Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

10.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61119

⸱

26 Haziran 2020

 ,  ,  , 
1College of Public Health, Shaanxi University of Chinese Medicine, 2Spinal Cord and Brain Injury Research Center, Department of Physiology, University of Kentucky

Bu makalede

Özet

Iskemik inme sonrası yaygın karotis arter (fare) veya eksternal karotis arter (sıçan) yoluyla, enjekte çözeltileri veya süspansiyonlar için uyarlanabilir nöral kök hücreleri teslim etmek için bir yöntem bildirilmiştir. Enjekte edilen hücreler beyin parankim boyunca geniş bir şekilde dağıtılır ve doğumdan sonra 30 d'ye kadar tespit edilebilir.

Özet

Nöral kök hücre (NSC) tedavisi inme, travmatik beyin hasarı ve nörodejeneratif bozukluklar için ortaya çıkan yenilikçi bir tedavi yöntemidir. İntrakranial doğumile karşılaştırıldığında, NSCs intra-arteriyel uygulama daha az invaziv ve beyin parankim içinde NSCs daha yaygın bir dağılım üretir. Ayrıca, intra-arteriyel doğum beyin dolaşımında ilk geçiş etkisi sağlar, periferik organlarda hücrelerin bindirme potansiyelini azaltarak, karaciğer ve dalak gibi, periferik enjeksiyonlar ile ilişkili bir komplikasyon. Burada, hem fare hem de sıçanlarda, iskemik inme sonrası ipsilateral hemisfere yaygın karotis arter (fare) veya harici karotis arter (sıçan) yoluyla NSC'lerin teslimi için metodolojiyi ayrıntılarıyla açıklıyoruz. GFP etiketli NSC'ler kullanarak, postiskemik doğumdan 1 d, 1 hafta ve 4 hafta sonra, iskemik yaralanma bölgesinin içinde veya yakınında daha yüksek yoğunlukta kemirgen ipsilateral yarımkürede elde edilen yaygın dağılımı gösteriyoruz. Uzun süreli sağkalıma ek olarak, 4 haftada GFP etiketli hücrelerin farklılaşmasına dair kanıtlar gösteriyoruz. NSC'ler için burada açıklanan intra-arteriyel doğum yaklaşımı terapötik bileşiklerin uygulanması için de kullanılabilir ve böylece birden fazla tür arasında çeşitli CNS yaralanma ve hastalık modelleri için geniş uygulanabilirlik vardır.

Giriş

Kök hücre (SC) tedavisi inme, kafa travması ve demans1,2,3,,4,5,6dahil olmak üzere nörolojik hastalıklar için bir tedavi olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak, hastalıklı beyne eksojen SCs sunmak için etkili bir yöntem sorunlu kalır2,6,7,,8,9,10,11,12,13. İntravenöz (IV) veya intraperitoneal (IP) enjeksiyonu da dahil olmak üzere periferik doğum yolları ile teslim edilen SC'ler, özellikle akciğer, karaciğer, dalak ve kas8,,9,13,14, hedef olmayan bölgelerde hücre birikimi şansını artırarak, mikrosirkülasyonda ilk geçiş filtreleme tabidir. İnvaziv intraserebral enjeksiyon yöntemi lokalize beyin dokusu hasarı ve enjeksiyon bölgesi 2 yakın SCs çok sınırlı dağılımı sonuçları2,,6,8,14,15,16. Yakın zamanda ekzojen nöral SCs (NSCs) sunmak için kateter bazlı intra-arteriyel enjeksiyon yöntemi kurduk, burada fokal iskemik inme bir kemirgen modelinde uygulanan açıklanan. Biz fare veya sıçan,17, 18,1819sol orta serebral arter (MCA) tıkamak için bir silikon kauçuk kaplı filament kullanarak bir yarımkürede geçici (1 saat) iskemi-reperfüzyon yaralanması indüklemek . Bu modelde laser Doppler veya Laser benkle,görüntüleme,17, 19,19, tutarlı nörolojik açıkları17,18,19ile ipsilateral hemisferde serebral kan akımının (CBF) yaklaşık% 75-85 depresyon tekrar gözlendi .

