Yöntem makalesi

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

DOI:

10.3791/60829

⸱

27 Nisan 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sentetik hücrelerin yapımı için aşağıdan yukarıya montaj yaklaşımı, hücre taklit ortamında hücresel süreçleri izole etmek ve araştırmak için etkili bir araçtır. Ayrıca hücresiz ifade sistemlerinin geliştirilmesi, protein üretimini, transkripsiyon ve çeviri süreçlerini (DNA→RNA→protein) kontrollü bir şekilde yeniden oluşturma yeteneğini ortaya çıkararak sentetik biyolojiden yararlanmıştır. Burada güçlü bir bakteriyel lizat üretimi ve bu lizatiçinde kolesterol açısından zengin lipid bazlı unilamellar veziküller içinde kapsülleme dahil olmak üzere bir hücre serbest ifade sistemi hazırlamak için bir protokol tarif (GUVs) (yani, istikrarlı lipozomlar), sentetik hücreler oluşturmak için. Protokol, aktif bakteriyel lizatların üretimi de dahil olmak üzere sentetik hücrelerin bileşenlerinin hazırlanmasına yönelik yöntemleri açıklar ken, ardından sentetik hücrelerin petrol de-yağ da emülsiyon transfer yöntemine dayalı olarak adım adım hazırlanmasını sağlar. Bunlar, farklı protein türleri üretmek için yüksek çok yönlülük ile basit ve uygun fiyatlı bir şekilde sentetik hücrelerin milyonlarca üretimini kolaylaştırmak. Elde edilen sentetik hücreler izole bir ortamda protein/RNA üretimini ve aktivitesini araştırmak, yönlendirilmiş evrim de ve aynı zamanda vücutta ki terapötik proteinlerin isteğe bağlı üretimi için kontrollü bir ilaç dağıtım platformu olarak kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sentetik hücreler yapay hücre benzeri parçacıklar, bir canlı hücrenin bir veya birden fazla fonksiyonlarını taklit, bölme yeteneği gibi, membran etkileşimleri oluşturmak, ve genetik kod1dayalı proteinleri sentezlemek1 ,2,3. Hücre içermeyen protein sentezi (CFPS) sistemlerini içine alan sentetik hücreler, DNA şablonundaki değişikliklerden sonra çeşitli proteinler ve RNA dizileri üretme yetenekleri nedeniyle yüksek modülerliğe sahiptir. Protein üretiminin mevcut yaklaşımlarına cazip bir alternatif sunan CFPS sistemleri hücre lisat, saflaştırılmış bileşenler veya sentetik bileşenlere dayanır ve ribozomlar, RNA polimeraz, amino asitler ve enerji kaynakları (örn. 3 fosfogliserin ve adenin trifosfosfat)4,,5,6,7,8,9gibi protein sentezi için gerekli tüm transkripsiyon ve çeviri makinelerini içerir. Lipid veziküller içinde bir CFPS sisteminin kapsülleme canlı hücre 10 bağlı olmadan proteinlerin basit ve verimli üretim sağlar10. Ayrıca, bu platform doğal hücreler içinde bozulabilir peptidlerin sentezi sağlar, canlı hücreler için toksik proteinlerin üretimi, ve doğal olmayan amino asitler ile proteinleri değiştirmek11,12. Sentetik hücreler, hücresel yaşamı evrimsel bir perspektiften etkinleştirmek için gerekli olan minimal hücre bileşenlerini araştırmak için bir model olarak kullanılmıştır1,13. Sentetik hücreler de oluşturmak ve genetik devre uygulamak için kullanılan ve yönettiği evrim için modeller olarak14,15,16. Diğer çalışmalar, sentetik hücrelerin doğal hücrelerin biyolojik aktivitesini taklit etme yeteneği üzerinde durarak, diyabetli hastalarda beta hücreleri gibi hasarlı doğal hücrelerin yerini almayı hedeflemektedir17. Ayrıca, bu CFPS kapsülleme sentetik hücreleri çeşitli terapötik proteinler üretmek için yeteneği klinik kullanıma dahil olma potansiyelini göstermektedir18.

