Yöntem makalesi

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

DOI:

10.3791/60808

⸱

2 Nisan 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetiği değiştirilmiş (GM) farelerin kullanımı gen fonksiyonunu anlamak ve insan hastalıklarının altında yatan mekanizmaları çözmek için çok önemli hale gelmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi, araştırmacıların genomu eşi görülmemiş verimlilik, sadakat ve basitlikle değiştirmelerine olanak tanır. Bu teknolojiden yararlanarak, araştırmacılar GM fareler üretmek için hızlı, verimli ve kolay bir protokol arıyorlar. Burada, dondurulan çözülmüş embriyoların daha yüksek gelişimsel oranına yol açan tek hücreli embriyoların kriyopreservation için geliştirilmiş bir yöntem sıyoruz. Optimize elektroporasyon koşulları ile birleştirerek, bu protokol kısa bir süre içinde yüksek verimlilik ve düşük mozaik oranları ile nakavt ve knock-in farelerin üretimi için izin verir. Ayrıca, CRISPR reaktif hazırlama, in vitro fertilizasyon, kriyopreservation ve tek hücreli embriyoların çözülmesi, CRISPR reaktiflerinin elektroporasyonu, fare üretimi ve kurucuların genotiplemesini kapsayan optimize edilmiş protokolümüzün adım adım açıklamasını gösteriyoruz. Bu protokolü kullanarak, araştırmacılar benzersiz bir kolaylık, hız ve verimlilik ile GM fareler hazırlamak gerekir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kümelenmiş düzenli olarak uzaydan kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) sistemi genom1'debenzeri görülmemiş hedefli modifikasyon sağlayan bilimsel bir atılımdır. CRISPR/Cas9 sistemi Cas9 proteinve kılavuz RNA (gRNA) iki moleküler bileşenden oluşur: hedefe özel CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive CRISPR RNA (tracrRNA)2. Bir gRNA, Cas9 proteinini genomdaki spesifik lokusa, crRNA'ya bitişik 20 nükleotite ve protospacer bitişik motifine (PAM) yönlendirir. Cas9 proteini hedef sıraya bağlanır ve hatayatkın olmayan homolog uç birleştirme (NHEJ) veya yüksek sadakat homoloji yönelimli onarım (HDR)3,4,5tarafından onarılır çift iplikçikli sonları (DSBs) indükler. NHEJ eklemelere veya/ve silmelere (indels) ve dolayısıyla bir kodlama dizisi hedeflendiğinde gen kaybına yol açar. HDR homoloji dizileri içeren bir onarım şablonu varlığında hassas genom düzenleme yol açar3,4,5. NHEJ ve HDR sırasıyla nakavt ve nakavt fareler üretmek için harnessed edilmiştir.

CRISPR/Cas9 sistemi olağanüstü etkinlik ve sadakatle GM farelerinin neslini belirgin bir şekilde hızlandırmış olsa da, bu yöntemleri uygulayan bilim adamları genellikle teknik zorluklarla karşılaşır. İlk olarak, konvansiyonel protokoller döllenmişyumurta6,7pronükleus içine CRISPR düzenleme araçları tanıtmak için mikroenjeksiyon gerektirir. Bu teknik zaman alıcıdır ve genellikle kapsamlı bir eğitim gerektirir. Böylece, çeşitli gruplar elektroporasyon8ilemikroenjeksiyon yerine 8 ,9,10,11,12,13. Ancak, erken elektroporasyon protokollerinde elektroporasyon için taze embriyolar kullanılmıştır. Her deney den önce taze embriyo hazırlama zor olduğu için bu, başka bir soruna nedenoldu 14.

