Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

11K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61155

⸱

15 Mayıs 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiobiology, Faculty of Military Health Sciences in Hradec Kralove, University of Defence, 2Department of Clinical Biochemistry and Diagnostics, University Hospital, 3Department of Oncology, Thomayer Hospital, Charles University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, Faculty of Medicine, Charles University

Bu makalede

Özet

Primer silia centriole ile ilişkili hücre dışı yapılardır. İmmünfloresan boyama ile primer silia tespiti son derece yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu protokolde primer silya yı ifade eden fibroblastlar sabit, immünolekeli ve floresan veya konfokal mikroskopta görüntülendi.

Özet

Primer silya, hücre döngüsünün ilerlemesi sırasında, özellikle hücre döngüsünün G0/G1 evreleri sırasında, mitoz dan önce rezorbe edilir. Primer silia iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da primer silia otomatik algılama için yazılım kullanarak dahil olmak üzere son derece sofistike yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak bu yöntemlerin gerçeklefltirilmesi için primer silyanın immünüdüoresan boyamasi gerekmektedir. Bu yayın asetilli alfa tubulin boyama tarafından primer silia in vitro kolay tespiti için bir protokol açıklar (aksoneme) ve gama tubulin (bazal vücut). Bu immünofloresan boyama protokolü nispeten basittir ve yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanır. Bu protokol, primer silya'yı ifade eden dört hücre hattının (C2C12, MEF, NHLF ve deri fibroblastları) nasıl sabit, immünosülvetli ve floresan veya konfokal mikroskopla görüntülenmiş olduğunu açıklamaktadır.

Giriş

Primer silia duyusal, soliter, membrana bağlı, hücrenin ana centriole ile ilişkili nonmotile yapılardır. Primer silya kırmızı kan hücreleri hariç en omurgalı hücrelerde bulunur, adipositler1, ve hepatositler2. Primer silya, ana bileşeni α-tubulin olan mikrotübüllerden oluşan uzamış bir aksonme olarak oluşur. Aksonme γ-tubulin yapılandırılır bazal gövde, yetişir. Primer silyanın uzunluğu 2-10 μm arasında değişir; ancak, boyutları glisilasyon sırasında değişebilir, açlık, hipoksi, sitotoksik stres, ya da iyonlaştırıcıradyasyonamaruz kaldıktan sonra 3,4,5,6,7. Genellikle, hücrelerin sadece bir birincil cilium var, hangi morfogenez ve hücre sinyalyolları hücre çoğalması ve farklılaşma için önemli yer almaktadır8,9.

Primer silia, özellikle G0/G1 evrelerinde hücre döngüsü ilerlemesi sırasında dinamik olarak düzenlenir ve HDAC6 (histone deacetylaz 6)10aracılı tubulin deasetilasyonu ile ilişkili bir süreçte mitoz bölünmeye girmeden önce rezorbe edilir. Primer silia rezorpsiyon tam an hücre tipi ve doğrudan aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13gibi bu süreçte yer genlerin ekspresyonuna bağlıdır.13 Hücre tipine bağlı olarak, primer silya reseptörleri farklı ifade, iyon kanalları, ve aktif sinyal yolları. Bunlar arasında proliferasyon ve sağkalımı etkileyen en önemli sinyal reseptörleri, EGFR, PDGFR ve FGFR bulunmaktadır. Kirpi, Çentik ve Wnt gibi bir veya daha fazla organın işlevini etkileyebilecek sinyal yollarından bazıları da dahildir. Bu fonksiyon birincil silya Çentik için belirli ligands tespit sağlar, hormonlar, ve serotonin veya somatostatin gibi biyolojik olarak aktif maddeler. Farklı uzunluklarda primer silya tarafından sergilenen diğer özel fonksiyonlar sıcaklık, yerçekimi ve osmolality14değişikliklere reaksiyon içerir.

