Yöntem makalesi

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

10.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61167

⸱

10 Mayıs 2020

 ,  , 
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Bu makalede

Özet

Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (<50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.

Özet

Ventriküler kardiyak miyositlerin hayvan ve insan kalplerinden izole edilmesi kardiyak araştırmalarda temel bir yöntemdir. Hayvan kardiyomiyositler genellikle sindirim enzimleri ile koroner perfüzyon ile izole edilir. Ancak, insan kardiyomiyositleri izole etmek zordur çünkü insan miyokardiyal numuneler genellikle koroner perfüzyona izin vermez ler ve alternatif izolasyon protokolleri canlı hücrelerin verimlerinin düşük olmasıyla sonuçlanır. Buna ek olarak, insan miyokardiyal örnekler nadirdir ve sadece düzenli olarak yerinde kalp cerrahisi olan kurumlarda mevcuttur. Bu da bulguların hayvandan insan kardiyomiyositlerine çevrilmesini engellemektedir. Burada açıklanan insan ve hayvan miyokardiyum ventriküler miyositlerin verimli izolasyon sağlayan güvenilir bir protokoldür. Hücre hasarını en aza indirirken yüzey-hacim oranını artırmak için miyokard doku dilimleri 300 m kalınlığında miyokardiyal örneklerden vibratom ile üretilir. Doku dilimleri daha sonra proteaz ve kollajenaz ile sindirilir. Sıçan miyokardiyum protokolü kurmak ve akış-sitometrik hücre sayımı ile uygulanabilir, kalsiyuma dayanıklı miyositlerin verimlerini ölçmek için kullanılmıştır. Yaygın olarak kullanılan doku-öbek yöntemi ile karşılaştırıldığında çubuk şekilli kardiyomiyositlerin (41.5 ± 11.9 vs. %7.89 ± %3.6, p < 0.05) önemli ölçüde daha yüksek verimi saptandı. Protokol, verimin fare miyokardiyumundakine benzer olduğu ve yine doku-öbek yöntemine göre belirgin bir şekilde daha yüksek olduğu başarısız ve başarısız olmayan insan miyokardiyumuna çevrildi (45.0 ± 15.0 vs. 6.87 ± 5.23 hücre/mg, p < 0.05). Özellikle sunulan protokol ile makul sayıda insan kardiyomiyositini (9-200 hücre/mg) az miktarda dokudan (<50 mg) izole etmek mümkündür. Bu nedenle, yöntem hem insan hem de hayvan kalplerinden sağlıklı ve başarısız miyokardiçin geçerlidir. Ayrıca, soğuk kardiyoplejik solüsyonda 36 saate kadar saklanan insan doku örneklerinden uyarılabilir ve kontraktil miyositleri izole etmek mümkündür ve bu yöntem, yerinde kalp ameliyatı olmayan kurumlardaki laboratuvarlar için özellikle yararlı hale getirilmektedir.

Giriş

Kardiyomiyosit fizyolojisi içine önemli anlayışlar için yol açtı bir seminal tekniği bozulmamış kalplerden yaşayan ventriküler kardiyomiyositizolasyonolduğunu 1. İzole kardiyomiyositler normal hücresel yapı ve fonksiyon, ya da in vivo deneylerin sonuçlarını incelemek için kullanılabilir; örneğin, kardiyak hastalığın hayvan modellerinde hücresel elektrofizyoloji veya uyarma-daralma kaplin değişiklikleri değerlendirmek için. Ayrıca, izole kardiyomiyositler hücre kültürü, farmakolojik müdahaleler, gen transferi, doku mühendisliği ve diğer birçok uygulama için kullanılabilir. Bu nedenle, kardiyomiyosit izolasyonu için etkili yöntemler temel ve çevirisel kardiyak araştırmalar için temel değere dayanır.

Kemirgenler gibi küçük memelilerden ve domuz lar veya köpekler gibi daha büyük memelilerden gelen kardiyomiyositler, genellikle kalbin koroner perfüzyonu ile ham kollajenler ve/veya proteazlar içeren çözeltiler ile izole edilir. Bu kardiyomiyosit izolasyoniçin "altın standart" yöntemi olarak tarif edilmiştir, canlı hücrelerin% 70'e kadar verimleri sonuçlanan2. Yaklaşım aynı zamanda kabul edilebilir kardiyomiyosit verimleri 33sonuçlanan,insan kalpleri ile kullanılmıştır ,4,5. Ancak, koroner perfüzyon sadece sağlam kalp veya koroner arter dalı içeren büyük bir miyokardkin kama mevcut olduğunda mümkün olduğundan, çoğu insan kardiyak örnekleri küçük boyutu ve uygun vaskülatür eksikliği nedeniyle bu yaklaşım için uygun değildir. Bu nedenle, insan kardiyomiyositizolasyon zordur.

