Yöntem makalesi

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

DOI:

10.3791/61141

⸱

5 Haziran 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1In vitro Toxicology Group, Swansea University Medical School

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedür, hem akut hem de uzun süreli, tekrarlanan doz rejimleri üzerinde nanomalzeme maruziyetleri ile ilişkili genotoksik tehlikelerin fizyolojik olarak daha ilgili bir değerlendirmesini sağlayabilen ileri 3D hepatik kültürlerin in vitro geliştirilmesi için kullanılmak üzere kurulmuştur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli mühendislik nanomalzemelerinin (ENM) hızlı gelişimi ve uygulanması nedeniyle, ENM'ye maruz kalmak kaçınılmazdır ve sağlam, tahmine dayalı in vitro test sistemlerinin geliştirilmesi esastır. Karaciğer metabolik homeostaz ve detoksifikasyonda hayati bir rol oynamanın yanı sıra ENM birikimi sonrası maruziyetin önemli bir yeri olduğu için, HEPATIK toksikoloji ENM maruziyeti düşünüldüğünde anahtardır. Buna ve 2D hepatosit modellerinin karmaşıklıkları doğru bir şekilde taklit etmediğinin kabul edilen anlayışına dayanarak, in vivo olarak gözlenen karmaşık çok hücreli etkileşimlerin ve metabolik aktivitenin karmaşıklıklarını taklit etmemektedir, enm tehlike değerlendirme amaçları için uyarlanmış fizyolojik olarak ilgili 3D karaciğer modellerinin geliştirilmesine daha fazla odaklanılmıştır. Hayvan deneylerini değiştirmek, azaltmak ve iyileştirmek için 3R'lerin ilkeleri doğrultusunda, hem genişletilmiş hem de tekrarlanan ENM maruz kalma rejimlerini (≤14 gün) destekleyebilen kullanıcı dostu, uygun maliyetli bir sistem olan 3D HepG2 hücre hattı tabanlı bir karaciğer modeli geliştirilmiştir. Bu küresel modeller (çapı ≥500 μm) proliferatif kapasitelerini korur (yani hücre modellerini böler) genotoksisite in vitro'yu etkili bir şekilde değerlendirmek için 'altın standart' mikronükleus testi ile birleştirilmiş olmalarını sağlar. Bir dizi toksikolojik uç nokta (örneğin, karaciğer fonksiyonu, (pro-)inflamatuar yanıt, sitotoksiklik ve genotoksisite) hakkında rapor verme yetenekleri, hem akut (24 saat) hem de uzun süreli (120 h) maruz kalma rejimlerinde çeşitli ENM'ler kullanılarak karakterize edilmiştir. Bu 3D in vitro hepatik model, daha gerçekçi ENM maruziyetlerini değerlendirmek için kullanılacak kapasiteye sahiptir, böylece ENM tehlike değerlendirmesini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde daha iyi desteklemek için gelecekteki bir in vitro yaklaşım sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan tabanlı çok sayıda uygulama (örneğin, gıda, kozmetik, giyim, spor ekipmanları, elektronik, ulaşım ve tıp) genelinde çeşitli mühendislik nanomalzemelerin (ENM) hızlı gelişimi ve uygulanması nedeniyle, insanların düzenli olarak ENM'ye maruz kalmaları kaçınılmazdır. Bununla birlikte, bu malzemeleri çok sayıda uygulamada avantajlı gören yeni, boyuta özgü fizyoterapi-kimyasal özelliklerin insan sağlığı ve çevre üzerinde yan etkilere neden olabileceğine dair endişeler artmaktadır. Şu anda, bu ENM'lere fizyolojik olarak daha fazla maruziyeti aktif olarak yansıtmak ve bu malzemelerin akut, uzun süreli ve tekrarlanan düşük doz maruz kalma senaryoları üzerindeki potansiyel toksisitesini değerlendirmek için birçok uluslararası faaliyet uygulanmaktadır.