Zaman kazandıran amaçlar için video normal hızın iki katı hızda oynanacak şekilde ayarlanmıştır ve dikişle cilt hazırlama ve yara kapanması gibi rutin cerrahi işlemler ve motorlu şırınga pompasının kullanımı ve kurulumu sunulmamaktadır. NSC'lerin intra-arteriyel doğum yöntemi kemirgenlerde deneysel inme orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) modeli bağlamında gösterilmiştir. Bu nedenle, ikinci ameliyatın, intra-arteriyel enjeksiyonun aynı hayvanın önceki cerrahi bölgesi kullanılarak nasıl yapıldığını göstermek için geçici iskemik inme prosedürünü de dahil ediyoruz. Kemirgen inme modellerinde intra-arteriyel NSC doğumunun fizibilitesi eksojen NSC'lerin dağılımı ve sağkalım ları değerlendirilerek gösterilmiştir. Beyin patolojisi ve nörolojik disfonksiyonu zayıflatmak için NSC tedavisinin etkinliği ayrı ayrı rapor edilecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan denelerine ilişkin tüm işlemler Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve ameliyatla ilişkili stres veya ağrıyı en aza indirmek için uygun özen uygulandı.

1. Enjeksiyon kateteri ve cerrahi kancaların hazırlanması

  1. Enjeksiyon kateterini inşa edin (Şekil 1). MRE010, MRE025 ve MRE050 boru, 20 G, 26 G ve 27 G enjeksiyon iğneleri(Şekil 2A),600 kum kağıdı, süper yapıştırıcı ve iki bileşenli 5 dakikalık epoksi dahil olmak üzere gerekli malzemeleri toplayın.
    1. İğne göbeğinden 1 cm'ye 20 G ve 26 G iğneler kesin ve ucunu zımpara kağıdında parlatayın(Şekil 2B)parlayın. İğne deliklerini temizlemek için iğneleri 10 mL çift distile su yla yıkayın.
      NOT: İki farklı tasarım(Şekil 1)kullanılmıştır. Design 1 tek bir konnektöre sahiptir ve çözelti veya süspansiyon enjeksiyonu için kullanılır. Tasarım 2, NSC içeren çözeltinin tam hacminin teslimedilmesini sağlamak için hücre enjeksiyonu (20 G iğne) ve ölü hacmin (26 G iğnesi) temizlenmesi için 20 G ve 26 G Luer kilit konektörlerine sahiptir.
  2. Tasarım 1: 3-4 cm uzunluğunda mre010 kateteri 15 cm uzunluğundamitmitli MRE025 kateteri içine takın ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin.
    1. MRE025 borunun diğer ucunu MRE050 kateterin bir bölümüne bağlayın ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin. MRE050 kateterinin kalan ucuna donuk 20 G iğne yerleştirin ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin(Şekil 1).
    2. Ayrıca epoksi tutkal ile bağlantı siteleri güçlendirmek. Bu kateter tasarımı reaktif enjeksiyonu için en uygun (kimyasal veya ilaç solüsyonları veya sitokinler gibi diğer biyolojik ler gibi).
  3. Tasarım 2: 3-4 cm uzunluğunda mre010 kateteri 15 cm uzunluğundamitmitli MRE025 kateteri içine takın ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin.
    1. MRE025 borunun diğer ucunu MRE050 kateterin bir bölümüne bağlayın ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin. MRE050 kateterinin kalan ucuna donuk 20 G iğne yerleştirin ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin.
    2. MRE050 tüpüne ilk iğnenin ucuna yakın bir şekilde, enjeksiyon akışının yönünü takip eden donuk 26 G iğne yerleştirin ve süper yapıştırıcı ile sabitleyin(Şekil 1 ve Şekil 2C). Her iki iğneyi ve MRE050 tüp segmentini net epoksi(Şekil 2C)ile güçlendirin. Bu tasarım, nsc enjeksiyonundan sonra iğne 1 (20 G) iğne ile araç çözeltisinin beyin dolaşımına kateterdeki ölü hacmi niçin boşaltarak enjeksiyon hacimlerinin daha hassas bir şekilde kontrol altına alınmasını sağlar.
    3. NSC'lerin zarar görmesini en aza indirmek için NSC enjeksiyonu için 20 G iğne kullanın, bu da canlılığı olumsuz etkileyebilir.
  4. İnşaattan sonra kateterleri 10 mL çift distile su ile yıkayın ve ardından %70 etanol alın ve bir gecede %70 etanolle ıslatın.
  5. Ameliyattan önce kateterleri %70 etanolden çıkarın ve 10 mL steril PBS ile yıkayın ve depolama ve taşıma için otoklavlı cerrahi alet kutusuna yerleştirin.
  6. Cerrahi kancaların hazırlanması
    1. 27 G iğneden 1,5 cm uzunluğunda iğne mili kesin ve her iki ucunu da mat olana kadar zımpara kağıdında parlatalayın. Daha sonra bir ucunda bir kanca içine şaft ve diğer ucunda bir halka şeklinde şaft viraj için küçük bir hemostatik kelepçe kullanın.
    2. Halka nın içine 10-15 cm uzunluğunda bir MRE025 kateteri takın ve net cerrahi bantla sabitleyin(Şekil 2D). Aynı yöntemi kullanarak 2 daha fazla kanca olun.
    3. Tüm kancaları ve kateter sistemlerini kullanıma kadar %70 etanolle ıslatın.

