Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

8.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60996

⸱

10 Nisan 2020

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, University of Kentucky

Bu makalede

Özet

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Özet

Hasta türetilmiş ksenogreft modelleri, farklı kanserlerin in vivo bir sistemde ilaç tedavisine nasıl tepki verecek lerini tanımlamada kritik öneme karşıdır. Fare modelleri alanında standart, ancak zebra balığı çeşitli avantajları ile alternatif bir model olarak ortaya çıkmıştır, yüksek üretim ve düşük maliyetli ilaç tarama yeteneği de dahil olmak üzere. Zebrabalığı da daha önce sadece in vitro sistemleri ile elde edildi büyük çoğaltma numaraları ile in vivo ilaç tarama için izin verir. Hızlı bir şekilde büyük ölçekli ilaç ekranları gerçekleştirmek için yeteneği geri kliniğe sonuçların hızlı çevirisi ile kişiselleştirilmiş tıp için olasılık açılabilir. Zebrabalığı ksenogreft modelleri de hızla hedeflenen tedavilere tümör yanıtı dayalı eyleme mutasyonlar için tarama veya büyük kütüphanelerden yeni anti-kanser bileşikleri belirlemek için kullanılabilir. Bu alandaki mevcut büyük sınırlama, ilaç ekranların daha büyük ölçekte yapılabilecek ve daha az emek yoğun hale getirilebilmek için süreci nicelleştirmekte ve otomatikleştirmekte verilmiştir. Birincil hasta örneklerini zebrabalığı larvalarına dönüştürmek ve floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi kullanarak büyük ölçekli ilaç ekranları gerçekleştirmek için bir iş akışı geliştirdik. Bu yöntem, engrafted tümör alanının standardizasyonu ve nice sayıda zebra balığı larvası arasında ilaç tedavisine yanıt lanmasına olanak sağlar. Genel olarak, bu yöntem geleneksel hücre kültürü ilaç taraması üzerinde avantajlı ilaç tedavisi boyunca bir in vivo ortamda tümör hücrelerinin büyümesine olanak sağlar, ve vivo ilaç ekranlarında büyük ölçekli fareler daha pratik ve maliyet-etkin.

Giriş

Model organizmalar içine primer hasta kanserleri veya insan kanser hücresi hatları xenografting in vivo tümör progresyonu ve davranışını incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir, ilaç tedavisine tümör yanıtı, ve mikroçevre ile kanser hücresi etkileşimi, diğerleri arasında. Geleneksel olarak, hücreler bağışıklık tehlikeye fareler içine ksenogreftli, ve bu alanda standart kalır. Ancak, bu model sistemi gibi çeşitli sınırlamalar vardır, yüksek maliyet gibi, düşük çoğaltma numaraları, doğru in vivo tümör yükünü niteleme zorluklar, ve tümörler için gereken uzun süre engraft ve ilaç testi tamamlanması için. Son yıllarda, zebra balığı alternatif bir ksenogreft modeli olarak ortaya çıkmıştır, ilk rapor ile 2005, yeşil floresan protein ile (GFP) etiketli insan melanom hücre hatları blastula-evre embriyolar içine nakledilen1,2. Daha yakın zamanda, 2 gün post-fertilizasyon (dpf) zebra balığı larvaları enjeksiyonanatomik yerinin kontrolü için ksenogreft alıcıları olarak ve çevredeki mikroçevre ile tümör etkileşiminin vivo görüntüleme yüksek çözünürlükte kullanılmak üzere kullanılmıştır3,4.

Zebra balığı ksenogreft modeli olarak birçok avantaj sunar. İlk olarak, yetişkin zebra balıkları nispeten düşük bir maliyetle büyük miktarlarda yetiştirilebilir ve ağırlanabilir. Yetişkin zebra balıklarının her çiftleşerek haftada yüzlerce larva balığı üretebilir. Küçük boyutları nedeniyle, bu larva zebra balıkları yüksek iş itme ilaç taraması için 96-iyi plakalar muhafaza edilebilir. Larvalar tipik bir ksenogreft deneyi sırasında beslenmek zorunda değildir, çünkü sarısı keseleri yaşamın ilk haftasında besinleri devam ettirir. Ayrıca, zebra balıkları 7 dpf'ye kadar tam işlevsel bir bağışıklık sistemine sahip değildir, yani ksenogreft enjeksiyonundan önce ışınlama veya immünsupresif rejimlere ihtiyaç duymaz. Son olarak, optik olarak berrak zebra balığı hatları tümör-mikroçevre etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine olanak sağlar.