Son zamanlarda biz ve diğerleri gmfarelerinüretimini kolaylaştıran genom düzenleme için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanımı kombine ettik15 ,16. Bu protokol, gelişmiş embriyo manipülasyon becerileri olmadan araştırmacıların hızla yüksek verimlilik ile insan hastalıklarının hayvan modelleri oluşturmak için olanak sağlar. Protokol aynı zamanda önemli ölçüde kurucuları16genetik heterojenlik gibi GM fareler, üreten pratik zorlukları azaltır. Mozaiğiaşmak için, embriyo erimesinden sonra 1 saat içinde CRISPR reaktiflerinin elektroporasyonunu gerçekleştiriyoruz ve düzenlemenin genomun ilk replikasyonundan önce gerçekleşmesini sağlıyoruz. Başka bir gelişme istenmeyen mozaikazaltmak için Cas9 mRNA yerine Cas9 protein kullanımı içerir17. Ayrıca, tek hücreli embriyo kriyopreservation için optimal bir yöntem geliştirdik bu iki hücreli evre için gelişim hızını artırır16: fetal sığır serumu kullanımı (FBS) önemli ölçüde döllenme sonrası donma çözülmüş oositlerin hayatta kalma artırır, belki de donma çözülmüş unfertilized oositler daha esnek kılan aynı mekanizma ile18.

Burada tek hücreli C57BL/6J embriyoların kriyopreservation için modifiye yöntemi de dahil olmak üzere, dondurulmuş çözülmüş embriyolar kullanarak GM farelerin üretimi için kapsamlı bir protokol sıyoruz. Bu içerir 1) gRNA tasarım, CRISPR reaktif hazırlama ve montaj; 2) TEK hücreli embriyoların ivf, kriyoprezervasyon ve erime; 3) CRISPR reaktiflerinin dondurulmuş embriyolara elektroporasyonu; 4) Embriyo transferi sözde hamile dişi farelerin oviduct içine; ve 5) F0'nin kurucu hayvanlarının genotipleme ve dizi analizi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada yapılan tüm hayvan bakımı ve işlemleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'nin kural ve yönetmeliklerine göre gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokol Toyama Üniversitesi, Tokyo Üniversitesi, Jichi Üniversitesi ve Max Planck Florida Nörobilim Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Tüm reaktifler hakkında bilgiler Malzeme Tablosu'ndagösterilmiştir.

1. CRISPR reaktif tasarımı

  1. crRNA tasarımı
    1. Azaltılmış hedef dışı sitelere sahip belirli crRNA'lar tasarlamak için CRISPR direct19 (https://crispr.dbcls.jp/) adresini ziyaret edin.
      NOT: CrRNA20 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/) tasarlamak için diğer birçok yararlı araç vardır.
    2. Hedef nükleotid dizisini ekleyin ve aşağıdaki değişiklikleri yapın:
      PAM sıra gereksinimi = NGG
      Özgüllük kontrolü = Fare (Muş musculus) genomu, GRCm38/mm10 (Aralık, 2011)
      NOT: Örnek olarak, Tyrosinase (Tyr) nakavt fareler oluşturmak için, exon 2 (9476-9692 nükleotit dizisi) hedeflenmiştir.
    3. Tasarım'ıtıklatın ve son derece özel isabetler için Yalnızca Yüksek Özel Hedef Göster'i işaretleyin.
    4. Hedef dışı etkileri azaltmak için , "12 mer+PAM" ve "8 mer+PAM" sütunlarında en düşük değere sahip hedef sırasını seçin.
      NOT: Bu sütunlarda, ("1") dizinin hedeflenen hedef siteyle tek bir mükemmel eşleşmesi olduğunu ve birden büyük sayıların potansiyel hedef dışı sitelerin varlığını gösterdiğini gösterir.
    5. CrRNA sentez şirketlerinden elde edilen oligonükleotidleri sipariş edin (Supplimentary Tablo 1).
      NOT: Ekson 2 Tyr geni için aşağıdaki hedef dizi kullanılmıştır: GGACCACTATTACGTAATCC, PAM dizisi olarak +TGG ile(Şekil 2A).
  2. HDR aracılı düzenleme deneyleri için tek iplikçikli oligodeoksinükleotid (ssODN) tasarımı (yani, knock-in fare üretimi).
    1. SSODN uzunluğunu, her iki tarafta 30-60 nükleotit (nt) homoloji kolları da dahil olmak üzere 80-180 bp civarında tasarla.
      NOT: 30-35 nt homoloji kolu ve gRNA tamamlayıcısı dahil olmak üzere 75-85 nt uzunluğunda bir ssODN, yüksek knock-in düzenleme verimliliğigösterdi 21.
    2. Pam dizisine veya mümkün değilse, pam'in 5' komşu tabanında genom düzenlemesinden sonra yeniden kesmeyi engellemek için istenilen modifikasyonve sessiz mutasyonu yerleştirin.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan crRNA ve ssODN Ek Tablo 1'delistelenmiştir.