2. Hayvan hazırlığı: Teslimat, barınma, çevreye uyum

  1. Bu çalışmada erkek ve dişi C57BL/6 fareler (10-12 hafta, n=10/zaman noktası) ve Wistar sıçanları (10-12 hafta, n=10) kullanıldı.
  2. Gıda ve su reklam libitum ile çevre kontrollü bir hayvan vivarium onları House.
  3. İnme ameliyatından en az 1 hafta önce çevreye uyum sağlamalarını bekleyin.
    NOT: İnme ameliyatından sonra bir fare ve bir sıçan 1 d'de öldü ve bir fare ağır felç nedeniyle nsc enjeksiyonu öncesinde 3 d ötenazi yapıldı.

3. Fare ve sıçan nöral kök hücrelerinin kültürü (NSCs)

NOT: StC'ler,20 no'lubir protokole göre izole edilmiş ve kültürlüdür.

  1. Fare
    1. GFP pozitif erkek farelerle (B6 ACTb-EGFP) çiftleşmiş zamanlanmış gebelik dişi C57BL/6 farelerinden E18 embriyonik korteksinden yabani tip (WT) ve GFP etiketli NSC'leri izole edin. GFP (+) embriyoları tanımlamak için, FITC kanalını kullanarak bir floresan mikroskop üzerinde hasat edilen embriyoları gözlemleyin. GFP (+) embriyolar yeşil floresan sinyali verirken WT embriyoları sadece zayıf oto floresan gösterir(Şekil 3A).
  2. Sıçan
    1. Genç erişkin WT sıçanların subventriküler zonundan (SVZ) NSC'leri izole edin. Üreticinin talimatları21aşağıdaki enjeksiyon hemen önce DiI ile etiketleyin.
  3. Kültür faresi veya sıçan NSC'leri nörosferlere dönüşene kadar ve küre çapı 100 μm'ye ulaştığında bunları iletirler(Şekil 3B). 3 ve 5 pasajları arasında enjeksiyon için NSCs kullanın.
  4. Kök hücre özelliklerini embriyonik kök hücre belirteç paneli(Şekil 3C)kullanarak doğrulayın.
  5. Enjeksiyon gününde, NSC küreleri toplamak ve hücre ayırma çözeltisi ile ayrıştırmak, kalsiyum askıya- ve magnezyum içermeyen PBS bir konsantrasyon için 107 hücre /mL, ve enjeksiyon kadar ıslak buz üzerine yerleştirin.

