Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

Özet

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Özet

Sentetik hücrelerin yapımı için aşağıdan yukarıya montaj yaklaşımı, hücre taklit ortamında hücresel süreçleri izole etmek ve araştırmak için etkili bir araçtır. Ayrıca hücresiz ifade sistemlerinin geliştirilmesi, protein üretimini, transkripsiyon ve çeviri süreçlerini (DNA→RNA→protein) kontrollü bir şekilde yeniden oluşturma yeteneğini ortaya çıkararak sentetik biyolojiden yararlanmıştır. Burada güçlü bir bakteriyel lizat üretimi ve bu lizatiçinde kolesterol açısından zengin lipid bazlı unilamellar veziküller içinde kapsülleme dahil olmak üzere bir hücre serbest ifade sistemi hazırlamak için bir protokol tarif (GUVs) (yani, istikrarlı lipozomlar), sentetik hücreler oluşturmak için. Protokol, aktif bakteriyel lizatların üretimi de dahil olmak üzere sentetik hücrelerin bileşenlerinin hazırlanmasına yönelik yöntemleri açıklar ken, ardından sentetik hücrelerin petrol de-yağ da emülsiyon transfer yöntemine dayalı olarak adım adım hazırlanmasını sağlar. Bunlar, farklı protein türleri üretmek için yüksek çok yönlülük ile basit ve uygun fiyatlı bir şekilde sentetik hücrelerin milyonlarca üretimini kolaylaştırmak. Elde edilen sentetik hücreler izole bir ortamda protein/RNA üretimini ve aktivitesini araştırmak, yönlendirilmiş evrim de ve aynı zamanda vücutta ki terapötik proteinlerin isteğe bağlı üretimi için kontrollü bir ilaç dağıtım platformu olarak kullanılabilir.

Giriş

Sentetik hücreler yapay hücre benzeri parçacıklar, bir canlı hücrenin bir veya birden fazla fonksiyonlarını taklit, bölme yeteneği gibi, membran etkileşimleri oluşturmak, ve genetik kod¹dayalı proteinleri sentezlemek^{1 ,2,3}. Hücre içermeyen protein sentezi (CFPS) sistemlerini içine alan sentetik hücreler, DNA şablonundaki değişikliklerden sonra çeşitli proteinler ve RNA dizileri üretme yetenekleri nedeniyle yüksek modülerliğe sahiptir. Protein üretiminin mevcut yaklaşımlarına cazip bir alternatif sunan CFPS sistemleri hücre lisat, saflaştırılmış bileşenler veya sentetik bileşe....

Protokol

NOT: Komple sentetik hücrelerin üretim protokolünün illüstrasyonu Şekil 1'desunulmuştur. Kullanıcının ihtiyaçlarına göre, protokolün protein ekspresyonu (bölüm 3.2) ve sentetik hücre oluşumu (bölüm 4) bölümleri de bağımsız olarak (bazı adaptasyonlarla) yapılabilir.

1. S30-T7 lysate hazırlanması

1. Çizgi plaka E. coli BL21 (DE3) bakteri tek koloniler elde etmek için 50 g/mL ampisilin ile desteklenen bir LB-agar plaka üzerinde pAR1219 plazmid ifade T7 RNA polimeraz ile dönüştürülmüş.
2. Başlangıç çözeltisi hazırlayın: Tek bir koloniyi 100 mL Erlenmeyer şişesinde 50 μg/mL ampisilin ile deste....

Sonuçlar

Lipid veziküllerin içinde BL21 E. coli tabanlı bir S30-T7 CFPS sistemini kapsülleyerek sentetik hücrelerin hazırlanması için bir protokol salıyoruz. Her aşamanın bir görüntüsünü içeren hazırlık sürecinin şematik bir açıklaması Şekil 2'devettir. Sentetik hücre hazırlama sürecinin başarısı her aşamanın uygun performansına bağlıdır ve farklı parametrelerden etkilenir. Protokol belirli bir proteinin üretimini karşılamak için ayarlanmalıdır.

T7 organizatörü al.......