2. In vitro fertilizasyon, embriyo kriyopreservation ve donma-eritme

  1. İn vitro fertilizasyon
    1. Superovulate C57BL/6J dişi fareler (4 veya 8 haftalık) ip enjeksiyonu ile gebe mare serum gonadotropin (PMSG) enjeksiyonu ile takip 7.5 IU insan koryonik gonadotropin (hCG) sonra 48 saat.
      NOT: Yumurtalıkoosit sayısı ultra-superovulation22kullanılarak yaklaşık 3x artırılabilir.
    2. Cinsel olgun C57BL/6J erkek fareler (3-5 aylık) kauda epididimids kaldırın.
      NOT: Erkek farelerden ödün vermeden spermatozoa toplamak mümkündür.
    3. Bir diseksiyon iğnesi ile spermatozoa pıhtıları ayıklayın ve kapacitation için 1,5 saat boyunca CO2 kuluçka insan tubal sıvı (HTF) bir 200 μL damla onları kuluçka.
    4. HCG enjeksiyonundan sonra oviducts 16-18 h kümülüs kompleksleri (COCs) toplamak ve bir CO2 kuvöz parafin sıvı ile kaplı HTF orta taze bir 200 μL damla onları kuluçka 2 saat (5% CO2, 37 °C).
      NOT: CO2 inhalasyonu yoluyla ötanazi IVF ve embriyo gelişimini etkilediği için anestezi altında servikal çıkış ile farelerin kurban edilmesi tercih edilir23.
    5. Kuluçka ortamının sınırından COC içeren 200 μL'lik HTF ortamına 1-5 μL sperm süspansiyonu ekleyin ve 3 saat boyunca CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
    6. Kalan sperm ve kümülüs hücrelerini temizlemek için yumurtaları potasyum takviyesi simpleks optimizasyon ortamı (KSOM) ile yıkayın.
    7. Ters mikroskop kullanarak pronükleer oluşumunu ve tek hücreli embriyoların derecesini kontrol edin.
  2. Tek hücreli embriyoların kriyopreservation
    1. Tek hücreli embriyoları % 20 FBS içeren 200 μL'lik htf damlasında (parafin sıvısı ile kapsanmıyor) 10 dakika boyunca CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
    2. 20-100 embriyonun 50 μL'lik 1 Meditil sülfoksit (DMSO) çözeltisine aktarılması24.
    3. 100 embriyo içeren bir çözeltinin 5 μL'ini bir kriyotube'un dibine aktarın ve 0 °C'de 5 dakika boyunca soğutucu veya buz üzerinde serinlayın.
    4. 45 μL DAP213 (2 M dimethyl sulfoxide, 1 M asetamid ve 3 M propilen glikol) çözeltisini tüp duvarı boyunca yavaşça ekleyin, tüpleri kaplayın ve 5 dakika boyunca bir soğutucuda veya 0 °C'de buz üzerinde tutun.
      NOT: Numune erimesi sırasında kapakları kolayca çıkaramayacak kadar sıkı bir şekilde sabitlemeyin.
    5. Tüpleri sıvı nitrojende hızla saklayın.
  3. Embriyo erime
    1. Kriyotube'un kapağını açın, kalan sıvı nitrojeni atın ve önceden 37 °C'ye önceden ısıtılmış 0,25 M sakaroz çözeltisi 900 μL ekleyin.
      NOT: Soğuk çözeltinin kullanımı eritildikten sonra embriyo canlılığını azalttığı için 0,25 M sakaroz çözeltisi 37 °C'ye önceden ısıtılmalıdır.
    2. Pipet hızlı bir şekilde 10x ve plastik bir çanak içine kriyotube içeriğini aktarın.
      NOT: Pipetleme dikkatle yapılmalıdır, böylece kabarcıklar oluşturulmamalı ve embriyolara zarar verilmelidir.
    3. Morfolojik olarak normal döllenmiş yumurtaları parafin sıvısı ile kaplı KSOM ortamda 2x yıkayın ve elektroporasyona kadar CO2 kuluçka makinesinde tutun.