4. Cerrahi hazırlık

  1. Ameliyattan önce, ticari MCAO sütürüzerinde, ekleme uzunluğunun cerrahi içi referansı için uçtan 9 mm (fare için) veya 15 mm (fare için) gümüş kalemle bir nokta işaretleyin. Otoklav cerrahi aletleri (makas, forceps) ve aletleri her ameliyattan önce, ve ısı ameliyatları arasında bir cam boncuk sterilizatör onları sterilize.
  2. İnhalasyon yoluyla %5 isofluran ile hayvanlarda anestezi yi tirve %1-2 isofluran ile anesteziyi sürdürün. Genel koşulların gözlemi (solunum paterni, bıyık hareketi ve spontan vücut düzeltme duruşu), kornea refleksi ve ayak ucuna yanıt yoluyla anestezi derinliğini değerlendirin.
  3. Bir ısıtma yastığı üzerine hayvan supine lay ve kırpma ve betadine çözeltisi ile ovma tarafından hayvan üzerinde cerrahi site hazırlamak% 70 etanol izledi. Ameliyat sırasında göz hevesi (örn. yapay gözyaşı merhemi) uygulayarak hayvanın gözlerini kurumaya karşı koruyun.
  4. Cerrahlar iyice bir bakteriyosidal scrub ile ellerini ovmak ve bir maske, steril eldiven ve temiz bir laboratuvar önlüğü giymek var.

5. Orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) inme cerrahisi

NOT: Fare veya sıçan ın bir yarımkürede iskemik inme indüklemek için yapılan ameliyatlar, iç karotis artere (ICA) kan akışını tıkamak için bir sütür inmesi ile benzerdir (Şekil 4)17,18,19,22. Ancak, dikiş ekleme için seçilen arter sonraki kök hücre enjeksiyonu için gerekli mevcut çalışma alanına göre değişir. Sıçan iki ayrı izin vermek için dış karotis arter geniş alana sahiptir (ECA) segmentinde iki ayrı, sıralı ameliyatlar (inme ve NSC enjeksiyon), ama fare yok, alternatif bir yaklaşım gerektiren. İnmeye bağlı serebral kan akımı değişiklikleri, beyin enfarktüs boyutu ve nörolojik açıkları yazarların önceki raporlarında olduğu gibi bildirilmiştir17,18,19.

  1. İskemik inme indüklemek için, servikal bölgede orta hat kesisi ve sol ortak karotis arter (CCA), ECA ve ICA izolasyonu ile hem fare hem de sıçan ameliyatlarına başlayın(Şekil 4). CCA veya vagus sinirini esnetmeme, yerinden etmemeye veya sıkmamaya dikkat edin. Arter ve cerrahi basamak seçimi bundan sonra farklı olduğundan, fare ve sıçan üzerinde MCAO cerrahisi ayrı ayrı açıklanacaktır.
  2. Farede MCAO cerrahisi (Şekil 4A)
    1. CCA'nın altına üç örgülü 6-0 naylon dikiş yerleştirin(Şekil 4A, adım 1), ve proksimal dizeyi kullanarak damarı mümkün olduğunca çatallanmadan uzak tatmak için sıkı bir cerrahi düğüm yapın(Şekil 4A, adım 2). Dikiş uçlarını kırpın.
    2. CCA distal tarafında bir slipknot olun (dikkat: adım 6 çıkacak gibi aşırı sıkın) ve iki sıkılmış düğüm arasında bir gevşek slipknot(Şekil 4A, adım 2).
    3. CcA'daki proksimal düğüme mikrosiküllü(Şekil 4A, adım 3) yakın küçük bir kesi (~ 1/4 - 1/3) kesin ve ticari silikon kauçuk kaplı 7-0 katı naylon dikiş(Şekil 4A, adım 4) dikkatlice takın. Bu sütü, ica'dan gelen geri akışla kesiden kan sızıntısı ve silikon kauçuk kaplı naylon filamentin hareketini sağlamak için yeterince sıkılaştırarak orta dize ile sabitle,(Şekil 4A, adım 5) ve yine de sütürin cımbıztarafından hafif bir itme ile ECA'ya doğru ilerlemesine izin verin.
    4. Üst (distal) slipknot bırakın(Şekil 4A, adım 6) ve ucu 9 mm için çatallanma geçene kadar ICA içine naylon dikiş ilerlemek (bir referans olarak dikiş üzerinde gümüş marker kullanarak). Sütürgüvenli ve kan geri akışını önlemek için üst iki slipknot sıkın.
    5. Filament 1 saat sonra(Şekil 4A, adım 7) ve kanamayı önlemek için orta düğümü kullanarak CCA'yı litgate(Şekil 4A, ters sırada 5-7 adım, adım 8'de görüldüğü gibi kesin sonuçlar). Üst düğümü serbest bırak. Yarayı 4-0 cerrahi dikişle kapatın.
  3. Sıçanda MCAO cerrahisi (Şekil 4B)
    1. ECA'nın altına iki örgülü 6-0 naylon dikiş yerleştirin(Şekil 4B, adım 1) ve distal ucunda mümkün olduğunca sıkı bir düğüm yapın(Şekil 4B, adım 2).
    2. Damar klipslerini arteriyel kan akışını tıkamak için ICA ve CCA'ya yerleştirin(Şekil 4B, adım 3). Bir slipknot bir damar klipsi için alternatif olarak kullanılabilir.
    3. Mikroskalatör(Şekil 4B, adım 3-4) ile ECA üzerinde küçük bir kesi yapın, 6-0 naylon filament(Şekil 4B, adım 5) kaplanmış ticari silikon kauçuk takın ve ECA üzerinde bir slipknot ile düzgün bir şekilde sabit.
    4. ICA'daki damar klibini serbest bırakın, filamenti GÜMÜŞ marker (15 mm)çatallamayaulaşana kadar ICA'ya doğru ilerletin ve eca'daki2 düğümle sütü sabitleyin(Şekil 4B, adım 6).
    5. İskemi 1 saat sonra, bu filament çekin ve kanamayı önlemek için kesi ligate(Şekil 4B, adım 7), CCA damar klipsi çıkarın (adım 8 olarak nihai sonuç), ve 4-0 cerrahi sütür ile yara kapatın.

