. Bu nedenle, bitkilerde BioID tabanlı PL sınırlı dağıtım (yani, pirinç protoplastlar, Arabidopsis, ve N. benthamiana) bildirilmiştir6,7,8,9. Yakın zamanda açıklanan TurboID enzim APEX ve BioID tabanlı PL. TurboID eksiklikleri üstesinden rt 10 10 10 dakika içinde PL başarı sağlayan yüksek aktivitegösterdi. TurboID tabanlı PL başarıyla memeli hücreleri, sinekler ve solucanlar10uygulanmıştır. Son zamanlarda, biz ve diğer araştırma grupları bağımsız optimize ve N. benthamiana ve Arabidopsis bitkiler ve domates tüylü kökleri11,12,,13,14dahil olmak üzere farklı bitki sistemlerinde PPI eğitimi için TurboID tabanlı PL kullanımını uzattı. Karşılaştırmalı analizler TurboID'nin bitkilerde PL için BioID11,14ile karşılaştırıldığında daha iyi performans gösterdiğini göstermiştir. Ayrıca bir NLR bağışıklık reseptörü 11 ile yeni etkileşimler bir dizi tespit ederek planta TurboID tabanlı PL sağlamlığını göstermiştir11, etkileşim ortakları genellikle geleneksel yöntemlerle elde etmek zor bir protein.

Bu protokol, N. benthamiana tesislerinden NLR immün reseptörünün N-terminal TIR etki alanının etkileşim proteinlerinin tanımlanmasını tanımlayarak planta'daki TurboID tabanlı PL'yi göstermektedir. Yöntem N. benthamianailgi herhangi bir protein için uzatılabilir. Daha da önemlisi, Arabidopsis,domates ve diğerleri gibi diğer bitki türlerinde PPIs araştırmak için önemli bir referans sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Yöntemegenel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Bitki malzemesi hazırlama

  1. N. benthamiana tohumlarını ıslak toprakta yüksek yoğunlukta yetiştirin ve 23-25 °C'de 16 h ışık (yaklaşık 75 mol/m2s) ve 8 saat karanlık fotoperiyotlu bir iklim odasında saklayın.
  2. Yaklaşık 1 hafta sonra, her genç fideyi dikkatlice 4' x 4' tencereye aktarın ve fideleri aynı odada tutun.
  3. Onlar sonraki agroinfiltrasyon için 4-8 bir yaprak aşamasına kadar yaklaşık 4 hafta boyunca odasında bitkilerin koruyun15.

2. TurboID füzyonların yapımı

  1. Hedef proteinin TurboID (Addgene plazmid #107177 PCR TurboID) ile füzyonunu oluşturmak için standart moleküler klonlama tekniğini kullanın. Burada, NLR immün reseptörünün N-terminal TIR etki alanını hedef protein olarak kullandık ve Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü (p35S::TIR-TurboID) kontrolü altında TurboID'ye kaynaşmış tir inşa ettik.
    NOT: TurboID enziminin karboksil-terminus veya amino-terminusa füzyonu ilgi proteinine bağlıdır. Genellikle, bir sitoplazmik protein için, TurboID füzyon hedef proteinin işlevini etkilemediği sürece, her iki termini kabul edilebilir olmalıdır. Ancak, bir membran lokalize protein için, turboid füzyonu için hangi terminusun en iyi olduğunu belirlemeden önce protein topolojisi önceden karakterize edilmelidir.
  2. Sonraki kantitatif proteomik analiz için kontrol olarak hizmet etmek için aynı promotör altında bir TurboID-erimiş sitrin inşa.
    NOT: Hedef proteine proteom proksimalını belirlemek için turboid kontrolü oluşturmak önemlidir. TurboID füzyon kontrolü, TurboID-erimiş hedef proteinine benzer bir ifade düzeyi göstermelidir. Bu ampirik agroinfiltrasyon sırasında Agrobacterium konsantrasyonu ayarlayarak tespit edilebilir. Buna ek olarak, kontrol proteininin hedef proteinine benzer bir hücre altı lokalizasyon desenine sahip olması önemlidir.