Burada, lipid vezikül içinde kapsüllenmiş bir CFPS sistemine dayalı RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin üretimi için aşağıdan yukarıya laboratuvar ölçekli bir protokol(Şekil 1)açıklıyoruz. Bu in vivo19terapötik bir protein ilacıyerinde üretimi için yeni ilaç dağıtım sistemleri olarak sentetik hücre platformlarının potansiyel kullanımını gösterir. Önceki çalışmalarda CFPS reaksiyonunun optimizasyonu ve hücre lysat ekibe hazırlık süreçleriaraştırılmıştır 4,8,20. Ayrıca, mikroakışkan ve polimer bazlı damlacık stabilizasyon yöntemleri21,22,23gibi hücre büyüklüğünde lipozom preparat için çeşitli teknikler uygulanmıştır, ayrıca lipozomların lipid bileşimi24,,25,26. Sunulan protokolde sentetik hücreler yağ da su emülsiyon transfer yöntemi kullanılarak üretilir ve kapsülleme işlemi düşük sıcaklıklarda (<4 °C)5,10,24,27,28olarak gerçekleştirilir. Bu hafif koşullar moleküler makine biyo-fonksiyonel bütünlüğünü korumak için olumlu olduğu bulunmuştur, yani ribozomlar ve proteinler27,29,30. Partiküllerin lipid bileşimi hem kolesterol hem de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC) oluşur. İlk tüm memeli hücre zarlarında bulunan ve membran istikrar, sertlik ve geçirgenlik azaltma için gerekli olan, ve ikinci memeli fosfolipid bileşimi taklit11,13. Hücresel transkripsiyon ve çeviri moleküler makine CFPS potens ve protein sentezini artırmak için pAR1219 plazmid overexpressing T7 RNA polimeraz ile dönüştürülür BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) suşu elde edilir. Bu sistem tanısal ve terapötik proteinler üretmek için kullanılmıştır, kadar moleküler ağırlıkları ile 66 kDa in vitro ve in vivo19,31. Aşağıdaki protokol, doğada protein sentezi ile ilişkili çok çeşitli temel sorulara cevap verebilen ve uyuşturucu dağıtım uygulamalarında da kullanılabilen sentetik hücre sisteminin üretimi için basit ve etkili bir yöntem sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Komple sentetik hücrelerin üretim protokolünün illüstrasyonu Şekil 1'desunulmuştur. Kullanıcının ihtiyaçlarına göre, protokolün protein ekspresyonu (bölüm 3.2) ve sentetik hücre oluşumu (bölüm 4) bölümleri de bağımsız olarak (bazı adaptasyonlarla) yapılabilir.