Belki de bir ksenogreft modeli olarak zebra balığının en umut verici uygulaması, insan kanser örnekleri üzerinde başka bir model organizma kullanılarak mümkün olmayan bir şekilde yüksek kapsamlı ilaç taraması yapabilme yeteneğidir. Larvalar deri yoluyla sudan ilaç absorbe, ilaç yönetimi kolaylığını artırmak5. Hayvanlar genellikle 100−300 μL suda 96 kuyulu tabaklarda muhafaza edildiklerinden, ekranlar farelere göre daha küçük ilaç miktarları gerektirir. Şu anda, zebra balığında ilaçların insan tümör yükü üzerindeki etkisinin standardizasyonu ve ölçülmesi için birkaç farklı yöntem vardır ve bunların bazıları yüksek iş yapma taraması için tek ilaç testinin ölçeklendirilmesi için diğerlerinden daha pratiktir. Örneğin, bazı gruplar tek hücreli süspansiyonlar halinde balık ayırmak ve süspansiyon bireysel damlacıkları görüntüleme ve yarı otomatik ImageJ makro4kullanarak floresan ölçerek floresan etiketli veya lekeli tümör hücreleri ölçmek 4 . Larva balıklarının 96 kuyulu plakalarda sabitlendiği ve kompozit görüntülerin yeniden düzenlenmesi nden ve tümör hücre foci6'nınsayısallaştırılmasından önce ters floresan mikroskop kullanılarak görüntülendiği yarı otomatik tam larva görüntüleme yöntemi geliştirilmiştir. Bu tahlillerin her ikisi de, zebrabalığı ksenogreft modellerinde gerçekten yüksek işlem li ilaç taraması pratik hale getiren nicelikselleştirme için oldukça emek yoğun yöntemlerdir.

Bu sorun Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi (VAST) Biyoimager ve Büyük Parçacık (LP) Örnekleyici, bir floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi(Şekil 1 ve Malzeme Tablosu)geliştirilmesi ile ele alınmıştır, zebrabalığı larvalarıyüksekişlem görüntüleme için gerçekten otomatik bir yöntemdir 7,8,9. Bu ünite ile balıklar anestezi altına alınır, otomatik olarak 96 kuyulu bir plakadan örneklenir, kılcal damara yerleştirilir ve önceden ayarlanmış bir kullanıcı tercihine göre set oryantasyonuna döndürülür, görüntülenir ve daha sonraki çalışmalar için 96 kuyulu yeni bir plakanın aynı kuyuya geri yerleştirilir veya atılır. Zebrabalığı ksenogreftleri ile bu görüntüleme teknolojisi nin birleştirilmesi, bireysel hasta tümörlerine karşı büyük ilaç bileşik kütüphanelerinin yüksek işlem li ilaç taraması kullanan kişiselleştirilmiş ilaç olasılığına olanak sağlayabilir. Zebra balığı ksenogreftler de vivo yeni bileşiklerin toksisitesi ve etkinliğini test etmek için büyük ölçekli ve düşük maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Zebra balığı fare ksenogreft modellerine geçmeden önce bir ön tarama adımı olarak kullanılabilir.

Birincil hasta lösemi hücrelerinin zebra balığına dönüştürülmesi ve diğer primer hasta tümör hücrelerine veya kanser hücresi hattına uygulanabilen otomatik görüntüleme ve niceleme ile yüksek iş yapma lı ilaç ekranları gerçekleştirmek için düzenli bir iş akışı geliştirdik. Bu iş akışı, mevcut standardizasyon ve niceleme yöntemlerini geliştirmek için floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesinden yararlanmış ve in vivo tümör kütlesini ölçmek için daha önceki, daha emek yoğun yöntemlere otomatik bir alternatif sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol 2015-2225) tarafından onaylanmıştır. Hasta örnekleri University of Kentucky Kurumsal İnceleme Kurulu (protokol 44672) altında toplanmıştır. Bu protokolden sonra yapılan tüm hayvan deneyleri kullanıcının Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmalıdır.