3. Tarımsal filtrasyon

  1. Plazmidlerin Agrobacterium'a dönüşümü
    1. Daha önce açıklandığı gibi hazırlanan 2.1 ve 2.2 ila 50 μL Agrobacterium tumefaciens zorlanma GV3101 yetkili hücreleri, üretilen plazmidlerin 0,5 g ekleyin16.
      NOT: GV2260 gibi diğer Agrobacterium suşları da kullanılabilir.
    2. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
    3. 42 °C'de bir su banyosunda 60 s. için ısı şoku.
    4. Agrobacterium'a 400 μL LB orta (10 g/L tripton, 5 g/L maya ekstresi ve 10 g/L NaCl; pH = 7.0) ekleyin ve 90 dakika boyunca 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
    5. Plaka LB agar üzerinde tüp tesbih plazmid seçmek için uygun antibiyotikler ile takviye, yanı sıra Agrobacterium için (GV3101 için: 50 mg / L gentamicin ve 50 mg / L rifampisin).
    6. 28 °C'de 36-48 h boyunca tek tek koloniler görünene kadar kuluçka plakaları.
  2. Antibiyotiklerle taze bir LB agar plakaüzerine birkaç ayrı koloniseçin ve çizgi (adım 3.1.5 bakınız) ve 28 °C'de bir gecede büyüyün.
    NOT: Agrobacterium'dakibelirli ikili yapının varlığını doğrulamak için koloni PCR'sini gerçekleştirmek daha uygun olacaktır. Deneyimlerimize göre, kolonilerin %95'inden fazlasında tanıtılan ikili yapılar bulunur.
  3. 3 mL LB orta artı uygun antibiyotikler (bkz. adım 3.1.4) ilgi nin yapısını barındıran Agrobacterium kolonisi ile aşılave 28 °C'de bir gecede sallayarak kuluçkaya yatan Agrobacterium kültürünün OD600'ü 2.0'a ulaşın.
  4. Hücreleri 3.000 x g olarak santrifüj edin ve agroinfiltrasyon tamponunda OD600 = 1.0 'a geri alın (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5.6], 250 μM asetozeringone).
    NOT: Agroinfiltrasyon dan önce RT'de 2 saat inkübaksu en uygun uyguluyor olsa da, GV3101 suşu ile ilgili deneyimimizde, inkübasyonsuz vs. ile hedef protein ekspresyonu ile arasında büyük bir fark olmamıştır.
  5. Tam olgun N. benthamiana yapraklarının (abaxial) epidermisinde inoculumu sızdırmak için 1 mL iğnesiz şırınga kullanın.
    NOT: Üç biyolojik kopya için yeterli miktarda yaprak malzemesi hazırlamak için: bütün bir yaprağın tamamı genellikle sızılır, bitki başına üç yaprak sızılır ve her yapı için üç ila dört bitki kullanılır. Her yaprak için, resuspended agrobacteria 1.5-2.0 mL yeterlidir.
  6. 36 saat post-infiltrasyondan (hpi) sonra, TurboID yapıları ile önceden sızmış yapraklara 200 μM biotin (10 mM MgCl2 çözeltisinde) sızdırın.
  7. Bölüm 4'te açıklandığı gibi yaprak dokusunu hasat etmeden önce bitkiyi ek 3-12 saat boyunca koruyun.
    NOT: Biotin infiltrasyonu için 36 hpi'yi seçmenin nedeni, önceki çalışmalara göre hedef protein ekspresyonunun bu zaman diliminde zirve yapmamasıdır11. Bu ilgi hedef proteinoptimal ifade için gerekli zaman belirlemek için tavsiye edilir. Biyotin sonrası infiltrasyon süresi, incelenen deneysel tasarıma ve hedef proteine bağlıdır. Genellikle, biotin tedavisi 3-12 h TurboID füzyonlar tarafından hedef proteine proksimal en proteinlerin etiketleme sağlar.

4. Yaprak numunesi toplama

NOT: Yaprak numunelerinin sonraki işlenmesi için, numunelerin keratin kontaminasyonunu önlemek için steril eldiven giyin. Tüm reaktifler de mümkün olduğunca keratin içermez.