İnsan miyokardiyal örnekler çoğunlukla değişken boyutta doku parçaları oluşur (yaklaşık 0.5 x 0.5 x 0.5 cm için 2 x 2 x 2 cm), endomiyokardiyal biyopsiler ile elde6, septal miektomiler7, VAD implantasyonları8, veya eksplant kalpler9. Kardiyomiyosit izolasyonu için en yaygın prosedürler makas veya neşter kullanarak doku kıyma ile başlar. Hücre-hücre temasları daha sonra kalsiyumsuz veya düşük kalsiyum tamponlar daldırma tarafından bozulur. Bunu, proteazlar (örneğin, tripsin), kollajenaz, hyaluronidaz veya elastaz gibi ham enzim ekstreleri veya saflaştırılmış enzimler ile birden fazla sindirim adımı takip eder ve bu da ekstrasellüler matriksin parçalanması ve kardiyomiyositlerin serbestleşmesiile sonuçlanır. Son, kritik bir adımda, fizyolojik kalsiyum konsantrasyonu dikkatle restore edilmelidir, ya da hücresel hasar kalsiyum-paradoks10nedeniyle oluşabilir,11,12. Bu izolasyon yaklaşımı kullanışlıdır ancak genellikle verimsizdir. Örneğin, bir çalışmada yaklaşık 1 g miyokardiyal doku sonraki deneyler için uygun kardiyomiyosit yeterli sayıda elde etmek için gerekli olduğunu bulundu13. Düşük verim için olası bir nedeni doku kıyma nispeten sert bir yöntemdir. Bu miyositler enzimatik sindirim tarafından serbest olma olasılığı en yüksek olmasına rağmen bu özellikle yığın kenarlarında bulunan kardiyomiyositler zarar verebilir.

İnsan örneklerinden elde edilen hücrelerin izolasyon verimliliğini ve kalitesini etkileyebilecek bir diğer husus da doku iskemi süresidir. Çoğu protokol, iyi sonuçlar için bir ön koşul olarak laboratuvara kısa ulaşım süreleri söz. Bu, insan ventriküler kardiyomiyositlerin çalışmasını yakındaki kalp cerrahisi tesisleri olan laboratuvarlarla sınırlandırmaktadır. Birlikte, bu kısıtlamalar insan kardiyomiyositlerde hayvan modellerinden elde edilen önemli bulguların doğrulanmasını engellemektedir. Bu nedenle, düşük miktarda dokudan yüksek kardiyomiyosit verimi sağlayan, tercihen uzun taşıma sürelerinden sonra ciddi hasar olmadan geliştirilmiş izolasyon protokolleri tercih edilir.

Burada açıklanan bir vibratom14,,15ile oluşturulan ince miyokard doku dilimleri enzimatik sindirim dayalı bir izolasyon protokolüdür. Doku dilimlerinden izolasyonun makasla doğrama dan çok daha verimli olduğunu gösteriyoruz. Açıklanan yöntem sadece miyokard dokusunun küçük miktarlarda canlı insan kardiyomiyosityüksek verimleri için izin verir ama aynı zamanda depolanan veya soğuk kardiyoplejik çözelti taşınan örnekler için de geçerlidir 36 saat.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Farelerle yapılan tüm deneyler Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Mittelfranken, Bavyera, Almanya tarafından onaylandı. İnsan kardiyak doku örneklerinin toplanması ve kullanımı Erlangen-Nürnberg Üniversitesi ve Ruhr-Üniversitesi Bochum Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmalar Helsinki Bildirgesi'ne göre yürütülmüştür. Hastalar doku toplamadan önce yazılı bilgilendirilmiş onay larını verdiler.