6. Kurtarma

  1. İnme ameliyatından sonra, hayvanları tamamen bilincini geri kazanana kadar ısıtma yastığına yerleştirin.
  2. Subkutan enjeksiyon ile analjezi sağlayın. Su ve gıda reklam libitum erişimi ile ev kafeslerine hayvanları geri dönün.

7. İntra-arteriyel enjeksiyon

  1. Tüm kateteri %70 etanol ile yıkayın ve kullanım anına kadar bir gece bekletin. Enjeksiyondan hemen önce, iğnenin Luer kilidini steril bir şırınga ile bağlayın ve kateter sisteminin tüm lümen tarafını 10 mL steril PBS ile yıkayın.
  2. NSC enjeksiyonu için zaman penceresi ve hazırlık
    NOT: Diğer araştırma ekiplerinin deneyimlerine ve raporlarına dayanarak, NSC enjeksiyonunun zamanlaması hem deneklerin hem de eksojen NSC'lerin hayatta kalması için çok önemlidir. Pilot çalışmamızda NSC'lerin erken zaman noktalarında (reperfüzyondan sonraki ilk 6 saat içinde) enjeksiyonu mortaliteye yol açmıştır. Böylece, daha sonra enjeksiyon zaman noktalarını test ettik ve inme den sonra 2 d (48 h) ile 3 d (72 saat) arasındaki zaman penceresini belirledik ve nsc'lerin intraparenchymal dağılımının sağlanmasında etkilidir.
    1. Şırınga pompası enjeksiyon hızını fareler için 20 μL/dk, sıçanlar için 50 μL/dk olarak ayarlayın. Enjeksiyonun aşırı hızı veya süresi, farelerin farelerden daha savunmasız olduğu sistemik hacim aşırı yüklenmesine neden olabilir.
    2. Kısacası, inme ameliyatından sonra 3 d, isoflurane ile hayvanları anestezik ve bir ısıtma yastığı üzerinde supine onları koymak.
    3. Servikal yarayı yeniden açın ve ECA, ICA ve CCA'yı tekrar ortaya çıkarTın(Şekil 5, adım 1). İnme ameliyatlarında olduğu gibi, enjeksiyon rotasını türlere göre belirleyin. Farede NSC enjeksiyonu için CCA ve sıçan23için ECA kullanın.
  3. Farede CCA ile intra-arteriyel enjeksiyon
    1. CCA altında iki 6-0 örgülü naylon dikiş yerleştirin. Bir önceki inme ameliyatından çatallanma ve alt düğümler arasında her biri ile gevşek bir slipknot oluşturun(Şekil 5, adım 2).
    2. Üst slipknot sıkın ve daha sonra alt düğüm üzerinde küçük bir kesi yapmak(Şekil 5, adım 3). Kesiden bir MRE010 kateteri takın(Şekil 5, adım 4) ve enjeksiyon akışını engellemeden orta düğümile sabitlein(Şekil 5, adım 5). Üst düğümü serbest ve kateter pozisyonunu ayarlarken kanın geri akışı kateterde görülmelidir.
    3. ECA'ya bir damar klipsi yerleştirin, 20 μL/dk'da bu kateterden 5 dakika boyunca şırınga pompası ile 1 x 106 GFP-NSC enjekte edin ve ardından aynı hızda 50-100 μL PBS ile floş çekin.