Karaciğerin MARUZ KALMA SONRASI ENM birikiminin önemli bir bölgesi olduğu yaygın olarak bilindiğinden, HEPATIK toksikoloji ENM maruziyeti göz önüne alındığında anahtardır1,2. Ayrıca, karaciğer sistemik dolaşıma giren maddelerin metabolizması ve detoksifikasyonu için birincil organ sistemidir3. 2D hepatosit modellerinin karmaşık çok hücreli etkileşimlerin karmaşıklıklarını doğru bir şekilde taklit etmediğini veya in vivo olarak gözlenen metabolik aktiviteyi uygun şekilde temsil etmediğini kabul eden anlayışa dayanarak, in vivo ikame teknolojileri için sağlam ve fizyolojik olarak ilgili in vitro 3D karaciğer modelleri geliştirmeye daha fazla odaklanılmıştır4,5. Gelişmiş 3D kültür teknolojilerinin kullanılması, uzun süreli, tekrarlanan maruz kalma rejimlerinin araştırılmasını sağlayan in vitro hepatik modellerin uzun ömürlülüğünü artırır. Ek olarak, bu gelişmiş kültür formatı, safra canaliculi, aktif taşıyıcı süreçleri ve geliştirilmiş CYP450 ilaç metabolizasyon yetenekleri gibi gelişmiş fizyolojik, organotipik özelliklerin oluşumunu teşvik eder, böylece modellerin öngörülebilirliğini artırır6. Mono-kültürlerden (sadece hepatositler) veya ortak kültürlerden (nonparenkimal hücreli hepatositler) oluşan mevcut 3D in vitro hepatik modeller çeşitli biçimlerde mevcuttur, ultra yüksek yapışma plakalarındaki mikrotissues veya sferoidlerden, asılı damla sferoidlere, matrislere ve / veya iskelelere gömülü hücrelere ve mikroakışkan hücre kültürü platformlarına kadar, hepsi hepatik toksisite değerlendirmesi için etkili gelişmiş in vitro modeller olarak kabul edilir6,7. Bununla birlikte, bu model sistemlerinin çoğu yüksek bakım gerektirir, özel ekipman gerektirir ve pahalıdır. Ayrıca, bu modeller genellikle sabit DNA hasarını ölçen yöntemleri kullanarak genotoksisite testi gibi tehlike uç noktalarının değerlendirilmesinde kullanılmasını önleyen statiktir (yani bölünmeyen hücre modelleri). Genotoksisite, düzenleyici toksikolojide temel bir ön koşuldur ve herhangi bir toksik edicinin risk değerlendirmesinin hayati bir bileşenidir8. Eksojen bir maddeye maruz kalmadan sonra ortaya çıkabilecek tüm DNA hasarı biçimlerini ölçmek için uygulanabilecek tek bir test yoktur. Bununla birlikte, in vitro genotoksisite test pilinin temel bir bileşeni, brüt kromozomal hasarı ölçen güvenilir ve çok yönlü bir teknik olan mikronükleus testidir9. OECD Test Kılavuzu 487 tarafından açıklanan, in vitro DNA hasarını ve genotoksisiteyi değerlendirmek için kullanılan altın standart bir tekniktir ve düzenleyici tehlike değerlendirmesi10,11için test pili gereksiniminin bir parçasıdır.

İnsan hepatosellüler karsinom hücre hattı, HepG2, hücreler kolayca kullanılabilir, kaynağa nispeten ucuz, kültüre basit ve yüksek verim taramasına uygun olduğu için ilk tehlike değerlendirmesi taraması için yaygın olarak kullanılır12,13. 3D küresel yapılara kültürlendiğinde, karaciğer mikroçevresini iyi bir şekilde yeniden özetledikleri ve mikronükleus testini desteklemek için yeterli proliferatif yeteneklere sahip hepatik bir model sundukları gösterilmiştir3. HepG2 küresel modellerinin daha da geliştirilmesi, uzun süreli, tekrarlanan maruz kalma rejimleri (≤14 gün) üzerinde genotoksisite tehlike değerlendirmesini desteklemek için modelin uzun ömürlülüğünü ve karaciğer benzeri işlevselliğini iyileştirmek için kurulmuştur. Böylece, 3R'lerin değiştirilmesi ilkeleri doğrultusunda, hayvan deneylerini azaltmak ve iyileştirmek için mevcut protokol, akut, uzun süreli ve tekrarlanan kimyasal ve ENM maruziyetlerini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde takip eden birden fazla toksikolojik uç noktayı (örneğin karaciğer işlevselliği, (pro)enflamatuar belirteçler, sitotoksiklik ve genotoksisite) güvenilir bir şekilde değerlendirebilen gelişmiş bir 3D in vitro hepatik model sağlamak için kurulmuştur.