Birincil silia canlı görselleştirme, iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da birincil silia55,15,,16,17otomatik algılama için yazılım gibi çeşitli yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak, bu yöntemler son derece uzmanlaşmış ve devam eden araştırma araştırma her aşamasında birincil silya boyama için temel, hızlı ve kolay yöntemler ihtiyacı vardır. Açıklanan kültürlü hücrelerde birincil silya tespiti için kolay ve yararlı bir yöntemdir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Kültür ortamının, çözümlerinin ve yemeklerinin hazırlanması

  1. Otoklav kapakları (22 x 22 mm). 6 iyi plaka hazırlayın. Çözülme fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik penisilin / streptomisin ve oda sıcaklığına kültür ortamı sıcak (RT). Tripsin-EDTA (%0.25) kullanın ve 1x PBS (kalsiyum ve magnezyum ile tamponlu salin) hücreleri geçmesi.
  2. DH2O'nda taze %4 paraformaldehit (PFA) (20 mL dH2O'da 800 mg PFA) hazırlayın. PfA her deney için yeni olarak hazırlanmalıdır. Çözeltiyi 55 °C'de kaputta 30 dk ısıtın. RT. Çözelti netleşene kadar 1 M sodyum hidroksit ekleyin (pH = 7.2-7.4). 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
    Not: PFA toksiktir; her zaman yeterli kişisel koruyucu ekipman giymek ve kimyasal başlık hazırlamak.
  3. %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin ve %2 glutamin içeren 500 mL kültür ortamı, DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartalı orta) hazırlayın.
  4. Steril dH2O'da %1 jelatin çözeltisinin 13 mL'sini hazırlayın (13 mL dH2O'da 130 mg jelatin). 6 kuyuluk tabaktaki her kuyu için 2 mL %1 jelatin kullanın. Steril tutun.
  5. % 70 etanol kullanarak laminar akış kaputunu temizleyin. Deneye başlamadan önce gerekli malzemeyi laminar akış kaputunun içine yerleştirin.

2. İmmünositokimya boyama için hücre kültürü

  1. Hücreleri eritin (Bu çalışmada C2C12, MEF, NHLF ve deri fibroblastları) standart teknikler kullanarak ve hazırlanan ortamın ~10-12 mL'si ile desteklenen bir T75 şişesinde plakalayın. Hücreler %70 birleştiğinde %37 °C/5% CO2/90% bağıl nem (RH) ile kuluçkaya yatırın.
  2. Hücreleri kuvözden çıkarın ve laminar akış kaputuna yerleştirin. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile kısa bir süre 2x durula. T75 şişesine ~2 mL %0,25 tripsin-EDTA ekleyin ve ~5 dk boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Hücre ayrışmasını izlemek için ters mikroskobu periyodik olarak kontrol edin.
    NOT: Kuluçka süresi hücre hattına bağlıdır ve bu nedenle ampirik olarak belirlenmelidir.
  3. Kültür medyasının 10 mL'lik hücrelerini yavaşça askıya alın ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için dikkatlice pipetleme. Gerekirse şişeyi tekrar durula.
  4. Hücre süspansiyonuna 50 mL konik tüp ve santrifüjde ~200 x g'de5 dk yerleştirin. Supernatant decant, kültür medya 10 mL ekleyin ve yavaşça pelet askıya. Hücre süspansiyonunun 20 μL'sini alın ve trypan mavisi ile 1:1 oranında karıştırın ve standart yönteme göre bir sitometrede sayın.
  5. Cımbız kullanarak 6 kuyuluk tabak her kuyu nun içine bir kapak kaydırın. Kuyulara ~2 mL dökerek kapakları jelatinle kaplar. Bu hücrelerin kapakları eklemek yardımcı olacaktır. Jelatin çözeltisini çıkarın ve birkaç dakika havanın kurumasına izin verin. Kapaklar artık hücrelerin ekimi için hazır. Hemen ekime başlayın.
  6. Her kuyuya 100.000 fibroblast tohum ve 2 mL kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 °C/5%2CO 2/90% RH'de kuluçkaya yatırın. Bu noktada, hücreler kullanıcının ihtiyaçlarına göre tedavi edilebilir. Silyasyon indüklemek için tedaviler daha önce tarif edilmiştir4,5.
    NOT: İlk tohumlama sayısı hücrelerin iki katına çıkarma süresine bağlıdır ve buna göre belirlenmelidir.