1. Erime Primer Hasta Akut Lenfoblastik Lösemi Hücreleri

  1. 37 °C'lik bir su banyosunda dondurulmuş stoktan birincil hasta periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) eritin. Hücreler çözüldükten hemen sonra, dondurucu ortamlarındaki hücreleri (%90 FBS + %10 dimetil sülfoksit [DMSO]) yavaş pipetleme li 15 mL konik bir tüpe aktarın ve hava kabarcıklarından kaçının. Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'nun orta [IMDM]'inde önceden ısıtılmış 37 °C'lik erime ortamının 10 mL'sini (%25 fetal sığır serumu [FBS]) 15 mL'lik konik tüpteki hücrelere damla şeklinde (mL başına yaklaşık 2−3 s) ekleyin.
    NOT: PBMC'ler tanı sırasında hasta kan örneklerinden alındı. Buffy kat yoğunluk santrifüj ile ayrılmış ve hücreler RPMI 1640 + 10% FBS 2x yıkandı. Hücreler sayıldı ve 1 mL dondurucu ortamda cryovial başına 107 hücre donduruldu ve -80 °C'de depolandı.
  2. 10 dk için 100 x g centrifuge hücreleri ve hücre peletinden aspire ortam. Çözülme ortamı, santrifüj ve aspirasyon ekini, kalan DMSO'yu kaldırmak için bir kez daha tekrarlayın.
  3. Fosfat tamponlu salin (PBS) 5 mL hücreleri resuspend ve otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre saymak için 10 μL kaldırın. Sayım için kaldırılan 10 μL'lik hücrelere 10 μL trypan mavisi ekleyin. ML başına hücre sayısını sayın ve daha sonra ksenogreftleme için hücreleri yeniden askıya almak için hacmi hesaplamak için kaydedin (bkz. adım 2.5).
    NOT: Tipik olarak, 500 hücre larva zebra balığı başına ksenogreftli. Örneğin, 1.000 zebra balığı enjekte etmek için 5 x 105 hücre gereklidir. Ksenogreftleme için kullanılabilirlik >%85 olmalıdır. Bu deneyde, hücre canlılığı erime den sonra% 96 oldu, trypan mavi boyama ile değerlendirildi.

2. DiI ile Floresan Etiketleme Hücreleri

  1. 5 dk için 200 x g pbs 5 mL istenilen hücre numarasını santrifüj ve aspire supernatant. Enjeksiyon sırasında iğnenin yüklenmesinde sorun veya sorun olması durumunda en az 2 x 106 hücreyi lekelendirin.
  2. 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindokargloyanin perklorat (DiI) boyama çözeltisi (5 mL PBS içeren 4 μL DiI leke, Malzeme Tablosu)yapın ve leke çözeltisindeki hücre peletini yeniden askıya alın.
    NOT: Boyama çözeltisinde yeniden askıya alınan hücre yoğunluğu 2 x 106 hücre/mL'yi geçmemelidir.
  3. 37 °C'deki inkübleri ışıktan 20 dakika, girdap yavaşça korunur, daha sonra ışıktan korunan 15 dk boyunca buz üzerindeki hücreleri kuluçkaya yatırır.
  4. 5 dk ve aspire supernatant için 200 x g santrifüj hücreleri. 5 mL PBS, santrifüj 200 x g 5 dk ve aspire supernatant ile hücreleri yıkayın. Yıkama, santrifüj ve aspirasyon bir kez daha tekrarlayın.
  5. 250.000 canlı hücrede 1 μL PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrosentrifuge tüpüne aktarın. Karanlıkta buzun üzerindeki hücreleri yeniden askıya alın ve hemen mikroenjeksiyonlara devam edin.
    NOT: Bu, 2 nL hacimli her enjeksiyon pompası ile zebra balığına 500 hasta hücresi enjekte edilmesini sağlar.

3. Mikroenjeksiyon zebra balığı larvaları

NOT: Mikroenjeksiyonlar hücrelerin canlılığını artırmak için boyama 1−3 saat içinde tamamlanmalıdır.