3. CRISPR reaktiflerinin montajı ve elektroporasyonu

NOT: Elektroporasyon için platin plaka elektrodu (yükseklik: 0,5 mm, uzunluk: 10 mm, genişlik: 3 mm, boşluk: 1 mm) ve daha önce8 (Malzeme Tablosu)tanımlanmış tek adımlı tip elektroporatör kullandık. İki aşamalı tip elektroporatör de kullanılabilir (Malzeme Tablosu).

  1. CRISPR reaktiflerinin hazırlanması ve montajı
    1. HDR aracılı düzenleme deneyleri yapıyorsanız CRISPR reaktiflerini (crRNA, tracrRNA ve Cas9 proteini) ve ssODN'yi sipariş edin(Malzeme Tablosu ve Ek Tablo 1).
    2. Annealing çözümlerini aşağıdaki gibi hazırlayın.
      1. Azaltılmış Serum Minimal Esansiyel Orta çözeltisinde(Malzeme Tablosu)1 μg/μL crRNA ve 1 μg/μL tracrRNA hazırlayın ve her çözeltiden çekirdeksiz tamponun 42°L'ine 6 μL ekleyin.
      2. Karışımı 95 °C'de kuru ısıtıcıda 3 dk ve RT'de 5 dk soğutun.
      3. Opti-MEM I'de seyreltilmiş 1 μg/μL HiFi Cas9 proteini hazırlayın ve toplam 60 μL hacim için önceki karışıma 6 μL ekleyin.
      4. HDR aracılı düzenleme denemeleri yaparken 6 μL 1 μg/μL ssODN ekleyin. Son hacim 60 μL olması gerektiğinden, adım 3.1.2.1'de 36 μL nükleaz içermeyen su kullanın.
        NOT: CrRNA, tracrRNA, Cas9 protein ve ssODN'nin son konsantrasyonu 100 ng/μL olacaktır.
      5. 100 embriyoyu tek delikli bir slayt camında son karışımın 25°L'sine (RNP kompleksi) aktarın ve 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  2. Elektroporasyon
    1. Elektrot boşluğunu CRISPR reaktiflerinin yeni karışımının 6 μL'si ile doldurun ve karışıma 20-25 embriyo ekleyin.
      NOT: Bu embriyolar ve elektroporasyon elektrot arasında herhangi bir temas önlemek için önemlidir, hangi elektrik darbeleri sırasında embriyolara zarar verebilir.
    2. Tek adımlı tip elektroporatör için elektroporasyonu aşağıdaki koşullarda gerçekleştirin:
      Gerilim: 25 V, Darbe yönü (Pd) +
      ACI: 3 ms, KAPALI: 97 ms
      Tekrareder: 5x
      NOT: Elektroporasyon, mozaikliği önlemek için genom düzenlemesinin ilk DNA çoğaltılmasından önce gerçekleşmesini sağlamak için çözülmeden sonra en fazla 1 saat yapılmalıdır.
    3. İki aşamalı tip bir elektroporatör için koşulları aşağıdaki gibi ayarlayın:
      Poring Pulse = 40V, Pd +
      ON = 1 veya 2,5 ms; Darbe aralığı = 50 ms
      Tekrarlar: 4x, Çürüme 10%