Dişi Wistar sıçanları (150-200 g) ticari olarak elde edildi, 100 mg/kg tiopental-sodyum intraperitoneal enjekte edilerek anestezi yapıldı ve servikal çıkış ve ardından kalp torakotomi ve eksizyonu ile ötenazi yapıldı. İnsan kardiyak doku örnekleri mekanik yardımcı cihazların implantasyonu sırasında sol-ventrikül apikal çekirdekten, septal miektomiden, Fallot düzeltici cerrahi tetralojisi veya eksplant kalplerin serbest sol-ventriküler duvarından alındı. Aşağıdaki protokol, insan ventriküler dokusundan izolasyon açıklar. Sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyonu buna göre, ancak farklı enzimlerle gerçekleştirildi (bkz. Malzemeler Tablosu). Protokolün şematik iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir.

1. Tamponların, çözeltilerin ve enzimlerin hazırlanması

  1. Tablo 1'delistelenen arabellek ve çözümleri hazırlayın.
  2. Isınma çözeltileri 1, 2, 3 ve modifiye Tyrode çözeltisi 37 °C' ye ısıtın. Kesme çözeltisini kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: 1-2 miyokardiyal dilim için 35 mm doku kültürü çanağı nın izolasyonu için toplam 15 mL, 8 mL ve 5 mL çözelti 1, 2 ve 3 mL'dir. Birden fazla tabakta eşzamanlı miyosit izolasyonları için buna göre ölçeklendirin. Kesme çözeltisi dondurularak -20 °C'de aylarca saklanabilir.
  3. Tartmak 1 mg proteinaz XXIV (Malzemeler Tablosubakınız) önceden aşınmış 15 mL santrifüj tüp içine ve kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Bu, bir numuneyi işlemek içindir. Miktarı buna göre ölçeklendirin. Proteinaz ve kollajenaz karışımı etmeyin.
  4. Tartmak 8 mg kollajenaz CLSI (Malzemeler Tablosubakınız) önceden itil 15 mL santrifüj tüp içine ve kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Bu, bir numuneyi işlemek içindir. Miktarı buna göre ölçeklendirin. Proteinaz ve kollajenaz karışımı etmeyin.
    DİkKAT: Enzim tozunun solunmasını önlemek için yüz maskesi takın veya duman kaputunun altında çalışın.
    NOT: Enzim aktivitesi farklı kuralarda değişiklik gösterebilir. Bu nedenle, optimal konsantrasyon farklı olabilir ve her yeni satın alınan enzim16ile belirlenmelidir.

2. Miyokardiyal dokunun depolanması ve taşınması

  1. İnsan kardiyak örneklerini soğutulmuş, 4 °C kesme çözeltisinde saklayın ve nakledin (Tablo 1).
  2. Daha fazla doku işleme ve vibratome dilimleme için aynı çözeltiyi kullanın.
    NOT: Biyopsiler ve cerrahi kalp örnekleri hemen 4 °C'de kesme çözeltisine aktarılmalı ve bu protokol uygulanmadan önce 4 °C'de en fazla 36 saat saklanabilir veya taşınabilir.

3. Doku ların işlenmesi ve dilimlenmesi

NOT: Doku dilimleme protokolü Fischer ve ark.15izler.