  1. Petiole tabanında sızmış yaprakları kesin, yaprak damarı kaldırmak, sonra sıvı azot yaprak dokusu flaş dondurun.
  2. Bir havaneli ve harç kullanarak yaprak dokusunu öğütün ve yaprak tozunu 15 mL veya 50 mL şahin tüpleri halinde -80 °C'de saklayın.
    NOT: Farklı bitkilerden gelen üç biyolojik kopyanın her biri için üç ila dört parça yaprak alın. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Sonraki adımlardan önce, immünoblot analizleri ile hedef proteinin protein ekspresyonu ve biyotinylasyonunun değerlendirilmesi önerilir. Tipik batı lekeleri Şekil 2'degösterilmiştir.

5. Yaprak toplam protein inekstraksiyonu

  1. Yaklaşık 0,35 g yaprak tozunun 2 mL'lik bir tüpe aktarılması. Her örnek için iki tüp hazırlayın.
    DİkKAT: Sıvı nitrojen tarafından soğutulan herhangi bir nesneye dokunurken eldiven takın.
  2. 700 μL RIPA lysis tampon (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5] ekleyin, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, %1 NP40 [v/v], %0.1 SDS [w/v], %0.5 sodyum deoksichoat [w/v], 1 mM DTT, 1 tablet proteaz inhibitörü kokteyli) 0.35 g yaprak tozu.
  3. 10 dakika boyunca tüpleri girdap.
  4. 30 dakika buz üzerinde örnekleri bırakın.
  5. Tüpleri birkaç kez ters çevirerek her 4-5 dakikada bir içeriğini karıştırın.

6. Tuzsuzluk ile serbest biotin çıkarılması

NOT: Bu bölüm yaklaşık 50 dakika sürer.

  1. Tuzsuzlama sütununa dengeleyin.
    1. Tuzluk sütununun altındaki makarayı çıkarın ve kolonu 50 mL'lik bir tüpe koyun.
    2. Depolama çözeltisini 1000 x g ve 4 °C'de 2 dk'lık santrifüj ile çıkarın ve kapağın gevşetilmesini sağlayın.
    3. Tuzsuzma sütununa 50 mL'lik bir tüp koyun. 2 dk için 1000 x g ve 4 °C'de her santrifüj de santrifüj ve akış atarak 5 mL RIPA lysis tampon ile sütun 3x dengeleyin.
    4. Tuzsuzma sütununu yeni bir 50 mL boruya aktarın ve daha sonraki kullanım için geçici olarak 4 °C'de saklayın.
  2. Tüpleri 16.500 x g ve 4 °C'de 10 dk'da adım 5.4'ten döndürün ve iki tüpten süpernatant'ı yeni bir 2 mL tüpe aktarın.
  3. Dengedeki tuzsuzlama sütununun reçinesinin üstüne 1.500 μL protein ekstresi ekleyin (adım 6.1.4'ten itibaren). Protein ekstresi reşin eve girdiğinde, 100 μL RIPA lysis tamponu ekleyin.
    NOT: Yapraklardan protein ekstraksiyonu için 1.400 μL RIPA lysis tamponu kullanılmasına rağmen, protein çıkarma ve tuzdan arındırma sonrası toplam hacim, orijinal hacime göre bir dereceye kadar artırılmıştır. Bu nedenle, her gruptan alınan numunelerin 5.1 ve 5.4 adımlarında açıklandığı gibi bir kombinasyonu, numune başına en az 1.500 μL protein özüne neden olabilir.
  4. 2 dk için 1000 x g ve 4 °C'de santrifüj ve tuzsuz numuneleri geçici olarak buzüzerinde bırakın.