      Transfer Darbesi = 5 veya 7V; Pd +/-.
      ACI: 50 ms; Nabız aralığı = 50 ms.
      Tekrarlar = 5x; Çürüme = %40.
      NOT: Empedansı üretici tarafından belirtilen belirli aralıkta korumak için ses düzeyini ayarlamak önemlidir.
    4. Modifiye Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon 2 (M2) orta parafin sıvı ile kaplı KSOM orta bir damla ile iki yıkar sonra embriyolar 3x yıkayın.
    5. Yıkanmış embriyoları (KSOM ortamda) daha fazla transplantasyon için bir gecede CO2 kuvözde kuluçkaya yatırın.

4. Embriyo transferi

  1. Sözde hamile dişi fareler hazırlayın. Mate ICR dişi fareler (3-6 ay) vazektomi erkek fareler ile 1 gün önce embriyo transferi (ET).
    NOT: Fareler bir copulatory fiş için ertesi sabah kontrol edilmelidir. Fişi olan fareler sözde gebe olarak kabul edilir ve ET için kullanılabilir.
  2. Başarılı implantasyon için bir belirteç olarak cam kılcal içine 2-3 mm alternatif aralıklarla aspire hava ve KSOM (parafin sıvıolmadan).
  3. 20-24 embriyoyu 200 μL'lik bir KSOM damlasına (parafin sıvısı olmadan) getirin ve her oviduct'a implantasyon için 10-12 embriyoyu cam kılcal damara çekin.
  4. Dişi fareleri izofluran (inhalasyon) veya medetomidin/midazolam/butorphanol (sırasıyla 0.3 mg/kg, 4.0 mg/kg ve 5.0 mg/kg) birleştiren bir çözeltinin IP enjeksiyonu ile anestezi edin. Anestezili fareyi havalandırma tarafındaki bir ısıtma yastığına yerleştirin. Bir nemlendirici jel ile anestezili farenin gözlerini koruyun.
  5. Dorsal orta hattın alt kısmı boyunca tıraş ve povison iyot ile bölgeyi dezenfekte% 70 etanol ile takip.
  6. Dorsal orta hatta paralel uzun ~ 1 cm kesi yapın.
  7. Oviduct ve steril plastik bir perde üzerine yerleştirin. Sıcak steril salin kullanarak nemli tutun.
  8. Ovidük'u stereoskopik mikroskobun altına yerleştirin.
  9. Mikrobahar makas ile ampulla birkaç milimetre yukarı infundibulum ve ampulla arasında oviduct duvarına bir delik olun.
  10. Embriyoları içeren cam kılcal damarın ucunu deliğe yerleştirin ve ampulla bir hava kabarcığı görünene kadar embriyoları dışarı atmak için kılcal damar tutucunun ağızlık içine hafifçe üfler.
    NOT: Oviduct başına 10-12 embriyo transferi.
  11. Oviduct duvardan cam kılcal geri çekin ve yavaşça vücut boşluğuna geri üreme organı itin.
  12. Diğer oviduct içine embriyolar tanıtmak için önceki işlemi tekrarlayın.
  13. ET prosedürünü tamamladıktan sonra, peritonu basit bir kesit deseni (50, emilebilir, örgülü sentetik dikişler) ve sonra deriye basit bir kesme desen veya gömülü subcuticular kesmedikiş deseni ile dikme (60 absorbe edilemeyen, monosentetik dikişler).
  14. Fareyi anesteziden iyileşene kadar 37 °C'lik bir ısınma tabağı üzerinde sıcak tutun.
  15. Ameliyattan sonra 7 gün boyunca her gün hayvanın sağlığını takip edin.