Burada, akut veya uzun süreli, tekrarlanan ENM maruziyetlerini takiben genotoksisite tehlike değerlendirmesi için fizyolojik olarak ilgili 3D hepatosit hücre hattı tabanlı in vitro model sistemi kurmak için bir yöntem sunuyoruz. Protokol 6 temel aşamaya ayrılabilir: kriyoprezer korunmuş HepG2 hücrelerinin kült haline alınması; HepG2 küresel preparat; HepG2 sferoid asılı damladan agarose süspansiyona transfer; HepG2 küresel hasat; mikronükleus tahlil ve puanlama; ve veri analizi.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.Culturing kriyoprezihed HepG2 hücreleri

NOT: Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC) elde edilen HepG2 hücreleri, 1x Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) foetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin antibiyotik ile desteklenmiş 4.5g/L D-glikoz ve L-glutamin ile kültürlendi.

  1. 37 °C'lik su banyosunda 30 dakika boyunca önceden ısınan DMEM hücre kültürü ortamı (takviyeler dahil).
  2. Bir şişe HepG2 hücresini sıvı azottan çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda 2-3 dakika boyunca çözün, hücre süspansiyonunun düzgün bir şekilde çözülmesini sağlamak için şişeyi hafifçe döndürün. Kirlenme potansiyelini azaltmak için şişeyi O-halkasının üzerine batırmamaya dikkat edin.
  3. Çözdükten sonra, şişeyi su banyosundan çıkarın ve steril, Sınıf II laminer doku kültürü başlığının altına yerleştirmeden önce şişenin dış yüzeyini arındırmak için% 70 etanol ile cömertçe püskürtün.
  4. HepG2 hücrelerinin kriyovyal içeriğini, önceden ısıtılmış DMEM hücre kültürü ortamının 9 mL'sini içeren bir santrifüj tüpüne (takviyelerle) dikkatlice pipetlayın.
  5. 10 mL'lik bir striptiz kullanarak, hücre süspansiyonunun 10 mL'sini 25 cm2 tek kullanımlık hücre kültürü şişesine aktarın ve alt kültürden daha büyük bir 75cm 2 tek kullanımlık hücre kültürü şişesine geçmeden önce %5 CO2 ve 37 °C'de kültürü 3 gün boyunca (tohumlamadan) kuluçkaya yatırın.

figure-protocol-1


  2. figure-protocol-2






figure-protocol-3




figure-protocol-4


figure-protocol-5

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu hücre hattı bazlı 3D karaciğer sferoid modelinin uzun süreli kültür ve genotoksik tehlike değerlendirmesi için uygunluğu, modelin kültürde 14 gün boyunca uygulanabilirliğini ve mikronükleus testine uygulanabilirliğini belirlemek için temel karakterizasyon yapılarak değerlendirildi.

3D HepG2 Karaciğer Küresel Modelinin Temel Karakterizasyonu
Herhangi bir in vitro toksikolojik değerlendirmeden önce, agarose transferi veya kimyasal / ENM tedavisini gerçekleştirmeden önce 3D HepG2 sferoidlerinin düzgün bir şekilde oluşmuş olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Asılı bırakma yöntemi kullanılarak üretilen HepG2 küresellerinin, Şekil 5A-5C'degösterildiği gibi ortalama çapı 495,52 μm W x 482,69 μm H olan kompakt, küresel şekilli küresel sferoidler oluşturması genellikle tohumlama sonrası 2 - 3 gün sürer (4000 hücre/küresel). Doğru oluşmuş ve in vitro toksikolojik değerlendirmede kullanılması kabul edilebilir olan HepG2 sferoidleri, pürüzsüz bir yüzeye sahip ve görsel projeksiyonları olmayan kompakt, küresel şekilli bir yapıya sahip olmalıdır. Şekil 5, kaliteli (Şekil 5D-F) ve düşük kalite (Şekil 5G-I) sferoid örnekleri sağlar. İkincisi atılmalıdır. Tipik olarak, plaka başına oluşan küresellerin% 90-95'i doğru şekilde oluşacak ve daha fazla deney için uygun olacaktır.

figure-results-1
Şekil 5: Asılı bırakma yöntemi ile oluşturulan HepG2 sferoidlerinin doğal morfolojisini gösteren ışık mikroskopi görüntüleri. (A-C) gösteri Gün 2 ve (D-I) Gün 4 HepG2 karaciğer sferoidleri tohumlama sonrası. (D-F) kaliteli HepG2 küresellerine örnektir, (G-I) ise kötü biçimlendirilmiş küreseller gösterir. Tüm görüntüler mikroskop kullanılarak X20 hedefiyle çekildi. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder.