  1. Hücreleri boyama ve enjekte edilmeden önce, 1x Tris/borate/EDTA (TBE) içine 25 mL %3 agarose dökerek enjekte etmek için agarose plakalar yapın ve katılaşmasını bekleyin. Plakaları 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
  2. Ayrıca hücreleri boyama ve enjekte önce, bir diseksiyon mikroskop altında forceps kullanarak 2 dpf zebra balığı dechorionate. Manuel dechorionation için, chorion gözyaşları ve zebra balığı unenveloped10hale gelene kadar forseps ile zebrabalığı koruyucu chorion zıt uçlarından çekin.
    NOT: Dechorionation da pronase ile enzimatik tedavi kullanılarak yapılabilir, daha önce açıklandığı gibi10. Casper (roy-/-;nacre-/-) zebra balığı bu deneyler de kullanılmıştır11. Herhangi bir zebra balığı larva sıyrık ksenografting için kullanılabilir. Pigment görüntüleme veya görüntülemeile müdahale ederse, optik berrak zebra balığı suşları mevcut değilse melanin sentezini engellemek için proylthiourasil (PTU) tedavisi kullanılabilir12.
  3. Mikroenjeksiyon sırasında hücrelerin kümelenmesini önlemek için 4 °C'de veya buz üzerinde önceden iğneler. Mikroyükleyici pipet uçları kullanarak 5 μL'lik vitrifiyeyi soğutulmuş nonfilamentöz borosilikat cam iğneye yükleyin.
    NOT: Mikroenjektör ve iğne kurulum yöntemleri daha önce13yayınlanmıştır .
  4. İğneyi mikroenjektör koluna yükleyin. İğne ucunu steril bir jilet kullanarak bevel. Bir aşama mikrometresi kullanarak mineral yağdaki damlacık boyutunu ölçün ve damlacık hacmini 2 nL (~0,15 mm çapında) boyunca tutarlı bir şekilde tutarak ölçün.
  5. ~30 dechorionated 2 dpf zebra balığı 25 mL E3 ortam içeren bir Petri kabında anestezi kullanabilirsiniz 4 mg/mL tricaine-S 350 μL kullanın. ~1 dk anesteziedilmiş larvayı düz yüzeyenjeksiyon plakasına (Petri kabında %3 agarose) aktardıktan ve larvaları istenilen enjeksiyon yerinde bir pompa lekeli hücre ile enjekte ettikten sonra (örn. sarısı veya perikard; bkz. Şekil 2A,B).
    NOT: Enjeksiyon yeri deney amacına göre seçilmelidir. En sık enjeksiyon bölgesi sarısıdır. Kan dolaşımında dolaşan hücreleri almak için, perikard, Cuvier kanalı, perivitellin uzay, veya retro-orbital uzay enjeksiyon siteleri olarak kullanılabilir. Ortotopik enjeksiyon siteleri de kullanılabilir, beyin gibi.
  6. Enjeksiyon plakasını 10 cm2 Petri kabına (plaka başına 30 larva) yıkayın ve 1 saat iyileşme süresi boyunca 28 °C'de metilen mavisi olmayan E3 media14 ve inkübasyon içeren bir kaplayın. İstenilen sayıda larva enjekte edilene kadar enjekte edin.
    NOT: İdeal olarak, deneyler için gereken larva sayısını 2−2,5 kat enjekte edin. Enjeksiyondan kaynaklanan stres ve artan kuluçka sıcaklığı nedeniyle larvaların bir miktar kesilmesi olacaktır. Tipik olarak, teknik ile uygulamadan sonra, 800−1.500 zebrabalığı larvaları lekeli hücreler enjekte edilmelidir 1−3 h içinde tek bir kişi tarafından enjekte edilebilir.
  7. Enjekte edilen larva plakalarını 34 °C'lik bir kuluçka makinesine taşıyın. Petri larvalarını, E3 suyunun aşırı ısınmasını önlemek için kuvözdeki metal bir rafa doğrudan yerleştirmeyin. Örneğin, bir tampon olarak hareket etmek için raf ve larva Petri çanak arasında boş bir Petri çanak yerleştirin. 24 ve 48 saat sonrası enjeksiyon (hpi) sonra ölü zebra balığı larvaları çıkarın.