7. Bradford testi kullanarak tuzsuz protein özlerinin sayısallaştırılması

  1. Her degrade BSA çözeltisinin 50 μL'sini hazırlayın: 0 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.8 mg/mL ve 1 mg/mL.
  2. 5 μL'lik bir numuneyi 45 μL ddH2O ile karıştırarak tuzsuz protein ekstresini seyreltin.
  3. 5x Bradford naibi (100 mg Coomassie parlak mavi G250 mg, metanol 47 mL, % 85 fosforik asit 100 mL, ddH2O 53 mL) seyrelterek 1x Bradford naibi hazırlayın.
  4. Her degrade BSA çözeltisinin 50 μL'sini ve seyreltilmiş protein ekstresini 1x Bradford naibinin 2,5 mL'sine ekleyin.
  5. 10 dakika RT'de kuluçka.
  6. Her numunenin 200 μL çözeltisini bir ELISA plakasının kuyuya ekleyin (numune başına üç teknik kopya).
  7. Mikroplaka okuyucu kullanarak OD595'i ölçün.
  8. Degrade BSA çözeltisinin değerine göre standart eğriyi çizin ve tuzsuz protein örneklerinin konsantrasyonunu hesaplayın. Genellikle yaprakların 0.7 g'ından elde edilen toplam protein konsantrasyonu 3-6 mg/mL arasında değişmektedir.
  9. Sonraki afinite saflaştırma için tuzsuz protein ekstresi 6-8 mg hazırlayın.