HepG2 küresel canlılığını daha da doğrulamak için, karaciğer benzeri işlevlerini değerlendirmek için temel bir kolorimetrik Bromocresol Green Albumin (BCG) Tahlil veya Üre Tahlil yapılabilir. Karaciğer benzeri işlevsellik, karaciğer küresel modelinin uzun ömürlülüğünü belirlemek ve uzun süreli veya tekrarlanan ENM/ kimyasal bazlı tehlike değerlendirmesini destekleyip destekleyemeyeceğini belirlemek için 14 günlük bir kültür süresi boyunca Trypan Blue Exclusion Tahlil kullanılarak uygulanabilirlik doğrultusunda değerlendirildi (Şekil 6). Albümin konsantrasyonu kültür dönemi boyunca tutarlı kaldı. Üre üretimi, 7. 3D HepG2 sferoidlerde üretilen albümin ve üre seviyelerinin, 2D formatında kültürlenen aynı hücre hattında gözlemlenenden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu belirtmek önemlidir. Nitekim HepG2 hücrelerinin 2D kültürleri, pik albümin ve üre düzeyleri sırasıyla 0.001 mg/mL ve 0.010 ng/μL olarak sıralandı. Ayrıca, Shah ve ark. tarafından neredeyse aynı hepg2 sferoid sistemi kullanılarak yayınlanan önceki çalışmalarında, yazarlar 2D kültürlü HepG2 hücrelerine kıyasla 3D HepG2 in vitro model sistemlerinde metabolik aktivitede (CYP1A1 ve CYP1A2) önemli bir iyileşme olduğunu vurgulamaktadır5.

figure-results-2
Şekil 6: HepG2 karaciğer sferoidleri için 14 Günlük temel karakterizasyon verileri. Asılı düşüşten transfer edildiktan sonra, (A) HepG2 küresel modelinin 14 günlük bir süre boyunca uygulanabilirliğini vurgularken, (B) ve (C) sırasıyla karaciğer benzeri albümin ve üre işlevselliğini vurgular. SEM'± sunulan ortalama veriler, n = 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Nekrotik bir çekirdeğin kaçınılmaz gelişimi, 3D karaciğer sferoid kültürlerinin bilinen bir sınırlaması ile, mikronükleus testini desteklemek için gereken proliferatif yeteneği korurken uzun süreli (5-10 gün) maruz kalma rejimlerini sürdürebildiğini göstermek için bu HepG2 tabanlı modelin uygulanabilirliği oluşturulmalıdır5. Gerçekten de, bu 3D karaciğer sferoid modelinin kültürde 10 gün boyunca p canlılığı koruduğu gösterilmiştir. Buna dayanarak ve ≥14 günlük kültür döneminde gözlenen sürekli karaciğer benzeri işlevsellikle birlikte, bu 3D karaciğer küresel modeli böylece 10 güne kadar uzun süreli, tekrarlanan ENM maruz kalma rejimlerini destekleyebilir (yani, küresellerin yaşayabilirliği% 70'in altına düşmeden önce). Referans olarak, 4000 hücrede/sferoidde tohumlanan HepG2 sferoidleri için albümin seviyelerinin 20,0 ng/μL ≥ olması, üre üretiminin ise bu modelle in vitro toksikolojik değerlendirme yapmadan önce 0,25 ng/μL ≥ olması önerilir.