5. Genotipleme ve dizi analizi

  1. Genomik DNA ekstraksiyonu
    NOT: Üreticinin önerileri doğrultusunda fare kulak dokusundan genomik DNA elde etmek için NucleoSpin doku DNA çıkarma kitleri kullandık.
    1. Numuneye 180 μL Tampon T1 ve 25°L Proteinaz K çözeltisi ekleyin ve 10 s girdap ile karıştırın.
    2. 56 °C'de 2 saat veya tam bir lisis elde edilene kadar kuluçkaya yatırın. Girdap kuluçka nın her 30 dakikasında 10 s.
    3. Tampon B3 200 μL ekleyin, 30 s için şiddetle girdap ve 10 dakika için 70 °C'de kuluçka.
    4. Numuneye ve girdaba güçlü bir şekilde 210 μL %100 etanol ekleyin.
    5. Her örnek için bir doku sütunu bir toplama tüpüne yerleştirin ve örneği kolona uygulayın.
    6. 1 11.000 x gde 1 dakika için santrifüj, akış atmak ve toplama tüpü içine sütun geri yerleştirin.
    7. Numuneyi yıkamak için 500 μL Tampon BW ekleyin (1. yıkama), 1 dk 11.000 x giçin santrifüj, akışı atın ve kolongeri toplama tüpüne yerleştirin.
    8. Sütuna 600 μL Arabellek B5 ekleyin (2. yıkama), 1 dakika için santrifüj 11.000 x g,akış atmak ve toplama tüpü içine sütun geri yerleştirin.
    9. Silika zarını kurutmak ve NucleoSpin doku kolonlarını 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirmek için 1 dk 11.000 x g'de kolonsantrik olun.
    10. Tampon BE 100 μL ekleyin, 1 dakika oda sıcaklığında kuluçka, sonra 1 11.000 x gsantrifüj 1 dk .
  2. PCR amplifikasyon ve arıtma
    1. Hedeflenen çekirgeyi çevreleyen 400-500 bp'lik bir diziyi yükseltmek için primer3 plus web sitesini (https://primer3plus.com/) kullanarak astarları tasarla.
    2. Yeni bir PCR protokolü tasarla ve ampirik olarak test edin.
    3. İstenmeyen enzimleri, nükleotitleri, astarları ve tampon bileşenlerini çıkarmak için PCR ürünlerini arındırın. Standart bir arıtma yöntemi aşağıdaki gibi kullanılabilir.
      1. PCR ürünlerinin 50 000'ine 50°L fenol ekleyin ve girdap ile karıştırın.
      2. 1 11.000 x g'de 1 dk santrifüj ve üst saydam katmanı yeni bir tüpe aktarın.
      3. 30 s için % 99,5 etanol ve 5 M amonyum asetat ve girdap 20 μL 120 μL ekleyin.
      4. 10 dk için RT'de tutun ve 10 dk için 11.000 x g'da santrifüj.
      5. Supernatant atın ve% 70 etanol 1 mL ile DNA pelet yıkayın.
      6. Peleti RT'de 10 dakika kurulayın ve 10 μL RNase serbest suda çözün.
        NOT: PCR kolon bazlı arınma kitleri fenol insanlar için toksik olduğu için yeniden yorumlanır.
  3. Sanger sıralama
    1. Saflaştırılmış PCR amplicon'u ölçmek için DNA niceleme analizini (bkz. Malzemeler Tablosu)çalıştırın.
    2. PCR ürün(ler) ve sıralama astarı(lar)ı sıralama hizmeti sağlayıcısına gönderin.
    3. Kullanılabilir çevrimiçi web sitelerini kullanarak diziyi analiz edin.
      NOT: Bu çalışmada, CRISP-ID25 (http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/) dizi analizi için kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