1. S30-T7 lysate hazırlanması

  1. Çizgi plaka E. coli BL21 (DE3) bakteri tek koloniler elde etmek için 50 g/mL ampisilin ile desteklenen bir LB-agar plaka üzerinde pAR1219 plazmid ifade T7 RNA polimeraz ile dönüştürülmüş.
  2. Başlangıç çözeltisi hazırlayın: Tek bir koloniyi 100 mL Erlenmeyer şişesinde 50 μg/mL ampisilin ile desteklenen 5 mL LB-media'ya dönüştürün ve 250 rpm ve 37 °C'de bir zemin kuvöz çalkalayıcı kullanarak bir gecede büyüyün. Yinelenenleri hazırlayın.
  3. Her 5 mL'lik starteri, 2 L Erlenmeyer şişesinde 50 μg/mL ampisilin ile desteklenen 500 mL TB ortama ayrı ayrı aşılayın ve 0.8-1'in OD600'üne ulaşana kadar 250 rpm ve 37 °C'de bir zemin kuvöz çalkalayıcı kullanarak büyütün. Spektrofotometre kullanarak periyodik olarak izleyin.
  4. T7 RNA polimeraz ekspresyonunun indüksiyonu için 100 mM IPTG stokunun 2-3 mL'sini (0,4 - 0,6 mM'ye ulaşmak için) ekleyin ve OD600,4'e ulaşana kadar kültürü büyütmeye devam edin.
  5. Her Erlenmeyer şişesinden gelen çözeltiyi 250 mL steril santrifüj tüpüne aktarın.
  6. 4 °C'de 10 dakika boyunca 7.000 x g'de santrifüj. Supernatant atın.
    NOT: Bu aşamada, bakteriyel pelet sonraki adımlara geçmeden önce birkaç gün -20 °C'de saklanabilir.
  7. Her peleti 250 mL soğuk (4 °C) S30 lysate tampon ve santrifüj de 7.000 x g'de 10 dakika 4 °C'de yeniden askıya alın.
    NOT: S30 lizat tamponu, hücre lizisi adım 1.9'da homogenizer kullanılarak yapıldıktan sonra protein stabilitesini korumak için kullanılır. Bu adımdan itibaren 1.12'ye kadar olan tüm adımlar art arda ve hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
    NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce, tüyoları ve 1,5 mililitrelik şişeleri önceden soğutun.
  8. Supernatant atın ve soğuk S30 lysate tampon 15 mL birlikte tüm peletleri yeniden askıya. Süspansiyonu gazlı bez ped kullanarak filtreleyin.
    NOT: 15ml çözelti homogenizer min. hacimden kaynaklanmaktadır. Bakteri konsantrasyonu da önemli olduğu unutulmamalıdır.
  9. Hücre kırılması için 4 bar (iki geçiş) hava basıncı ile 15.000 psi çalışma basıncında homojenleştirin. Daha konsantre ve aktif bir sıvı için çözelti seyreltmekaçının.
  10. Homojenleştirilmiş süspansiyonun 10 mL'si başına 0,1 M DTT (DİkKAT) 100 μL ekleyin.
  11. Süspansiyonu 24.700 x g'de 30 dk 4 °C'de santrifüj edin.
  12. Lysate aktivitesini korumak için aşağıdaki adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin: supernatant'ı önceden soğutulmuş 1,5 mL şişelerde 200 μL'ye bölün ve hemen sıvı nitrojenle dondurun. Daha fazla kullanım için -80 °C'de saklayın.
    DTT: DTT Tahriş edici ve Zararlı olarak sınıflandırılır ve bu nedenle dikkatli davranılmalıdır.

2. Yağ çözeltisinde lipidlerin hazırlanması

  1. POPC ve kolesterolü kloroformda (DİkKAT) ayrı ayrı çözün, her biri 100 mg/mL'lik son konsantrasyona kadar. Girdap her şişe ayrı ayrı.
    1. Bileşenleri 2mL cam şişede birleştirin: kloroformda 50 μL POPC, kloroformda 50 μL kolesterol ve 500 μL mineral yağ ekleyin. Sentetik hücrelerin 100 μL için, yağ lipidlerin 2 şişe gereklidir.
    2. Girdap, ve sonra kloroform buharlaştırmak için kimyasal bir başlık 80 °C'de yaklaşık 1 saat ısı. Belirtilen zamanı/koşulları izleyerek ve çözüm hacmini izleyerek tam buharlaşma nın meydana geldiğinden emin olun.
      NOT: Elde edilen lipid-in-oil çözeltisi iki haftakadar oda sıcaklığında saklanabilir. Daha iyi sonuçlar için, her denemeden önce yeni bir hazırlık kullanılması önerilir. Lipid ve kolesterol oranları istenilen membran bileşimine göre değiştirilebilir. Kolesterol yüksek konsantrasyonson sentetik hücre çözeltisi agregaoluşumuna yol açabilir.
      DİkKAT: Kloroform Tahriş edici ve Zararlı olarak sınıflandırılır ve bu nedenle dikkatli ve duman ekstraksiyonu olan alanlarda tedavi edilmelidir.