Mühendislik Nanomalzemelerinin Genotoksisite Değerlendirmesi
Genotoksisite değerlendirmesi için mikronükleus tahlili hem akut (24 saat) hem de uzun süreli (120 h) ENM maruziyetlerini takiben mikronüklei varlığını belirlemek için kullanıldı. Aflatoksin B1 bilinen bir karaciğer kanserojenidir16,17 ve mikronükleus tahlil için önerilen bir pozitif kontroldür. Optimizasyon deneyleri, 0.1 μM Alfatoksin B1'in 3D HepG2 karaciğer sferoidlerinde önemli bir pozitif (≥2.0 kat artış) genotoksik yanıt verdiğini ve bu nedenle bu modelle yapılan her mikronükleus testinde kullanıldığını göstermiştir. HepG2 küresel modeli kullanılarak yapılan mikronükleus test sonuçlarının geçerliliğini sağlamak için, bu 3D in vitro modelde kullanılan HepG2 hücreleri için arka plan mikronükleus frekansı% 0.6 –% 1.2 aralığında olmalıdır. Sonuç olarak, Alfatoksin B1, negatif kontrolde görülenden en az iki kat daha yüksek bir genotoksik yanıt vermelidir; böylece, 0.1 μM Alfatoksin B1% 1.5 -% 3.0 arasında bir mikronüklei frekansı indüklemelidir. Bu kontrol parametreleri kullanılarak, ENM ilişkili genotoksisite in vitro daha sonra güvenilir bir şekilde değerlendirilebilir. OECD Test Kılavuzu 487'ye dayanarak, bir ENM veya kimyasalı test ederken, seçilen konsantrasyonların% 55'ten fazla ±% 5 sitotoksisiteye neden olmaması gerektiğini belirtmek önemlidir (negatif kontrol ile ilgili olarak CPBI veya RVCC değerlerinde bir azalma ile gösterilir)11. Şekil 7, Aflatoksin B1 ve iki ENM (titanyum dioksit (TiO2)ve dilimleme (Ag)) HepG2 sferoidlerinde hem akut hem de uzun süreli maruziyetleri takiben değerlendirildiğinde ve daha sonra genotoksik potansiyel mikronükleus tahlili kullanılarak analiz edildiğinde elde edilen verileri göstermektedir. Değerlendirilen her iki ENM de akut (24 saat) maruz kalma ve uzun süreli (120 h) maruz kalma rejimi üzerinden noncytotoxic, düşük dozda 5.00 μg/mL'de test edildi. Hem TiO2 hem de Ag ENM'lerde genotoksisite için benzer bir eğilim gözlenebilir, böylece 24 saat maruz kalmanın ardından ortaya çıkan yüksek genotoksisite yanıtı uzun süreli 5 günlük maruziyet sonrasında belirgin değildi. Bu, her iki zaman noktasında aflatoksin B1 pozitif kontrolünün neden olduğu sürekli genotoksisiteye rağmen oldu.

figure-results-3
Şekil 7: TiO2 ve Ag ENM maruziyetini takiben Genotoksisite değerlendirmesi HepG2 karaciğer sferoidleriüzerinde. TiO2 ve Ag ENM'nin 5.00 μg/mL'sine uzun süreli (120 saat) maruziyette mikronükleus tahlil direği (A) akut (24 saat) ve(B) kullanılarak genotoksisite (mikronükleus sıklığı) değerlendirmesi. Negatif kontrol sadece bir ortamdır, pozitif kontrol ise 0.1 μM Aflatoksin B1'dir. SD. Negatif kontrolle ilgili olarak belirtilen anlam ± sunulan ortalama veriler (n=2) : * = s≤ 0,05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D hepatik modeller için uygulamalar, hedeflenen belirli biyokimyasal uç noktaya veya olumsuz sonuç yoluna bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Her modelin, birincil insan hepatosit (PHH) modellerindeki interdonor varyasyondan hücre hattı tabanlı modellerde azaltılmış sitokrom p450 aktivitesine kadar yararları ve sınırlamaları vardır, ancak hepsi kendi başına değerlidir6,12,18,19. Genotoksisiteyi değerlendirirken, aktif çoğalma gerektiğinden, in vitro mikronükleus testi gibi düzenleyici onaylı uç noktalarla uyumluluk modellerinde sınırlamalar vardır. Genotoksisite değerlendirmesi, DNA onarımının geçici lezyonları düzeltmesi için fırsat olduğunda sabit DNA hasarının hücre sonrası bölünmesinin ölçülmesini gerektirdiğinden, bu gereklidir. Ne yazık ki, son derece farklılaştırılmış hepatosit (yani, HepaRG) bazlı küreseller veya PHH mikrotizeleri, en fizyolojik olarak ilgili karaciğer benzeri özellikleri sergilediği düşünülen statik (proliferatif olmayan) modelleroluşturur 12,19,20. Sonuç olarak, burada sunulan 3D HepG2 küresel model, genotoksisite testini destekleyebilecek uygun, alternatif bir model sağlar. HepG2 hücre hattı bazlı küreseller, albümin ve üre üretimi ve bazı CYP450 aktivitesi5,12,19gibi temel karaciğer benzeri özellikleri korurken, küresellerin dış yüzeyinde yeterince aktif olarak bölünen hücrelere sahiptir. Esas olarak bu in vitro karaciğer modeli mikronükleus testini tamamlamak için geliştirilmiştir, çünkü bu genotoksisite testi için pilde önerilen iki in vitro testlerden biridir8,10,11,21. Bununla birlikte, model DNA dizileme analizi ve gen ekspresyon (RNA) teknolojilerine kolayca uygulanabilirken, kuyruklu yıldız testi gibi diğer DNA hasar uç noktaları için daha fazla uyarlanıp kullanılma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, ENM parazitinin bazı uç nokta analizlerinde oynadığı rolü göz önünde bulundurmak önemlidir. Örneğin, akış sitometrisi bazlı analizler özellikle partikül paraziti nedeniyle ENM genotoksisite değerlendirmesi için uygun olmayabilir22.

