Method Article

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

DOI:

10.3791/60850

⸱

May 1st, 2020

 ,  , 
1p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eIF4F kompleksinin oluşumu, insanlarda sıklıkla onkojenik aktivasyona uğrayan sinyal yollarının yakınsaması için anahtar aşağı akış düğümü olarak gösterilmiştir. eIF4F, çeviri başlatmanın mRNA-ribozom işe alım aşamasında yer alan bir kapak bağlama kompleksidir. Birçok hücresel ve klinik öncesi kanser modelinde, eIF4F'nin deregülasyonu, kanserin çoğalması ve sağkalımında rol oynayan spesifik mRNA alt kümelerinin çevirisinin artmasına yol açar. eIF4F, kapak bağlama alt birliği eIF4E, helicase eIF4A ve iskele alt birliği eIF4G'den inşa edilmiş hetero-trimerik bir komplekstir. Aktif eIF4F komplekslerinin montajı için kritik olan eIF4E ve eIF4G proteinleri arasındaki protein-protein etkileşimidir. Bu makalede, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin durumunu izleyen eIF4F derlemesini ölçmek için bir protokol açıklıyoruz. eIF4e:4G hücre bazlı protein-protein etkileşimi tahlili, eIF4F karmaşık bütünlüğündeki ilaç kaynaklı değişikliklerin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini de sağlar. Bu yöntemin ticari olarak mevcut bileşiklerin aktivitesini doğrulamak veya eIF4F kompleksinin oluşumunu verimli bir şekilde bozan yeni bileşiklerin veya modalitelerin daha fazla taranması için uygulanabileceğini öngörüyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen ekspresyonunun kontrolü, büyüme çoğalması ve farklılaşma gibi hücresel programların doğru yürütülmesinde önemli bir rol oynar. Gen transkripsiyonu düzeyinde veya mRNA çevirisi düzeyinde bir düzenleyici kontrol mekanizması uygulanabilir. Son on yılda, daha sonraki uzama ve sonlandırma adımları yerine başlatma sürecinin modülasyonu ile çeviri kontrolünün, çok çeşitli biyolojik işlevleri oynayan belirli protein alt kümelerinin sentezini ince bir şekilde düzenleyebileceği giderek daha belirgin hale gelmiştir.

Sağkalım, anti-otofajik ve anti-apoptotik yanıtlarda yer alan mRNA'ların artan çevirisi birkaç kansere karışmıştır ve ayrıca sapkın a....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEK293 hücre hattı protokol için kullanıldı ve Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu, 2 mM L-glutamin ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Modifiye Kartal Orta'sında kültürlendi. Hücreler nemlendirilmiş bir ortamda %5 CO2 ile 37 °C'de kültürlendi.

1. eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı test yoluyla eIF4F karmaşık bozulmanın nicel değerlendirmesi

  1. Hücre kültürü ve eIF4E geçici transfeksiyon:eIF4G604-646 tamamlayıcı test
    1. Tüm deneyler için 20'den az pasajlı yeni çözülmüş hücreler kullanın. 1. günde, standart bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin ve Trypan mavi dışlama ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin hassasiyetini doğrulamak için mTOR inhibitörleri kullanılarak eIF4F kompleks montajının 4EBP1 aracılı inhibisyonu değerlendirildi. 4EBP protein ailesinin mTORC1 kinaz bağımlı fosforilasyonunu inhibe ederek, mTOR inhibisyonu eIF4E'ye 4EBP1 ilişkisini geliştirir ve bu nedenle eIF4F sökme15. MTOR kinazlarının mekanistik olarak farklı inhibitörünün iki sınıfı test edilmiştir: mTORC1'in allosterik inhibitörleri olan a.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede açıklanan yöntem, canlı hücrelerde eIF4G-eIF4E etkileşiminin doğrudan ölçümü yoluyla eIF4F karmaşık montajını nicel olarak izlemek için luciferaz tabanlı bir tamamlayıcılık tahlili kullanır. EIF4E-eIF4G kompleasyon sisteminin kullanımı için ayrıntıları sağladık ve ayrıca sistemin eIF4E-eIF4G etkileşiminin ilaç kaynaklı 4EBP1 aracılı ayrışması ölçümlemede son derece doğru olduğunu gösterdik16. Bu tahlilin verimini kolaylaştırmak için, bu makalede açıklanan deneysel kurulum 96 kuyu mikro.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma p53lab (BMSI, A*STAR) ve JCO VIP hibesinden (A*STAR) çekirdek bütçe ile desteklendi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
293FT hücrelerThermo Fisher ScientificR70007
Hücre kültürü mikroplakası 96 kuyu, F-Bottomgreiner bio-one655083
Hücre titresi Glo 2.0PROMEGAG9241
Envision Çok Etiketli OkuyucuPerkinElmeruygulanamaz
Finnpipette F2 Çok Kanallı Pipetler 12 kanallı 30-300 mlThermo Fisher Scientific4662070
Finnpipette F2 Çok Kanallı Pipetler 12 kanallı 5-50 mlThermo Fisher Scientific4662050
FUGENE6PROMEGAE2692
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015
NanoBiT PPI Başlangıç SistemleriPROMEGAN2014
Optimem I Azaltılmış Serum Mediun, fenol kırmızısı yokThermo Fisher Scientific11058021
Orbital çalkalayıcıEppendorfuygulanamaz
ve gama;-Aminofenil-m7GTP (C10-aralayıcı)-AgaroseJena BioscienceAC-155S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
  3. Bhat, M., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

eIF4E eIF4G InteractionProtein Protein Interaction AssayLive Cell ImagingLuciferase Reporter AssaymTOR Inhibitor ScreeningHEK 293 CellsWestern Blot Analysism7GTP Pull DownCell Viability AssaySerial Dilution Protocol

Related Articles