8. Biyotinylated proteinlerin zenginleşmesi

  1. 2 mL'lik bir tüpiçine 200 μL streptavidn-C1 konjuge manyetik boncuk alın.
  2. STREPTAvidn-C1 konjuge manyetik boncukları 1 mL RIPA lysis tamponu ile RT'de 1 dakika boyunca dengeleyin.
  3. Her yıkamadan sonra, 3 dakika boyunca boncukları adsorb ve yavaşça pipetleme tarafından çözelti kaldırmak için manyetik raf kullanın.
  4. 8.2 ve 8.3 adımlarını yineleyin.
  5. Tuzsuz protein ekstresini dengelenmiş streptavidn-C1 konjuge manyetik boncuklara aktarın.
  6. Tüpü 4 °C'de 12 saat (veya bir gece) için bir rotatörde kuluçkaya yatırın ve biyotinylated proteinleri arındırın.
  7. Boncuklar tüpün bir tarafında toplanana kadar 4 dakika boyunca RT'de manyetik bir rafta boncukları yakalayın ve ardından pipetle süpernatantı nazikçe çıkarın.
  8. Tüpe 1,7 mL yıkama tamponu I (sudaki %2 SDS) ekleyin ve 8 dk. Tekrar adım 8.3 için RT'de rotatorda tutun.
  9. Tüpe 1,7 mL yıkama tamponu II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, %0,1 deoksikolik asit [w/v], %1 Triton X-100) ekleyin ve 8 dk. tekrar adım 8.3 için RT'de rotator da saklayın.
  10. Tüpe 1,7 mL yıkama tamponu III (10 mM Tris-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, %0.1 deoksikolik asit [w/v], %1 NP40 [v/v]) ekleyin ve 8 dk. RT'de rotatorda tutun 8,3 adımını tekrarlayın.
  11. Deterjanı çıkarmak için 50 mM Tris-HCl'nin (pH = 7,5) 1,7 mL'sini ekleyin ve 8.3 adımını tekrarlayın.
  12. Boncukları yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve 8.11 ve 8.3 adımlarını tekrarlayın.
  13. Boncukları 5 dk'lık 6x'lık her bir dakika boyunca 50 mM amonyum bikarbonat tamponuyla RT'de yıkayın.
  14. Manyetik boncuklara 1 mL 50 mM amonyum bikarbonat tampon ekleyin ve iyice karıştırın.
  15. Biyotinylated proteinlerin zenginleşmesini onaylamak için immünoblot analizi için 100 μL boncuk çıkarın. Tipik bir batı lekesi Şekil 3'tegösterilmiştir.
  16. Geri kalan protein örneklerini flash-freeze ve -80 °C'de depolanan veya kuru buz üzerinde LC-MS/MS analizi için hemen gönderin.
    NOT: Tipik MS sonuçları bir önceki yayında görüntülenir (Zhang ve ark. 2019; Şekil 2, Ek Veri 1 ve Ek Veri 2)11. Tüm veri kümeleri MassIVE mevcuttur (bulunan ) tanımlayıcı kullanarak: MSV000083018 ve MSV000083019.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokole dayalı olarak beklenen sonuçları gösteren temsili veriler, Zhang ve ark11'denuyarlanmıştır. Şekil 1 N. benthamianaTurboID tabanlı PL gerçekleştirmek için prosedürleri özetler. Şekil 2, inmiş N. benthamiana yapraklarındaki protein ekspresyonu ve biyotinylasyonunu göstermektedir. Şekil 3, sızmış yapraklarda biyotinylated proteinlerin verimli sonraki kütle spektrometresi ana...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TurboID biotin ligaz BioID10maya ekran tabanlı yönlendirilmiş evrim tarafından oluşturulur. Diğer PL enzimlerine göre birçok avantajı vardır. TurboID, optimum büyüme sıcaklığı 25 °C10civarında olan sinek ler ve solucanlar da dahil olmak üzere diğer model sistemlerine PL uygulamasına olanak sağlar. PL yaklaşımı hayvan sistemlerinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bitkilerde uygulanması sınırlıdır. Burada açıklanan protokol N. benthamianaTurboID tabanlı PL kurma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Transgenik Bilim ve Teknoloji Programı (2019ZX08010-003-003'ten Y.Z.'ye), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (31872637'den Y.Z.'ye) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (2019TC028-Y.Z.) ve NSF-IOS-1354434,. NSF-IOS-1339185 ve NIH-GM132582-01 Için S.P.D.K.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
721 SpektrofotometreMetash, Çin'de üretilmiştir 600 < / sub> ölçümü için Q /SXFZ6
Amonyum bikarbonatSigmaA6141-500G
BiotinSigmaB4639-1G50 mM Stok
SantrifüjEppendorfSantrifüj 5702
SantrifüjEppendorfSantrifüj 5417R
cOmplete Proteaz İnhibitörü KokteylRoche11697489001
Deoksikolik asitSigmaD2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT)VWR Yaşam Bilimleri0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001Afinite saflaştırma için
EDTASigmaE6758-500G
ELISA plakasıCorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Hidroklorik asit (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P PVDF membranMilliporeIPVH00010Western blot analizi için
Lityum klorür çözeltisi (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Düşük hızlı soğutmalı santrifüjZonkia, Çin'de üretilmiştirKDC-2046
Magnezyum Klorür, Heksahidrat (MgCl2< / sub> ve orta nokta; 6H < alt > 2 < / alt > O)SigmaM9272-500G
Manyetik rafInvitrogen123.21DBoncuk adsorpsiyonu için
Multiskan FC Mikroplaka Fotometre ThermoFisherScientific N07710OD 59<5 / sub > ölçümü
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Sıçan anti-HARoche 11867423001
döner karıştırıcıKylin-Bell Lab InstrumentWH-986
Labotery, Çin'de üretilmiştirZQPZ-228
Sodyum Klorür (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Sodyum deoksikolatSigmaD2510-100G
Sodyum dodesil sülfat (SDS)SigmaL4390-1KG
Streptavidin-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma tabanıSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Su ceketi İnkübatörüMavi pard, Çin'de üretilmiştirGHP-9080 Agrobacterium< / em> inkübasyonu için
Biyotinin uzaklaştırılması için Zeba Spin Tuz Giderme KolonuThermo Fisher Scientific89893
OD IP Şok inkübatörü için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
  3. Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
  4. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
  6. Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
  7. Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212(2018).
  8. Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
  9. Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326(2019).
  10. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252(2019).
  12. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
  13. Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
  14. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864(2019).
  15. Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468(2011).
  16. McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
  17. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  18. Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
  19. Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

TurboID Yak nl k EtiketlemesiProtein Protein Etkile imleriNLR Ba kl k Resept rleriNicotiana benthamianaAgroinfiltrasyon ProtokolBiyotin UygulamasStreptavidin Zenginle tirmesiWestern Blot AnaliziK tle SpektrometrisiBitki Proteini Ekstraksiyonu

İlgili makaleler