Aktif olarak hücre bölünmesi geçiren küresel modellerin sınırlayıcı faktörlerinden biri boyutlarıdır. Modelin çoğalmaya devam etmesine izin veren yeterli hücre olması gerektiğinden, tohumlama yoğunluğunun optimizasyonu kritik öneme sahiptir; ancak çok yüksek olmayan bir hücre sayısı, bu da küreselin aşırı kompakt hale gelmesine neden olur ve nekrotik çekirdeğin artmasına neden olur. Bu nekrozun nedeninin sınırlı oksijen ve besin difüzyonu olduğuna inanılmaktadır, çünkü bu difüzyonun sınırının yaklaşık 100 – 150 μm doku23,24olduğu düşünülmektedir. Ancak, bu hücre türüne, hücre numarasına, iskele etkileşimlerine ve kültür koşullarına bağlıdır25. O zamandan beri, yaklaşık 700 μm çapının C3A sferoidlerin merkezinde nekrozun erken başlamasını önlemek için sınır olduğu gösterilmiştir, küresel başına 4000 HepG2 hücresinin tohumlaması, maruz kalma sırasında modelin çapının ≤500 μm26olmasını sağlar. Ayrıca, Shah ve arkadaşları, küresel başına 5000 hücrenin üzerinde tohumlanan HepG2 hücrelerinin, kültürde 7 gün sonra canlılıkta% 25'lik bir azalma sergilediğini ve bunun ortalama 680 μm çapına ve 20 μL asılı damla5'tebesinlerin sınırlı mevcudiyetine bağlı olabileceğini tespit etti. Bunun üstesinden gelmek için, mevcut protokolde tasarlanan model, asılan damlanın küreselin ilk oluşumunu takiben agarose kaplı kuyulara aktarıldığı kritik bir adımdan geçer. Bu, küreseller içinde sürekli artan hücre sayısını sürdürmek için daha fazla kültür ortamının mevcut olmasını sağlar. Sonuç olarak, HepG2 küresel modeli kültürde 10 gün sonra% 70'in üzerinde uygulanabilir kalır ve uzun süreli tehlike değerlendirmesi in vitro içinkullanılabilir.

HepG2 küresel modeli hem akut hem de uzun süreli maruz kalma rejimlerini destekleyebilirken, uzun kültür dönemlerinde hücre kültürü ortamının yenilenmesi, sferoidlerin potansiyel kaybı nedeniyle ortamın tamamen değiştirilmesi tavsiye edildiği için bu model için kısıtlanır. ENM maruziyetlerinde, homojen ENM dağılımlarının aglomera ve tortuya eğiliminin yüksek olduğu varsayılmaktadır. Bununla birlikte, bir ENM çökeltilerinin parçacık parametrelerine (örneğin, boyut, şekil ve yoğunluk) bağlı olarak değişebileceği ve entrika sedimansasyonu, difüzyon ve dozimetri (ISDD) modeli veya enm (süspansiyon) maruziyeti ile ilgili olarak sıklıkla atıfta bulunulan son türevleri kullanılarak teorik olarak belirlenebileceği dikkat çekicidir27,28. Bu akılla, hücre kültürü ortamının sadece% 50'sinin hücre kültürünün yüzeyinden dikkatlice çıkarılması durumunda, ENM dozunun bozulması ve daha sonra çıkarılmasının teoride minimum olması gerektiği varsayılıyor. Bununla birlikte, Brownian hareketi söz konusu olduğunda, bu kesinlikle böyle olmayabilir ve test edilecek her bir ENM'nin birikmesi ve tortulması için daha fazla çalışma yapılmalıdır, doğru dozimetrinin uzun süreli maruz kalma rejimleri boyunca korunmasını sağlamak için27. Esas olarak bu, tekrarlanan dosing rejimlerini gerçekleştirirken göz önünde bulundurulacak potansiyel bir sınırlamadır, çünkü bu son, birikmiş konsantrasyon için kritik olabilir. Öte yandan, kimyasal bazlı maruziyetler, dikkate alınması gereken kendi sınırlamaları olmadan olmasa da, kimyasal maddelerin çözeltide kalma eğiliminde olduğu konusunda daha basit bir yaklaşım sunar ve böylece yeni eklenen konsantrasyona ek olarak orijinal kimyasal konsantrasyonun doğrudan değiştirilmesi, medya tazeleme sırasında kaybolan herhangi bir kimyasalın buna göre değiştirilmesini sağlar29. Gelecekteki uygulamalar, modelin uzun süreli kültür dönemlerinde tekrarlanan maruz kalma rejimlerine uygunluğunu değerlendirmeyi içerecektir, çünkü tekrarlanan dosing stratejileri, belirli bir organ sisteminin ksenobiyotik bir maddenin biyoakümülasyonundan kaynaklanan olumsuz etkileri iyileştirme veya üstesinden gelme yeteneğini değerlendirmek için çok önemlidir.