    4. Enjeksiyondan sonra CCA'yı kesinin üstündeki üst düğümle iniatın üzerine çekin ve MRE010 kateteri çekin(Şekil 5, adım 6). Sıkın ve orta düğüm ve üst düğüm kırpın. Damar klibini ECA'dan çıkarın. Şekil 5'teki son resme bakın , adım 7.
    5. Yarayı 4-0 cerrahi dikişle kapatın.
    6. Bir ısıtma yastığı ve deri altı analjezik enjeksiyon yeterli kurtarma sağladıktan sonra, ev kafesi için hayvanları geri dönün.
  4. Sıçanda ECA ile intra-arteriyel enjeksiyon
    1. ECA ve CCA'yı geçici olarak damar klipsleri ile tıka(Şekil 5, adım 2).
    2. ECA'nın proksimal tarafında küçük bir kesi yapın(Şekil 5, adım 3), MRE010 kateteri takın ve düğümle sabitlein(Şekil 5, adım 4).
    3. Her iki damar klipsini de çıkarın, motorlu şırınga pompası kullanarak 500 μL/dk'da 100 μL'lik PBS'ye 5x 106 NSC enjekte edin, ardından 50-100 μL PBS(Şekil 5, adım 5) ile aynı hızda bir floş çekin.
    4. Enjeksiyondan sonra CCA ve ECA'yı tekrar damar klipsleri ile tonuyla tonur ve enjeksiyon kateteri çekildikten sonra ikinci kesinin proksimal tarafında ECA'yı inklüzyon edin(Şekil 5, adım 6).
    5. İki damar klipsini çıkarın(Şekil 5, adım 7) ve yarayı 4-0 cerrahi dikişle kapatın.
    6. Bir ısıtma yastığı ve deri altı analjezik enjeksiyon yeterli kurtarma sağladıktan sonra, ev kafesi için hayvanları geri dönün.
  5. Histolojik çıktı
    1. İnjektörden sonra ötanazi ve intrakardiyak perfüzyon dan sonra nsc enjeksiyonu ve intrakardiyak perfüzyon ile 1 d (fare ve sıçan), 7 d (fare) ve 30 d (fare) ile iskemik inme alınan fare ve sıçanlardan beyin toplayın. Bu dört grubun her biri 5 NSC ve 5 araç enjekte hayvandan oluşuyordu.
    2. Bir gecede beyinleri düzeltin ve 3 d için% 30 sakaroz kriyokorun.
    3. Beyinleri OCT'ye yerleştirin, 40 μm kalınlığında dilimleyin ve glial fibrillary asidik protein (GFAP, astrositler), Tuj1 (olgun nöronlar) ve doublecortin (DCX, olgunlaşmamış nöronlar) dahil olmak üzere hücrespesifik belirteçlerle immünboyama sonrası NSC'lerin dağılımını inceleyin.
      NOT: GFP ifade eden bir sıçan türünün olmaması nedeniyle, geçici floresan etiket olan DiI'yi, sadece nispeten kısa süreli gözlemsağlayan sıçan NSC'leri için kullandık. Bu nedenle, NSC dağılımı sıçanlarda inme sonrası sadece 1 d olarak incelendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

GFP etiketli NSC'ler iskemik beyinde, çoğunlukla ipsilateral hemisferde, özellikle penumbrada ve yaralanma kenarı boyunca kolayca saptanmıştır(Şekil 6). Muayeneci görüntüleme ve analiz sırasında tek kör oldu.