Tartışma

Bu protokol, büyük miktarlarda protein üreten sentetik hücrelerin üretimi için basit ve uygun fiyatlı bir yöntem tanıetmektedir. Etkin hücrelerin verimi, birkaç kritik adıma vurgu ile protokolün dikkatli ve doğru uygulanmasına bağlıdır. Bu yöntemin lizate hazırlama bölümünde, bakteri lizate proteinlerin yeterli miktarda elde etmek için hücre lizis önce uygun bakteri yoğunluğuulaşmak esastır. İkinci olarak, lysis işlemi 4 °C'de yapılmalı ve protein aktivitesini korumak için sıvı nitrojen ile hızlı bir şekilde dondurulmuş .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
A. Adım 1 için gerekli reaktifler (S30-T7 lizat hazırlama)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
Dönüşüm için pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vektörü.
50 mg / mL Ampisilin	Sigma	A9518	-20 ° C'de saklanır.
10 g/L Bacto-tripton	BD Bioscience	211705	Luria Bertani (LB) agar (% 1.5) plakasının hazırlanması için.
10 g/L Sodyum klorür (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast özütü	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar saflaştırılmış	Merck	1.01614.5007
50 &mikro; g/mL Ampisilin	Sigma	A9518
10 g/L Bakto-tripton	BD Bioscience	211705	Luria Bertani (LB) ortamının (20 mL) hazırlanması için.
10 g/L Sodyum klorür (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast özütü	BD Bioscience	212750
50 ve mikro; g/mL Ampisilin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tripton	BD Bioscience	211705	Müthiş Et Suyu (TB) ortamının (1 L) hazırlanması için.
24 g/L Bacto-Yeast özütü	BD Bioscience	212750
%4 (h/h) Gliserol susuz	Bio-Lab	7120501
2,32 g/L K2HPO4	Spektrum kimyasalı	P1383
12,54 g/L KH2PO4	Spektrum kimyasalı	P1380
50 ve mikro; g/mL Ampisilin	Sigma	A9518
100 mM İzopropil ve beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	0.2 & mikro kullanılarak filtrelenmiştir; m hidrofilik PVDF şırınga filtresi.
0.1 M ditiotreitol (DTT) stok çözeltisi	TCI	D1071	0.2 & mikro kullanılarak filtrelenmiştir; m hidrofilik PVDF şırınga filtresi.
pH = 7.4'te 10 mM Tris-asetat	Sigma	T1503	S30 lizat tamponu (1.5 L)
14 mM magnezyum asetat	Merck	1.05819.0250
60 mM potasyum asetat	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-merkaptoetanol	Sigma	M6250
Adım 1 için gerekli ekipman
100 mL sterilize Erlenmeyer şişeleri	Thermo Scientific	50-154-2846	2 şişe
2 L sterilize Bölmeli Erlenmeyer şişeleri	KIMAX-KIMBLE	25630	2 şişe
Zemin inkübatörü çalkalayıcı	MRC	TOU-120-2	Laboratuvar çalkalayıcı inkübatörü 450x450mm, 400rpm, 70 > C
Santrifüj	Thermo Scientific	75004270	(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Sabit Açılı Rotor. En az 13.000 x g.        * 4 ° C'ye önceden soğutulmuştur.
Yüksek basınçlı homojenizatör	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	4 ° C'ye kadar önceden soğutulmuştur.
-80oC dondurucu	SO-LOW	U85-18
Sterilize edilmiş 1,5 mL plastik tüpler	Eppendorf	30120086	Tercihen -20 ° C'ye kadar önceden soğutulmuş.
Spektrofotometre	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96 kuyulu şeffaf plaka	Thermo Scientific	167008
Sterilize dereceli silindir	Corning
Sterilize santrifüj tüpleri	Eppendorf	30120086	Tercihen -20 ° C'ye kadar önceden soğutulmuştur.
Sterilize pipet uçları	Corning		: Tercihen -20 ° C'ye kadar önceden soğutulmuş.
Kırılmış buz kovası	Bel-Art	M18848-4001
Küçük sıvı nitrojen tankı	NALGENE	4150-4000
B. Adım 3 için gerekli reaktifler (yağ çözeltisi hazırlamadaki lipitler):
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC)	Lipoid	556400	Toz