10 dk için FBS içeren HTF'de kuluçka dahil olmak üzere tek hücreli embriyoların kriyopreservation için modifiye yöntemimiz ve ardından 1 M DMSO ve DAP213 çözeltisinde kriyopreservation, dondurulan çözülmüş embriyoların gelişim hızını iki hücreli evreye iyileştirmiştir(Şekil 1, p = 0.009, Öğrencinin t-testi). Dondurulan çözülmüş embriyolar GM farelerin üretimi için kullanıldı ve elektroporasyon koşulları optimize edildi: Protokol bölümünde açıklandığı gibi elektroporatör kullanılarak 3 ms d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokol, yüksek verimlilik ve düşük mozaik oranlarıile GM farelerin üretimine olanak sağlar(Tablo 1). Gelişmiş embriyo manipülasyon becerileri olmadan araştırmacıların mutant fareleri kolayca yaratmalarını sağlar, çünkü hem üreme mühendisliği hem de genom düzenleme teknolojilerinde en son ve en yararlı gelişmelerden yararlanır: CRISPR/Cas9 ribonükleoprotein (RNP) ve dondurulmuş çözülmüş embriyolara elektroporasyon. Bu gelişmeler GM farelerin neslini kolaylaştırmadı ve hızlandırdı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların konuyla ilgili herhangi bir mali açıklamaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hitomi Sawada ve Elizabeth Garcia'ya hayvan bakımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 ve 16K01946) ve Hokugin Research Grant (H.N.'ye) ve Jichi Medical University Genç Araştırmacı Ödülü (H.U.'ya) tarafından desteklenmiştir. Otsuka Toshimi Burs Vakfı, Yüksek Angeles'ı destekledi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.25 M SükrozARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonya)SÜKROZ
1 M DMSOARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonya)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japonya)Vetorphale 5mg
Cas9 proteini: Alt-R® SP HiFi Cas9 Nükleaz 3NLSEntegre DNA Teknolojileri, Inc. (Coralville, IA)1081060
C57BL / 6J farelerJaponya SLC (Hamamatsu, Japonya)Yok
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonya)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)ES-009-C
hCGMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japonya)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonya)HTF
ICR fareleriJaponya SLC (Hamamatsu, Japonya)N/A
IsofluranPetterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonya)KSOM
LN2 TankGrafiği Endüstrileri (Top Zemini, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonya)M2
MedetomidinNippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. (Koriyama, Japonya)1124401A1060
MikroskopNikon Co. (Tokyo, Japonya)SMZ745T
MidazolamSandoz KK (Tokyo, Japonya)1124401A1060
Nükleaz içermeyen tamponEntegre DNA Teknolojileri, Inc. (Coralville, IA)1072570
Nucleospin DNA ekstraksiyon kitiTakara Bio Inc (Kusatsu, Japonya)740952 .5
Tek delikli sürgülü camMatsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japonya)S339929
Tek adımlı tip ElektroporatörBEX Co., Ltd. (Tokyo, Japonya)CUY21EDIT II
Parafin SıvıNACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japonya)SP 26137-85
Platin plaka elektrotBEX Co., Ltd. (Tokyo, Japonya)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Hayvan Sağlığı Co., Ltd (Tokyo, Japonya)SEROTROPIN 1000
Povidone iyodürProfesyonel Tek Kullanımlık Malzemeler International, Inc. (Orangeburg, NY)C12400
Azaltılmış Serum Minimal Esansiyel Ortam: OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)22600134
İki aşamalı tip ElektroporatörNepa Gene Co., Ltd. ( Ichikawa, Japonya)NEPA21

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  6. Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355(2013).
  7. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
  9. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  10. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382(2014).
  11. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315(2015).
  12. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  13. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  14. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474(2018).
  15. Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
  16. Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
  17. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  18. Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
  19. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  20. Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengineering. 6 (3), 63(2019).
  21. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811(2019).
  22. Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
  23. Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
  24. Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
  25. Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973(2016).
  26. Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
  27. Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
  28. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
  29. Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
  30. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  31. Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  32. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  33. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  34. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  35. Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR Cas9Embriyo ElektroporasyonuTek H creli EmbriyolarKriyoprezervasyon ProtokolIn Vitro FertilizasyonKnockout FarelerKnock In FarelerMozaisizmin Azalt lmas

İlgili makaleler