Örneğin, enjeksiyondan sonra 1 d'de fare hipokampusu içinde NSC saptandı. NSC'lerin bir alt kümesi, bu erken zaman noktasında bile dentat girustaki olgunlaşmamış nöron belirteci DCX'in ortak ekspresyonu göstermiştir(Şekil 6A).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Nörolojik hastalıklar için kök hücre tedavisi hala erken bir keşif aşamasındadır. Önemli bir sorun beyne SCs veya NSCs yeterli teslim için kurulmuş bir yöntem olmasıdır.

İntravenöz (IV), intraperitoneal (IP) veya intraparenkimal/intraserebral enjeksiyon sonrası beyinde ekzojen SCS/NSC saptamasına rağmen, her doğum yaklaşımının sakıncaları vardır. Beyin içinde saptanabilir popülasyon çok düşük periferik enjeksiyon ile olduğu tahmin edilmektedir (IV veya IP), enjekte veya aşılanmış hücrelerin sa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

Bu araştırma aşağıdakiler tarafından desteklenmiştir: LC için AHA Ödülü 14SDG20480186, Çin Tıbbı Shanxi Üniversitesi Konu yenilik ekibi 2019-QN07 BZ için, ve Kentucky Spinal Kord ve Kafa Yaralanması Araştırma Güven hibe 14-12A KES ve LC için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
20 G iğneBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305175enjeksiyon kateterinin hazırlanması
26 G iğneBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305111enjeksiyon kateterinin hazırlanması
27 G iğneBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305136enjeksiyon kateterinin hazırlanması
4-0 NFS-2 iğneli sütürHenry Schein Hayvan Sağlığı56905ameliyatı
6-0 naylon sütürTeleflex/Braintree Scientific104-scerrahisi
AccutaseSTEMCELL Teknolojileri7922hücre ayrılma solüsyonu
bıçağıBard-Parker10cerrahi
Buprenorfin-SR LaboratuvarıZooPharmBuprenorfin-SR Laboratuvarı®analjezi (3 gün boyunca 0.6-1 mg / kg)
Kalsiyum/magnisum içermeyen PBSVWR02-0119-0500NSC ayrışması
DCX antikoruMilliporeAB2253immün boyama
GFAP antikoruInvitrogen180063immün boyama
İzofluranHenry Schein Hayvan Sağlığı50562-1ameliyatı
fare için MCAO filamentiDoccol702223PK5Reameliyatı
Sıçan Doccol503334PK5Recerrahisi
MRE010 kateterBraintree ScientificMRE010enjeksiyon kateterinin hazırlanması
MRE025 kateteriBraintree ScientificMRE025enjeksiyon kateterinin hazırlanması
MRE050 kateteriBraintree ScientificMRE050enjeksiyon kateterinin hazırlanması
Nu-Tears MerhemNuLife PharmaceuticalsNu-Tears Merhemameliyat sırasında göz bakımı
S & T Forseps - SuperGrip Uçları JF-5TC Açılıİnce Bilim Araçları00649-11cerrahi
S & T Forseps - SuperGrip İpuçları JF-5TC DüzGüzel Bilim Araçları00632-11cerrahi
Süper YapıştırıcıPacer Teknolojisi15187enjeksiyon kateteri
şırınga pompasınınKent ScientificGenieTouchcerrahisi
Tuj1 antikoruMilliporeMAb1637immün boyama
iki bileşenli 5 dakikalık epoksiDevcon20445Enjeksiyon kateterinin hazırlanması
Vannas yaylı makasGüzel Bilim Araçları15000-08cerrahi
vasküler klemplerGüzel Bilim Araçları00400-03cerrahi
Zeiss mikroskobu ZeissAxio Görüntüleyici 2mikroskobu
için MCAO filamenti hazırlanması

Kaynaklar

  1. Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
  2. Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
  3. Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154(2018).
  4. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
  5. Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
  6. Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
  7. Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
  8. Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
  9. Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
  10. Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758(2017).
  11. Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
  12. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
  13. Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
  14. Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
  15. Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
  16. Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155(2015).
  17. Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
  18. Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967(2015).
  19. Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
  20. Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001(2013).
  22. Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  23. Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  24. Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
  25. Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
  26. Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ortak Karotis ArterEksternal Karotis ArterOrta Serebral Arter OklüzyonuGFP Etiketli HücrelerCerrahi KancalarEnjeksiyon KateteriKök Hücre Tedavisi
Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.