3. Dış, iç ve dış çözeltilerin preparatları

  1. Stok çözümlerinin hazırlanması
    1. Ultra saf su (UPW) kullanarak Tablo 2'de listelenen stok çözümlerini hazırlayın.
      NOT: Stok çözümleri önceden hazırlanmalı ve ileri kullanıma kadar -20 °C'de saklanmalıdır. Reaktif 7 agregalar oluşturma eğilimindedir. 37 °C'ye Kadar Isıtma toplamayı azaltacaktır. Hafif toplama reaksiyonu önemli ölçüde etkilemez. Reaktif 8 çözeltisi sütlü ve bulanıktır.
  2. Dış çözelti
    1. DNase/RNase içermeyen H2O'daki glikozu 200 mM'lik son konsantrasyona kadar çözündürün.
    2. 100 μL iç çözelti için 1,6 mL dış çözelti hazırlayın.
  3. İç öncesi çözüm
    1. Tablo 2'delistelenen miktarlara ve konsantrasyona göre 1-14 reaktif ekleyin. Örneğin, 100 μL'lik son sentetik hücre hacmi için 100°L iç çözelti hazırlayın.
      NOT: Gerekli son hacmi tamamlamak için UPW eklenmelidir. Bu aşamada karışım 4 °C'de birkaç saat saklanabilir.
  4. Besleme çözeltisi
    1. Tablo 3'te listelenen miktarlara ve konsantrasyona göre tüm reaktifleri ekleyin.
      NOT: Besleme çözeltisinin 1:1 oranını kullanın:iç çözelti. 100 μL'lik son sentetik hücre hacmi için 100 μL besleme çözeltisi hazırlayın. Bu dış, iç ve besleme çözeltisi küçük bir aşırı hacim hazırlamak için tavsiye edilir.

4. Sentetik hücrelerin hazırlanması

NOT: Aşağıdaki hacimler 100 μL sentetik hücre hazırlanması için ayarlanır.

  1. Protein üreten sentetik hücreler
    1. 15 mL'lik bir tüpte, dış çözeltinin 12 mL'sini yerleştirin ve yağ çözeltisindeki 500 μL'lik lipitleri yavaşça bir tabaka üzerine ekleyin. 20 dk oda sıcaklığında kuluçka.
    2. İç çözelti hazırlamayı sonuçlandırmak için: ezilmiş buzun üzerindeki iç çözelti malzemelerini, depolanan karışıma S30-T7 Lysate (reaktif 15) ve DNA plazmidi (reaktif 16) ekleyerek 100°L'lik son bir hacme karıştırın.
    3. Yağ çözeltisinde 500 μL lipid içeren ikinci 2 mL cam şişeye iç çözeltinin 100 μL'sini ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle 1 dakika ve girdap için başka bir dakika için seviye beş.
      1. Ezilmiş buz üzerinde 10 dakika kuluçka ve yavaş yavaş 15 mL tüp (4.1.1 itibaren) yağ fazı üstüne sonuç emülsiyon ekleyin.
    4. 10 00 x g ve 4 °C'de 10 dk santrifüj ve 400 x g ve 4 °C'de 10 dk santrifüj. Santrifüj sonunda tüpün alt kısmında bir pelet gözlenmelidir.
      NOT: Yağdaki su damlacıklarının interfazdan geçişi sırasında ikinci bir yağ tabakasının daha iyi bir kapsama alanı elde etmek için burada sallanan bir kova santrifüj rotor kullanmak tercih edilir. Gözlemlenebilir pelet olmaması durumunda santrifüj hızı 1000 x g'yeçıkarılabilir. Aksi takdirde, dış çözümün özgül ağırlığına atıfta bulunan Tartışma bölümüne bakın.
    5. Peleti çıkar.
      1. Fazla yağ tabakasını çıkarın.
      2. Peleti çıkarmak için yaklaşık 400 μL dış çözelti ile yüklenmiş kesilmiş pipet ucu kullanın. Sulu fazda sadece pelet toplamak için yağ aşamasından geçerken dış çözeltibırakın.
        1. Yağ kalıntılarının akmasını önlemek için peletin çıkarılmasından sonra ucu silin ve peleti temiz bir 1,5 mL tüpe aktarın.
    6. 10 dk 1.000 x g ve 4 °C'de santrifüj, süpernatantı çıkarın ve 100 μL besleme çözeltisi (iç besleme çözeltilerinin 1:1 oranı) içinde peleti yeniden askıya alın.
      NOT: Burada sabit açılı santrifüj rotor da kullanılabilir.
    7. Protein ekspresyonu için, 37 °C'de 2 saat boyunca titremeden kuluçkaya yatırın.
      NOT: Optimal kuluçka süresi farklı proteinler arasında değişir.
    8. Üretilen protein miktarını hedef protein özelliklerine göre uygun bir yöntemle değerlendirin.
  2. Önerilen kontrol grupları
    1. İç çözelti ve lysate aktivite onayı
      1. Tam bir iç çözelti hazırlayın (DNA & S30-T7 lysate ile).
      2. 250 rpm'de bir zemin kuvöz çalkalayıcı veya 1200 rpm'de termomik eritme kullanarak yukarıdaki reaksiyonu 2 saat boyunca 37 °C sabit sıcaklıkta hemen kuluçkaya yatırın.
        NOT: Sentetik hücre kuluçka süresine uyacak şekilde kuluçka süresini ayarlayın.
    2. Sentetik hücreler
      1. Negatif kontrol grubu: 4.1'de sunulan protokolü DNA'sız iç solüsyonile hazırlayın.
      2. Pozitif kontrol: 4.1'de sunulan protokolü, muhabir gen için T7 plazmid kodlaması içeren iç solüsyon ile hazırlayın.
        NOT: Kapsülleme verimliliği adımını sağlamak için test gruplarının yanı sıra sfGFP gibi bir muhabir geninden oluşan pozitif bir kontrol grubu ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipid veziküllerin içinde BL21 E. coli tabanlı bir S30-T7 CFPS sistemini kapsülleyerek sentetik hücrelerin hazırlanması için bir protokol salıyoruz. Her aşamanın bir görüntüsünü içeren hazırlık sürecinin şematik bir açıklaması Şekil 2'devettir. Sentetik hücre hazırlama sürecinin başarısı her aşamanın uygun performansına bağlıdır ve farklı parametrelerden etkilenir. Protokol belirli bir proteinin üretimini karşılamak için ayarlanmalıdır.