Sonuç olarak, bu 3D in vitro hepatik model, bir dizi gerçekçi maruz kalma senaryosunu değerlendirmek için kullanılacak kapasiteye sahiptir, böylece hem ENM'yi hem de kimyasal tehlike değerlendirmesini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde daha iyi desteklemek için gelecekteki bir in vitro yaklaşım sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu araştırmanın 760813 sayılı hibe anlaşması kapsamında AVRUPA Birliği'nin PATROLS projesi için Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon aldığını kabul etmek istiyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Aflotoksin B1Sigma Aldrich, İngiltereA6636-5MG
AgarozSigma Aldrich, İngiltereA9539-50G
Otoklav Bandı
BCG Albümin TestiSigma Aldrich, İngiltereMAK124
Sığır Serumu Albümin TozuSigma Aldrich, İngiltereA9418
Hücre Dondurma YardımıThermo Fisher Bilimsel, Birleşik Krallık5100-0001 - Bay Frosty
SantrifüjEppendorf5810 R
Cytochalasin BMerck, İngiltere250233
Sitoloji Metal Klipsleri
Cytospin 4 SantrifüjThermoFisher Scientific, İngiltereCM00730202
4.5g/L D-Glikozlu DMEM, L-GlutaminGIBCO, Paisley, İngiltere41965-039
DMEM, fenol kırmızısı, 4.5g/L D-Glikoz, Hepes ile L-GlutaminGIBCO, Paisley, Birleşik Krallık21063-029
DPX Montaj OrtamıFisherScientific, Birleşik KrallıkD/5330/05
EtanolFisherScientific, Birleşik Krallık10048291
FBSGIBCO, Paisley, Birleşik Krallık10270-106
Shandon Cytospiniçin Filtre KartlarıFisherScientific, İngiltere15995742
Buzlu Cam SlaytlarThermoFisher Scientific, İngiltere
Giemsa'nın Leke Geliştirilmiş R66 Çözümü, GurrVWR Chemicals, İngiltereMFCD00081642
Cam Lameller (24 x 60)Deckglaser, VWRECN631-1575
Hemositometre ve Lamel
Daldırma Yağı MikroskopZeiss, UK518F, ISO8034
Laminer Sınıf II Doku Kültürü HoodScanlaf Mars
Işık MikroskobuZeiss, UKAxiovert 40C
Sıvı Nitrojen
MetanolFisherScientific, İngiltere10284580
Mikrodalga
Filtresiz, Steril 200 & mikro; l ve 1000 & mikro; l Pipet uçlarıGreiner-Bio-One, İngiltere
NuncMicroWell 96 Kuyulu MikroplakalarThermoFisher Scientific, Danimarka167008
P1000 ve P200 mikropipetler
P300 ve P50 çok kanallı pipetler
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 ve CaCl2 ÜcretsizGIBCO, Paisley, İngiltere14190-094
Kalem / StrepGIBCO, Paisley, İngiltere15140-122, Penisilin / Strepmyosin 100X veya 10.000U / ml
Fosfataz Tampon TabletleriGIBCO, Paisley, İngiltere10582-013
Pipet Boy
Simport Scientific CytoSep Hunileri Shandon Cytospin 4 Santrifüjleri içinFisherScientific, Birleşik Krallık11690581
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" - ProbBranson, ABD101-063-971R
T-25 ve T-75 Doku Kültürü ŞişesiGreiner-Bio-One, İngiltereT-25 (690175) ve T-75 (660175)
Tripan Mavisi ÇözeltisiSigma Aldrich, İngiltereT8154-100mL
Üre Test KitiSigma Aldrich, İngiltereMAK006
Virkon DezenfektanDuPont, İngiltereRetrust + On Virkon
Su Banyosu (37? C)Grant JBNova 18
Tartı Terazisi
XyleneFisherScientific, UK10588070 %
0.05 Tripsin-EDTAGIBCO, Paisley, İngiltere5300-054
0.2mL ve 1.0mL Eppendorf TüpleriGreiner-Bio-One, İngiltere
0.45 & mikro; m Filtre ÜnitesiMillex HA, MF-Millipore, İngiltereSLHA033SS
1.0 mL ŞırıngaBD Plastipak, FisherScientific, İngiltere300185
20 mL LS Sintilasyon Cam Şişeleri, 22-400 Folyo Kaplı PP KapaklarDWK Life Sciences GmbH, AlmanyaWHEA986581
37? C ve %5 CO2 ISO Sınıf 5 Hepa Filtre İnkübatörüNUAIRE DHD Autoflow
3mL Pastör PipetiGreiner-Bio-One, İngiltere
50mL Konik Şahin TüpleriGreiner-Bio-One, İngiltere
50mL veya 100mL Cam Şişeler
50mL Etekli Şahin TüpleriGreiner-Bio-One, İngiltere
5mL, 10mL ve 25 mL PipetlerGreiner-Bio-One, İngiltere
9.4cm Kare, Petri KabıGreiner-Bio-One, İngiltere688161