3. Primer siliain in vitro immünükoporesan boyantisi

  1. %4'lük paraformaldehiti RT'ye ısıtın Pasteur pipetleri, 1x PBS (RT), atık konteyneri, 15 mL konik tüpler, mikropipetler (0,5-10 μL, 20-200 μL ve 100-1000 μL) ve ipuçlarını hazırlayın. Kuvözdeki hücreleri alın ve banka yerleştirin.
    NOT: Boyama işleminin steril koşullarda yapılması gerekmez. Tüm çözümler RT'de olmalıdır.
  2. Her kuyudan ortamı kaldırın. Kapak kapağını kuyunun içinde bırak. Hücreleri 2 mL 1x PBS ile 3x yavaşça yıkayın. Pasteur pipeti kullanarak, hücreleri onarmak için her kuyuya 2 mL %4 PFA ekleyin. RT.'de 10 dakika kuluçkaya yat. PFA'yı çıkarın ve 1x PBS ile 3x yıkayın.
    NOT: Kuluçka dönemlerinde tüm kapak kaymasını kapsayacak kadar her zaman yeterli hacim kullanın. Asla hücrelerin kurumasına izin verme. Çözeltilerin hiçbirini doğrudan kapak kapağına dökmeyin.
  3. Kullanmadan önce 13 mL 1x PBS 10 dk %0,5 Triton X-100 hazırlayın. Her kuyuya 2 mL ekleyin. 15 dakika kuluçka. 1x PBS ile 4 x hafifçe yıkayın.
    NOT: Triton X-100, PBS'de ÇÖZÜNmez, RT. %0.5 Triton X-100 çözeltisini 37 °C'ye kadar su banyosunda çözünür.
  4. Kullanmadan önce keçi serumu 5 dk eritin. Keçi serumunu 1x PBS'de 1:20 oranında bloke edici bir çözelti olarak seyreltin. Her kapak slip'e 150 μL ekleyin ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Gerekirse blokaj süresini 60 dk'ya kadar uzatın. Keçi serumu ile bloke sonra hücreleri yıkamayın.
  5. Birincil antikorları (yani, anti-acetylated alfa tubulin ve anti-gama tubulin) 5 dk kullanmadan önce eritin. Antikorları 1x PBS'de ayrı ayrı şu şekilde seyreltin: fare 1:800 oranında asetilalfa tubulin ve 1:300 oranında tavşan anti-gama tubulin. Engelleme çözümlerini kaldırın. Yıkamayın. Kapaklara her iki antikor seyreltmesinin 150 μL'sini ekleyin ve RT'de 60 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bir gecede kuluçkaya yatan primer antikor solüsyonlarının 500-1.000 μL'sini kullanıyorsanız, 6 kuyu plakasını parafin filmli kapatın ve 4 °C'de saklayın. Alternatif olarak, nem odasında 150 μL antikor ve kuluçka kullanın.
  6. Birincil antikorları çıkarın. 2 mL 1x PBS ile kapakları çok hafifçe 3x yıkayın. 1:300 oranında Ayrı Cy3 koyun anti-fare ve Alexa Fluor488 keçi anti-tavşan seyrelterek 1x PBS ikincil antikorlar hazırlayın. Kapaklara her iki sekonder antikor seyreltmesinin 150 μL'sini ekleyin. Karanlıkta RT 45 dakika kuluçka.
    NOT: Fotobeyazlama önlemek için karanlıkta kuluçka. Gerektiğinde diğer ikincil antikor kombinasyonları kullanılabilir.
  7. Üreticinin talimatlarına göre bir DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindole) çözeltisi hazırlayın. Fazla aliquotları -20 °C'de saklayın. 1x PBS'nin 50 mL'inde bir stok aliquot'undan (1:5.000) 10 μL seyreltin. Bu seyreltmenin 2 mL'sini kapaklara ekleyin. Karanlıkta RT 5 dakika kuluçka.
    NOT: Fotobeyaztlamayı önlemek için karanlıkta ki hücreleri kuluçkaya yatırmak önemlidir. DAPI seyreltme 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
  8. Hazırlamak 2 iğneler, slaytlar, cımbız ve montaj medya. Slaytları etiketle.
  9. DAPI çözümlerini kuyulardan çıkarın. 1x PBS ile 3x yıkayın. Her slayta bir damla montaj ortamı koyun. Kapağı kuyunun dibinden hafifçe kaldırmak için iğneyi kullanın. Cımbızkullanarak kapağı çevirin ve yavaşça montaj ortamının üzerine yerleştirin. Dikkatlice herhangi bir kabarcıklar kaldırın.
  10. Slaytları ışıktan koruyun ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.
  11. Primer silya görselleştirmek için yüksek büyütme ile bir floresan veya konfokal mikroskop kullanın.
    NOT: Slaytlar karanlıkta 4 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Primer silianın immünoresan boyama yüksek kaliteli görüntüler le sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu deneylerde, primer silya ifade eden fibroblastlar, yukarıda açıklanan protokole göre floresan veya konfokal mikroskopiçinde sabit, immünoskoplu ve görüntülendi. Primer cilyum asetilatlı α-tubulin ve γ-tubulin kullanılarak saplandı. Primer silianın değerlendirilmesi çeşitli düzeylerde yapılabilir ve bu konudaki herhangi bir değişiklik iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalma ile bağlantılı olabilir, hücre metabolizması ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Çeşitli yazarlar birincil