T7 organizatörü al...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, büyük miktarlarda protein üreten sentetik hücrelerin üretimi için basit ve uygun fiyatlı bir yöntem tanıetmektedir. Etkin hücrelerin verimi, birkaç kritik adıma vurgu ile protokolün dikkatli ve doğru uygulanmasına bağlıdır. Bu yöntemin lizate hazırlama bölümünde, bakteri lizate proteinlerin yeterli miktarda elde etmek için hücre lizis önce uygun bakteri yoğunluğuulaşmak esastır. İkinci olarak, lysis işlemi 4 °C'de yapılmalı ve protein aktivitesini korumak için sıvı nitrojen ile hızlı bir şekilde dondurulmuş ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ERC-STG-2015-680242 tarafından desteklenmiştir.

Yazarlar ayrıca Technion Entegre Kanser Merkezi (TICC) desteğini kabul; Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü; Kamyon I. Lokey Disiplinlerarası Yaşam Bilimleri ve Mühendislik Merkezi; Kamin Hibesi için İsrail Ekonomi Bakanlığı (52752); İsrail Bilim Teknoloji ve Uzay Bakanlığı - Baş Bilim Adamı Ofisi (3-11878); İsrail Bilim Vakfı (1778/13, 1421/17); İsrail Kanser Derneği (2015-0116); GIF Young hibesi için Alman-İsrail Bilimsel Araştırma ve Geliştirme Vakfı (I-2328-1139.10/2012); Avrupa Birliği FP-7 IRG Kariyer Entegrasyonu Hibeprogramı (908049); Fosfolipid Araştırma Merkezi Hibe; Bir Rosenblatt Kanser Araştırmaları Vakfı, Mallat Aile Vakfı Hibe; ve Unger Aile Vakfı. A. Schroeder Alon ve Taub Bursları'nı kabul ediyor. O. Adir, Sherman ve Gutwirth burslarını kabul eder. G. Chen, Sherman Bursu'nu kabul ediyor. N. Krinsky, Rothschild Caesarea Vakfı'nın Barones Ariane de Rothschild Kadın Doktora Programı'nı kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
A. Adım 1 için gerekli reaktifler (S30-T7 lizat hazırlama)
E.coli BL21 (DE3) NEBC2527E.coli BL21 (DE3).
Dönüşüm için pAR1219SigmaT2076TargeTron vektörü.
50 mg / mL AmpisilinSigmaA9518-20 ° C'de saklanır.
10 g/L Bacto-triptonBD Bioscience 211705Luria Bertani (LB) agar (% 1.5) plakasının hazırlanması için.
10 g/L Sodyum klorür (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L Bacto-Yeast özütüBD Bioscience 212750
15 g/L Agar agar saflaştırılmışMerck1.01614.5007
50 &mikro; g/mL AmpisilinSigmaA9518
10 g/L Bakto-triptonBD Bioscience 211705Luria Bertani (LB) ortamının (20 mL) hazırlanması için.
10 g/L Sodyum klorür (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L Bacto-Yeast özütüBD Bioscience 212750
50 ve mikro; g/mL AmpisilinSigmaA9518
12 g/L Bacto-triptonBD Bioscience 211705Müthiş Et Suyu (TB) ortamının (1 L) hazırlanması için.
24 g/L Bacto-Yeast özütüBD Bioscience 212750
%4 (h/h) Gliserol susuzBio-Lab7120501
2,32 g/L K2HPO4Spektrum kimyasalıP1383
12,54 g/L KH2PO4Spektrum kimyasalıP1380
  50 ve mikro; g/mL AmpisilinSigmaA9518
100 mM İzopropil ve beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) INALCOINA-1758-14000.2 & mikro kullanılarak filtrelenmiştir; m hidrofilik PVDF şırınga filtresi.
0.1 M ditiotreitol (DTT) stok çözeltisi TCID10710.2 & mikro kullanılarak filtrelenmiştir; m hidrofilik PVDF şırınga filtresi.
pH = 7.4'te 10 mM Tris-asetatSigmaT1503S30 lizat tamponu (1.5 L)
14 mM magnezyum asetatMerck1.05819.0250
60 mM potasyum asetatCarlo Erba470147
1 mM DTTTCID1071
0.5 mL/L 2-merkaptoetanolSigmaM6250
Adım 1 için gerekli ekipman
100 mL sterilize Erlenmeyer şişeleriThermo Scientific50-154-28462 şişe
2 L sterilize Bölmeli Erlenmeyer şişeleriKIMAX-KIMBLE256302 şişe