4. Xenografted Zebrafish ile İlaç Ekran Kurma

  1. 48 hpi'de, floresan/tümör engraftment ve sağlık için ekran zebra balığı larvaları(Şekil 2C,D). Ölü veya yanlış biçimli zebra balıklarını çıkarın ve benzer engraftment ile zebra balıklarını seçin(Şekil 2C,D, 1−3 ve 1'−3'). Aşılanmamış zebra balıklarını çıkarın(Şekil 2C,D, 5 ve 5').
    1. Sarısı enjekte edilen balıklar için, kantifikasyonu zorlaştırdığı için, engrafted hücre kütlesi(Şekil 2C, 4) etrafında yumurta sarısı sınırları görülemeyen balıkları çıkarın. Perikard enjekte edilen balıklar için, enjekte edilen hücre kitlesinin sarısı kesesine girdiği balıkları çıkarın(Şekil 2D, 4').
  2. 96-iyi plaka zebra balığı ekleyin. Bunu yapmak için, 4 dpf zebra balığının sığması için yeterince büyük olan 200°L pipet ucunu kesin. P200 pipetkullanarak plakadan bir zebra balığı ile 150 μL E3 ortam alıvurun ve düz tabanlı 96 kuyulu bir plakanın boş bir kuyuya ekleyin.
  3. E3 media gerekli hacimde test edilecek ilaç seyreltmek, iyi başına 150 μL. 2 kat istenilen konsantrasyonda ilaç hazırlayın. Örneğin, her kuyudaki toplam hacmin yarısı ilaç çözeltisi olduğundan, istenilen nihai konsantrasyon 10 μM ise, E3'te 20 μM'lik ilaç hazırlayın. DMSO kontrol grubu için, ilaçla aynı hacimde DMSO ekleyin.
  4. 150 μL E3'te zebra balığı larvası içeren her kuyuya 150 μL 2x seyreltilmiş ilaç çözeltisi ekleyin, kuyu başına 1x ilaç çözeltisi ile 300°L'lik son bir hacim için.
  5. Plakayı 34 °C'de kuluçkaya yatırın. Her gün ölü zebra balığı olup yok. 2 gün sonra, istenirse, 96 kuyulu plakanın her kuyusundan 200 μL sıvıyı çıkararak ve E3 ortamlarında 200°L 1x seyreltik ilaç çözeltisi veya DMSO ile değiştirerek ilacı yenileyin.
    NOT: En iyi sonuçlar bu deney için ilaç tedavisi 3 gün sonra bulundu; ancak, ilaç tedavisinin süresi 2−4 gün arasında değişebilir ve yapılan deneye veya kullanılan ilaçlara bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir.

5. Floresan Mikroskop Donanımlı Görüntüleme Ünitesi ve Otomatik Örnekleyici Ünitesi Kullanılarak Xenografted ZebraFish Görüntüleme

  1. Taze 1 L 4 mg/mL triain ve 1.5 L E3 ortam hazırlayın. Ortam şişesi 1'i E3 media ve media bottle 2'yi tricaine ile doldurun.
  2. Görüntüleme yazılımındaki tüm istenmeyen floresan kanalları kaldırın ve istediğiniz kanalı ekleyin (Bu deneme için DiI). Bir görüntü sadece bir onay işareti ile kanallar için alınacaktır gibi istenilen floresan kanal kontrol edin. Ayrıca, görüntülerin nasıl çekileceklerini seçin (z-yığınları, otomasyon, seri döngüler, vb.).
    NOT: Bu deney için, en iyi odaklama ile en yüksek sayıda görüntü elde etmek için görüntülenmiş her balık için odak el ile ayarlandı.
  3. Uygun maruz kalma süresi görüntüleme yazılımı ayarlanabilir, böylece ilaç tedavi balık önce DMSO kontrol balık görüntü. Pozlama ayarlandıktan sonra, deneme süresince pozlama süresini değiştirmeyin.
    NOT: Odak, odak dışı görüntülerin olmadığından emin olmak için her zebra balığı için manuel olarak ayarlanabilir veya tam otomatik görüntüleme için, aynı odak, analiz gerçekleştirmeden önce atılan veya balık yeniden görüntülenen odak dışı görüntülerle balıklar arasında kullanılabilir. Ayrıca, bu deney herhangi bir floresan görüntüleyici kullanılarak ve ardından ImageJ yazılımı kullanılarak floresan nicelik kullanılarak yapılabilir.