  1. Doku bloğunun budama
    DİkKAT: İnsan kardiyak dokusu potansiyel olarak bulaşıcıdır. Her zaman koruyucu aşınma kullanın ve kurumunuzun güvenlik yönetmeliklerine uyun. Kullanılmış bıçakları dikkatlice talın ve emniyet kaplarına atın.
    1. Numuneyi 20 mL soğuk kesme solüsyonu yla dolu 100 mm'lik doku kültürü kabına yerleştirin ve soğutulmuş, 4 °C'lik bir tabla tutun.
    2. Bir neşter ile aşırı fibrotik doku ve epikardiyal yağ çıkarın. Transmural bir örnek olması durumunda, endokardiyumyakınında trabeculae ve doku tabakalarını çıkarın.
      NOT: Fibrotik doku sert ve beyaz görünür. Yağ genellikle yumuşak ve sarı beyaz görünür. Trabekül ve endokardiyal doku tabakaları gevşek doku bileşimlerinden ve epikardiyal tabakaların miyokardiyumuna göre hizalanmamış lif oryantasyonlarından saptanabilir.
    3. Optimum vibratom işleme için, yaklaşık 8 mm x 8 mm x 8 mm dikdörtgen doku bloklarını daha büyük bir doku örneğinden neşterle kesin. Küçük biyopsiler için bu adımı atlayın ve agarose katıştırma hareket.
  2. Kardiyak dokunun düşük erime noktası agarose içine gömüşme
    1. Bir cam kabında kesme çözeltisinin 10 mL'sinde 400 mg düşük erime noktası agarose kaynatın.
      DİkKAT: Yanıkları önlemek için eldiven ve güvenlik gözlüğü takın. Sıcak cam eşyaları sadece ısıyalıtımı ile takın.
    2. 10 mL'lik bir şırıngayı sıcak, çözünmüş agarose jelle doldurun. Şırıngayı kapatın ve agarose'un 37 °C'lik su banyosunda en az 15 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin.
    3. Kesilmiş kardiyak numuneyi veya biyopsiyi epikardiyum aşağı bakacak şekilde temiz bir 35 mm doku kültürü yemeğine yerleştirmek ve steril bir bezle fazla sıvıyı çıkarmak için terlikler kullanın.
    4. Şırıngayı boşaltarak doku üzerine dengede olan agarose'u (adım 3.2.2) dökün. Agarose dökülürken forceps ile hareket karşı doku güvenli. Doku tamamen agarose batırılmış olduğundan emin olun.
    5. Hemen buz üzerine çanak yerleştirin ve agarose 10 dakika boyunca katılaşmak sağlar.
  3. Miyokardisini dilimleme
    1. Vibratomun bıçak tutucuya yeni bir jilet takın ve mümkünse bıçağın z-sapmasını ayarlayarak vibratomu kalibre edin.
      NOT: Bu protokol, bıçağı yatay bir pozisyonda en az z-sapma (ölçülen sapma <0,1 μm) hizalamak için kızılötesi destekli kalibrasyon cihazı ile bir vibratom kullanır.
    2. Vibratom numune sahibi neşter bir agarose-doku bloğu çıkarmak için bir neşter kullanın. İstikrar sağlamak için, dokunun hala yeterince agarose (agarose marjları ≥ 8 mm) batırılmış olduğundan emin olun.
    3. Agarose bloğunu ince bir siyanoakrilat tutkal ve hafif basınç tabakası ile numune tutucuya sabitleyin.
    4. Numune tutucuyu dokuile birlikte vibratom banyosuna yerleştirin. Banyoyu kesme çözeltisi ile doldurun ve vibratomun dış soğutma tankına doldurulmuş ezilmiş buzla işleme boyunca 4-6 °C'de tutun.
    5. ≤0,1 mm/s ilerleyen hıza, 80 Hz'lik salınım frekansına, yanal genlik 1,5 mm'ye ve 15°'lik bıçak açısına sahip 300 μm kalınlığında dilimler oluşturun. Dilimleri tutarken, doku hasarı önlemek için doku kendisi yerine agarose tutun. Dilimleri kesme çözeltisindeki 4 °C'de gerekirse en fazla 2 saat saklayın.
      NOT: Kardiyomiyositler epikardiyuma paralel olarak yönlendirilir. Bu nedenle aşırı miyosit hasarından kaçınmak için epikardyuma paralel olarak kesilmesi önemlidir. Yalıtım için yalnızca tek tip sabit kalınlıkta dilimler kullanılması gerektiğinden, ilk 1-3 dilimin atılması önerilir. Küçük doku biyopsileri için, ancak, sadece ilk dilim atın.
    6. 40-100x büyütme ile standart bir ışık mikroskobu altında kardiyomiyosit hizalama kontrol edin.