Zemin inkübatörü çalkalayıcıMRCTOU-120-2Laboratuvar çalkalayıcı inkübatörü 450x450mm, 400rpm, 70 > C
SantrifüjThermo Scientific75004270(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Sabit Açılı Rotor.
En az 13.000 x g.        * 4 ° C'ye önceden soğutulmuştur.
Yüksek basınçlı homojenizatörAVESTINEmulsiFlex-C34 ° C'ye kadar önceden soğutulmuştur.
-80oC dondurucuSO-LOWU85-18
Sterilize edilmiş 1,5 mL plastik tüplerEppendorf30120086Tercihen -20 ° C'ye kadar önceden soğutulmuş.
SpektrofotometreTECANIN-MNANOInfinite M200 pro
96 kuyulu şeffaf plakaThermo Scientific167008
Sterilize dereceli silindirCorning
Sterilize santrifüj tüpleriEppendorf30120086Tercihen -20 ° C'ye kadar önceden soğutulmuştur.
Sterilize pipet uçlarıCorning: Tercihen -20 ° C'ye kadar önceden soğutulmuş.
Kırılmış buz kovasıBel-ArtM18848-4001
Küçük sıvı nitrojen tankıNALGENE4150-4000
B. Adım 3 için gerekli reaktifler (yağ çözeltisi hazırlamadaki lipitler):
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC)Lipoid556400Toz
KolesterolSigmaC8667Toz
KloroformBiyo-Lab3082301
Mineral yağSigmaM5904Hafif yağ
Adım 2
Vorteks karıştırıcıBilimsel endüstrilerSI-0256
Isıtma bloğuTECHNEFDB03AD80 ° C.
'ye kadar önceden ısıtılmış Kontrollü sıcaklığı etkinleştirmelidir. 
2 mL vidalı boyunlu cam şişelerCSI Analitik YeniliklerVT009M-1232Daha büyük bir ölçek için 50 mL şahin kullanın ve döner buharlaştırıcı kullanarak kloroformu buharlaştırın.
9mm Vidalı KapakCSI Analitik YeniliklerC395R-09LC
C. Adım 3 için gerekli reaktifler (iç ve besleme reaksiyonu karışımları):
HEPESSpectrumH10891 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH tamponu
Potasyum hidroksit (KOH)Frutarom55290
1 M Magnezyum asetatMerck1.05819.0250Kofaktör ve negatif yük stabilizörü.
1 M Potasyum asetatCarlo Erba470147Negatif yük stabilizörü.
5.2 M Amonyum asetatMerck1.01116.1000Negatif yükü stabilize eder.
%50 (a/h) Polietilen glikol 6000 (PEG)Merck8.07491.1000Makromoleküllerin konsantrasyonunu arttırır.
0,5 M 3-fosfogliserat (3-PGA)SigmaP8877İkincil enerji kaynağı.
50 mM Amino asit karışımı ISigmaLAA21-1KTAmino asit katkı maddesi.
içerir: Aşağıdaki 17  doğal amino asitlerin her birinden 50 mM - alanin, arginin, asparagin, aspartik asit, sistein, glutamin, glutamik asit, glisin, histidin, izolösin, lösin, lizin, metiyonin, prolin, serin, treonin ve valin.
50 mM Amino asit karışımı IISigmaLAA21-1KTAmino asit katkı maddesi.
İçindekiler: Aşağıdaki 3 doğal amino asidin her birinden 50 mM - triptofan, fenilalanin ve tirozin.
100 mM Adenin trifosfat (ATP)SigmaA3377Nükleotidler ve enerji kaynağı.
50 mM Guanidin trifosfat (GTP)SigmaG8877Nükleotidler ve enerji kaynağı.
100 mM Üridin trifosfat (UTP)ACROS ORGANICS226310010Nükleotid katkı maddesi.
100 mM İzopropil ve beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)INALCOINA-1758-1400Gen ekspresyon indüksiyonu.
2 M SükrozJ.T. Baker1933078Yoğunluk gradyanı oluşturma.
2 M GlikozSigma16301Bir yoğunluk gradyanı oluşturma.
H2O UltraPure Water (UPW)Bio-Lab2321777500DNase & RNaz içermeyen
S30-T7 lizat__Adım1'de hazırlanmıştır.                                                                                                                                              Transkripsiyon kaynağı & çeviri bileşenleri.
-80 > c, kullanımdan hemen önce çökmüş buz üzerinde çözdürün.
Tercih edilen DNA plazmid stoğu__İstenen protein için diziyi içerir.