Kolesterol	Sigma	C8667	Toz
Kloroform	Biyo-Lab	3082301
Mineral yağ	Sigma	M5904	Hafif yağ
Adım 2
Vorteks karıştırıcı	Bilimsel endüstriler	SI-0256
Isıtma bloğu	TECHNE	FDB03AD	80 ° C. 'ye kadar önceden ısıtılmış Kontrollü sıcaklığı etkinleştirmelidir.
2 mL vidalı boyunlu cam şişeler	CSI Analitik Yenilikler	VT009M-1232	Daha büyük bir ölçek için 50 mL şahin kullanın ve döner buharlaştırıcı kullanarak kloroformu buharlaştırın.
9mm Vidalı Kapak	CSI Analitik Yenilikler	C395R-09LC
C. Adım 3 için gerekli reaktifler (iç ve besleme reaksiyonu karışımları):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH tamponu
Potasyum hidroksit (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnezyum asetat	Merck	1.05819.0250	Kofaktör ve negatif yük stabilizörü.
1 M Potasyum asetat	Carlo Erba	470147	Negatif yük stabilizörü.
5.2 M Amonyum asetat	Merck	1.01116.1000	Negatif yükü stabilize eder.
%50 (a/h) Polietilen glikol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Makromoleküllerin konsantrasyonunu arttırır.
0,5 M 3-fosfogliserat (3-PGA)	Sigma	P8877	İkincil enerji kaynağı.
50 mM Amino asit karışımı I	Sigma	LAA21-1KT	Amino asit katkı maddesi. içerir: Aşağıdaki 17  doğal amino asitlerin her birinden 50 mM - alanin, arginin, asparagin, aspartik asit, sistein, glutamin, glutamik asit, glisin, histidin, izolösin, lösin, lizin, metiyonin, prolin, serin, treonin ve valin.
50 mM Amino asit karışımı II	Sigma	LAA21-1KT	Amino asit katkı maddesi. İçindekiler: Aşağıdaki 3 doğal amino asidin her birinden 50 mM - triptofan, fenilalanin ve tirozin.
100 mM Adenin trifosfat (ATP)	Sigma	A3377	Nükleotidler ve enerji kaynağı.
50 mM Guanidin trifosfat (GTP)	Sigma	G8877	Nükleotidler ve enerji kaynağı.
100 mM Üridin trifosfat (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nükleotid katkı maddesi.
100 mM İzopropil ve beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Gen ekspresyon indüksiyonu.
2 M Sükroz	J.T. Baker	1933078	Yoğunluk gradyanı oluşturma.
2 M Glikoz	Sigma	16301	Bir yoğunluk gradyanı oluşturma.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNaz içermeyen
S30-T7 lizat	_	_Adım	1'de hazırlanmıştır.                                                                                                                                              Transkripsiyon kaynağı & çeviri bileşenleri. -80 > c, kullanımdan hemen önce çökmüş buz üzerinde çözdürün.
Tercih edilen DNA plazmid stoğu	_	_	İstenen protein için diziyi içerir. T7 promotor
D altında. Adım 4 için gerekli ekipman (sentetik hücrelerin hazırlanması)
Zemin inkübatörü çalkalayıcı veya Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratuvar çalkalayıcı inkübatörü 450x450mm, 400rpm, 70 & C
PHMT Hibe Biyo	PSC18	Thermomixer
Santrifüj	Thermo Scientific	75004270	(75003629) - TX-400 4 x 400mL Sallanan Kova Rotoru. 15 mL boyutlu tüpler için uygundur. Tercihen sallanan kovalar. En az 1000 x g. 4 &°C'ye önceden soğutulmuş olmalıdır.
Masa santrifüjü	Thermo Scientific	75002420	(75003424) - ClickSeal. ile 24 x 1,5/2,0 mL rotor Eppendorf şişeleri için uygundur. 4 ° C'ye kadar önceden soğutulmuştur.
Vorteks karıştırıcı	Bilimsel endüstriler	SI-0256
Kırılmış buz kovası	Bel-Art	M18848-4001
2 mL vidalı boyunlu cam şişeler	CSI Analitik Yenilikler	VT009M-1232
Steril 15 mL plastik tüpler	Thermo Scientific	339651
Sterilize 1,5 mL plastik tüpler	Eppendorf	30120086
Sterilize pipet uçları	Corning		Otoklav ile sterilize edilmiştir.

stok çözeltisi için gerekli ekipman