6. ImageJ kullanarak Floresan Miktarını Niteleme

  1. ImageJ yazılımLarını açın.
  2. Dosyaya Git | İstediğiniz .czi dosyasını açın ve seçin. Yazılım bir alma seçenekleri penceresi getirecektir.
    1. Stack görüntüleme için select Hyperstacks, Dosyaları Tek tekişaretleyin, Otomatik Ölçek'i denetleyinve Bölünmüş Kanalları denetleyin. Renk seçeneği için Colorized'iseçin.
  3. Eklentiler | Makrolar | Kaydet.
  4. Resim | Ayarla | Eşik. Eşik penceresinin sağ tarafındaki açılır menüde resim türünü kırmızı olarak seçin. Yazılım yalnızca floresan(Şekil 3A)alanları vurgulayana kadar minimum eşiği ayarlayın ve Uygula'yı tıklatın. Yazılım siyah ve beyaz, siyah seçilen alan ile fotoğraf dönüştürecektir.
    NOT: Sonuçları standart ve karşılaştırılabilir tutmak için ilaç ekranındaki her görüntü için aynı eşiği kullanın.
  5. Analiz Et ' i tıklatın | Ölçün. Yazılım, bu görüntü için floresan alanı içeren bir sonuç penceresi yukarı çekecektir.
  6. Makro Kaydedici penceresinde Oluştur'u tıklatın. Bu, makronun koduyla birlikte yeni bir pencere açar. Analiz için istenen tüm görüntüleri vurgulayın ve adım 6.2'deki gibi açın.
  7. Makroile pencerede Çalıştır'ı seçin. Sonuç penceresi artık her görüntü için alan içerir.
    NOT: Görüntü analizi, bir makroyu kaydetmeden ve çalıştırmadan ve her görüntü için yukarıdaki adımları yineleyerek ayrı ayrı yapılabilir.
  8. Ölçülen verileri elektronik tabloya kopyalayın. Tüm kontrol (DMSO) örneklerinin toplam floresansının ortalaması. Aşağıdaki formülü kullanarak yüzde farkını hesaplayın: –[(ortalama DMSO alanı – deneysel alan)/ortalama DMSO alanı] x %100 (Şekil 3B).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokolü takiben, zebra balıkları, tanı sırasında t-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) hastasından izole edilmiş ve uygun, dondurulmuş bir örnek olarak lanse edilen primer hasta PBMC'leri ile yolk ve perikard da ksenogreftlendi. 48 hpi'de, ksenogreftli balıkfloresan etiketli tümör hücreleri(Şekil 2C,D)için tarandı ve kemoterapi (deksametazon veya vinkristin) veya DMSO ile tedavi edildi. Floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik ör...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, primer hasta lösemi hücrelerinin ksenogreft modeli olarak zebra balığına doğru çözülmesi ve enjeksiyonu için standart laştırılmış bir yöntem gösterilmiştir. Ayrıca floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi kullanılarak ksenogreftli zebra balıklarının yüksek iş itimatlı ilaç taraması için bir protokol oluşturduk. Daha önce insan hücre hatları ile ksenogreftler bildirilmiştir ve ksenogreftli tümörlerin yüksek iş lenme li bir şekilde nicelleştirilmesi bu alanda bir sorun ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma V Vakfı V Scholar Ödülü ve NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. Blackburn için) ve NIH Eğitim Hibe T32CA165990 (M.G. Haney için) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x TBE Sıvı KonsantreVWR0658-5L
96 oyuklu plaka, düz tabanlıCELLTREAT229195VAST, çeşitli standart veya derin kuyu 24, 48 veya 96 kuyulu plakalarla uyumludur
AgaroseFisher ScientificBP160-500
Borosilikat Cam Kılcal Filamentsiz SutterEnstrüman ŞirketiB100-50-10
DeksametazonEnzo Yaşam BilimleriBML-EI126-0001
DMSOSigma-AldrichD2438-5X10ML
E3 ortamıN/A5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Femtotips Mikro Yükleyici UçlarıEppendorf930001007
Fetal Sığır Serumu (Premium Isı Etkisizleştirilmiş)Atlanta BiologicalsS11150H
ImageJFIJIN/A
Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun OrtaSTEMCELL Teknolojileri36150
Büyük Parçacık (LP) ÖrnekleyiciBirliği BiometricaN/Aotomatik örnekleyici ünitesi http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8
MetotreksatSigma-AldrichA6770-10MG
Mineral YağFisher ScientificBP26291
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x)Keson labsPBL06-6X500ML
Aşamalı Mikrometre (400 Aşamalı)Hausser Scientific400-S
Tricaine-SPentair AquaticTRS1
Tripan MaviTermo FisherT10282
VAST BiyogörüntüleyiciBirliği BiometricaN/ Floresan donanımlı bir mikroskop görüntüleme ünitesi https://www.unionbio.com/vast/
Vincristine SulfateEnzo Life SciencesBML-T117-0005
Vybrant DiI LekeThermo FisherV22885
https://imagej.net/Fiji

Kaynaklar

  1. Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
  2. Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
  3. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
  4. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
  5. Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
  6. Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281(2012).
  7. Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
  8. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
  9. Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
  10. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
  11. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  12. Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
  13. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  14. Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
  15. Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
  16. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  17. Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
  18. Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  19. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Zebrafish KsenogreftiFloresan MikroskobuOtomatik GörüntülemeTümör Alanı KantifikasyonuKanser Hücresi Engreftiİlaç Yanıt AnaliziMikroenjeksiyon ProtokolüYüksek Verimli Tarama
Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.