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 7, 2(2010).">Geiser, M., Kreyling, W. G. Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 7, 2(2010).
  2. Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver. Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).">Modrzynska, J. Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver. Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).
  3. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).">Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
  4. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).">Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  5. A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).">Shah, U. -K., et al. A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).
  6. Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates. Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).">Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates. Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).
  7. 3D in vitro models of liver fibrosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).">van Grunsven, L. A. 3D in vitro models of liver fibrosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).
  8. In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced. Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).">Corvi, R., Madia, F. In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced. Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).
  9. In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).">Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).
  10. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).">Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  11. OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).">OECD. OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).
  12. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).">Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).
  13. A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity. Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).">Sison-Young, R. L., et al. A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity. Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).
  14. https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines (2019).">European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work. , Available from: https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines (2019).
  15. The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG. European Union Grant Agreement n° 2009. 21, 01(2014).">Jensen, K. A. The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG. European Union Grant Agreement n° 2009. 21, 01(2014).
  16. Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development. Toxins. 10, 214(2018).">Marchese, S., et al. Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development. Toxins. 10, 214(2018).
  17. Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods. Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).">Rushing, B. R., Selim, M. I. Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods. Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).
  18. The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model. Scientific Reports. 9, 7295(2019).">Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model. Scientific Reports. 9, 7295(2019).
  19. Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail. Frontiers in Pharmacology. 7, 443(2016).">Berger, B., et al. Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail. Frontiers in Pharmacology. 7, 443(2016).
  20. A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies. Archives of Toxicology. , (2014).">Ramaiahgari, S. C., et al. A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies. Archives of Toxicology. , (2014).
  21. Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials. Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).">Li, Y., et al. Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials. Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).
  22. A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).">Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).
  23. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).">Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  24. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).">Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).
  25. Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures. Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).">Asthana, A., Kisaalita, W. S. Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures. Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).
  26. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).">Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).
  27. The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles. Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).">Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles. Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).
  28. ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies. Particle and Fiber Toxicology. 7, 36(2010).">Hinderliter, P. M., et al. ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies. Particle and Fiber Toxicology. 7, 36(2010).
  29. Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies. Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).">Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies. Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure
Posted by JoVE Editors on 1/26/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure. The Representative Results section was updated.

Figure 6 in the Representative Results section was updated from:

Cell culture analysis; graph of cell viability and bar charts of albumin, urea over time in days.

to:

Cell viability, albumin, and urea levels over 14 days in culture; graphs of cell culture analysis.

The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:

With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain >70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥0.06 mg/mL whilst urea production should be ≥0.4 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

to:

With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain >70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥50.0 ng/μL whilst urea production should be ≥0.25 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

Etiketler

3B Karaci er ModelleriHepG2 SferoidMikron kleus AnaliziUzun S reli MaruziyetH cre Canl lKaraci er FonksiyonuSitotoksisite De erlendirmesiIn Vitro Modeller

İlgili makaleler