silya tespiti için çeşitli yöntemler açıklanan, bazen de kendi algılama etkileyebilir çeşitli fiksasyon yöntemleri açıklayan6,20,21,22. Ne olursa olsun, algılama için tam ve basit bir protokol bulmak zordur. Böyle bir yöntemin hazır kullanılabilirliği şüphesiz birincil silya soruşturma çalışmasına büyük yardımcı olacaktır, özellikle araştırmanın erken aşamalarında ya d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyiyok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çek Cumhuriyeti Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir - Uzun vadeli organizasyon geliştirme planı Askeri Sağlık Bilimleri Fakültesi, Savunma Üniversitesi Kitle İmha Silah Tıbbi Yönleri; Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı, Çek Cumhuriyeti (Özel Araştırma Projesi No: SV/ FVZ201703) ve PROGRES Q40/06. Ayrıca Daniel Diaz İngilizce dil revizyon yaptığı tür yardım için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6 oyuklu plakaTPP92406Boyutlar 128x86x22 mm
Alexa Fluor488Jackson ImmunoResearch111-546-047AffiniPure F(ab')? Parça: Keçi, Anti-Tavşan, IgG
Anti-Tubulin ve gama;Sigma-AldrichT5192Poliklonal Tavşan anti-Fare IgG2a
C2C12ATCCCRL-1772Myoblast (fare)
Cy3Sigma-AldrichC2181Anti-Fare IgG (tüm molekül) F (ab & prime;)2 parça– Koyun Dapi'de üretilen Cy3 antikoru
(4′,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür)Sigma-AldrichD9542
Dulbecco&akut; s Modifiye Kartal ve akut; s ortaThermo Scientific11960044Yüksek glikoz, glutamin yok, Gibco
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu SalamSigma-AldrichD8662MgCl < sub > 2 < / sub> ve CaCl < sub > <2 / sub> ile, Steril filtreli, Hücre kültürü için uygun
Fetal Sığır SerumuTermo Bilimsel16000044Steril Filtreli, Gibco
L-GlutaminSigma-AldrichG7513
MEFATCCSCRC-1039Fare embriyonik fibroblastı
Monoklonal Anti-Asetillenmiş TubulinSigma-AldrichT7451Fare NHLF'de üretilen Monoklonal Anti-Asetilatlenmiş Tubulin antikoru
LonzaCC-2512Primer akciğer fibroblastları (insan)
Normal Keçi SerumuJackson ImmunoResearch005-000-121
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127-500GToz
Penisilin-StreptomisinSigma-AldrichP0781% 0.9 NaCl'de mL başına 10.000 ünite penisilin ve 10 mg streptomisin, Steril Filtreli
ProLong Elmas Antifade MountantThermo ScientificP36961
Cilt fibroblastlarıCharles Üniversitesi, Hradec Tıp Fakültesi'nden nazikçe hediye edilmiştir. sevgié.
Kare Kapak SlipleriThermo Scientific22X22-1.5Borosilikat cam, 22x22mm, Kare
Triton X-100Sigma-Aldrich11332481001
Tripsin-EDTA (%0,25)Thermo Scientific25200072 Steril Filtreli, Gibco
,

Kaynaklar

  1. Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
  2. Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
  3. Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
  4. Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
  5. Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
  6. Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
  7. Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).
  8. Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
  9. Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
  10. Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
  11. Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
  12. Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
  13. Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
  14. Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905(2019).
  15. Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
  16. Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
  17. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1(2019).
  18. Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
  19. Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
  20. Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
  21. Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
  22. Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).
  23. Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5(2017).
  24. Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11(2015).
  25. DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

mm nofloresan BoyamaAsetillenmi Alfa T b linGama T b linH cre TesbitlemeFloresan MikroskopiKonfokal MikroskopiH cre K lt rAntikor BoyamaMontaj Medyas
İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.