T7 promotor
D altında. Adım 4 için gerekli ekipman (sentetik hücrelerin hazırlanması)
Zemin inkübatörü çalkalayıcı veya ThermomixerMRCTOU-120-2Laboratuvar çalkalayıcı inkübatörü 450x450mm, 400rpm, 70 & C
PHMT Hibe Biyo PSC18Thermomixer
SantrifüjThermo Scientific75004270(75003629) - TX-400 4 x 400mL Sallanan Kova Rotoru.
15 mL boyutlu tüpler için uygundur.
Tercihen sallanan kovalar.
En az 1000 x g.
4 &°C'ye önceden soğutulmuş olmalıdır.
Masa santrifüjüThermo Scientific75002420(75003424) - ClickSeal.
ile 24 x 1,5/2,0 mL rotor Eppendorf şişeleri için uygundur.
4 ° C'ye kadar önceden soğutulmuştur.
Vorteks karıştırıcıBilimsel endüstrilerSI-0256
Kırılmış buz kovasıBel-ArtM18848-4001
2 mL vidalı boyunlu cam şişelerCSI Analitik YeniliklerVT009M-1232
Steril 15 mL plastik tüplerThermo Scientific339651
Sterilize 1,5 mL plastik tüplerEppendorf30120086
Sterilize pipet uçlarıCorningOtoklav ile sterilize edilmiştir.
stok çözeltisi için gerekli ekipman

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
  2. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
  3. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  4. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  5. Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
  6. Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
  7. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  8. Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
  9. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  10. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  11. He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
  12. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  13. Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
  14. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  15. Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
  16. Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
  17. Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
  18. Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
  19. Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163(2018).
  20. Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
  21. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
  22. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  23. Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
  24. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578(2014).
  25. Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
  26. Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
  27. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  28. Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
  29. Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  31. Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137(2016).
  32. Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79(2006).
  33. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  34. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  35. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).
  36. Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167(2017).
  37. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H creden Ar nd r lm EkstratlarProtein retimiLipozomla Kaps llemeEm lsiyon Transfer Y ntemiBakteriyel Lizat Haz rlamaAk Sitometrisi AnaliziWestern Blot TespitiFloresan MikroskopiKolesterol Zengin Lipozomlar

İlgili makaleler