4. Doku sindirimi

  1. Isı plakasını laboratuvar çalkalayıcısının üzerine yerleştirin ve 37 °C'ye ısıtın. Laboratuvar çalkalayıcısını 65 rpm'de başlatın.
  2. Proteinazı (adım 1.3'te hazırlanmış) çözelti 1'in 2 mL'sinde (adım 1.1 ve 1.2) eritin ve kullanıma kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Proteinaz ve kollajenaz karışımı etmeyin.
  3. Kollajenazi (adım 1.4'te hazırlanmış) çözelti 1'in 2 mL'sinde (adım 1.1 ve 1.2) eritin ve kullanıma kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Proteinaz ve kollajenaz karışımı etmeyin.
    DİkKAT: Koruyucu gözlük ve eldiven giyin, çünkü çözünmüş enzimler cilt ve göz yaralanmalarına neden olabilir.
  4. 5 μM'lik son konsantrasyona kalsiyum klorür (CaCl2)içeren çözeltiye (adım 4.3'te hazırlanmış) ekleyin.
  5. Vibratom banyosundan bir doku dilimini 5 mL önceden soğutulmuş kesme çözeltisi (adım 1.1 ve 1.2) ile dolu temiz 60 mm doku kültürü kabına aktarmak için forseps kullanın ve buzüzerinde tutun.
  6. Dikkatle bıçak veya forceps ile miyokardiyal dokudan agarose çıkarın.
    NOT: Kardiyomiyositlere zarar verebileceğinden miyokard idilimlerinde aşırı gerginlikten ve kesme stresinden kaçının.
  7. İlk yıkamayı gerçekleştirmek için, ısı plakasına temiz bir 35 mm doku kültürü çanak yerleştirin ve önceden ısıtılmış (37 °C) çözeltisi 1 2 mL ile doldurun. 1-2 miyokardiyal dilimi forceps ile hazırlanan tabağa aktarın. Çözeltiyi 1 mL pipetle aspire edin ve kesme çözeltisinin kalıntılarını gidermek için yıkama adımlarını 2 kat yapın.
    NOT: Kardiyak dilimleri aspire etmeyin. Çözeltiler ve dilimler ajite ısı plakası üzerinde 35 °C sabit sıcaklıkta kalmalıdır. Gerekirse ısı levhası sıcaklığını ayarlayın.
  8. Çözelti 1'i yemekten çıkarın ve proteinaz çözeltisinin 2 mL'sini ekleyin (adım 4.2). 65 rpm ısı plakaüzerinde 12 dakika kuluçka.
  9. 2 x önceden ısıtılmış çözelti 1 (37 °C) 2 mL ile yıkayın.
  10. Çözelti 1'i yemekten çıkarın ve 2 mL kollajenaz çözeltisi ekleyin (4.3 ve 4.4. adım). 65 rpm'de ısı plakasında en az 30 dk kuluçkaya yat.
  11. 30, 35, 40 dk, vb ücretsiz bireysel miyositler için kontrol edin, hafif bir mikroskop altında çanak yerleştirerek. Çözeltinin önemli ölçüde soğutulmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
    NOT: Gerekli sindirim süresi doku yapısına ve fibrozis derecesine bağlı olarak değişebilir. Doku gözle görülür şekilde yumuşadığında ve nazikçe çekildiğinde kolayca ayrıştırılır, en uygun sindirim süresine ulaşılmıştır. Yeterli doku varsa, birkaç dilim değişen sindirim süreleri paralel olarak sindirilebilir.
  12. Doku sindirildiğinde ve bireysel miyositler görünür olduğunda (adım 4.11), önceden ısıtılmış çözelti 2 mL 2 (37 °C) ile 2 x yıkayın ve 2 mL ile tekrar doldurun.

5. Doku dissociasyonu

  1. Dikkatle lifleri çekerek forceps ile sindirilmiş doku dilimleri ayrıştırın.
  2. Tek kullanımlık Pasteur pipet (açma çapı >2 mm) ile birkaç kez incelikle.
    NOT: Forceps ve pipetleme kullanımı mekanik strese neden olabilir ve kardiyomiyosit hasarına neden olabilir. Ancak, hücrelerin ayrılması için önemli bir adımdır. Hücre hasarını en aza indirmek ve dilimleri dikkatlice küçük parçalara ayırmak için ince çerkeçler kullanın.
  3. Işık mikroskobu altında kurtarılmış çubuk şeklindekardiyositler kontrol edin.

6. Fizyolojik kalsiyum konsantrasyonunun yeniden başlatılması

  1. Isı plakası üzerinde 35 °C'de ajitasyon yaparken kalsiyum konsantrasyonu yavaş yavaş 5 μM'den 1,5 mM'ye yükseltin. 10 mM ve 100 mM CaCl2 stok çözeltisi kullanın. Önerilen adımlar: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 μM. Hücrelerin her adım arasında 5 dk kuluçka aralıklarında artan kalsiyum seviyelerine uyum sağlamasına izin verin.
  2. Sindirilmemiş doku parçalarını forceps ile dikkatlice çıkarın veya kalsiyum artışının sonunda 180 μm gözenek boyutuna sahip bir naylon kafes aracılığıyla hücre süspansiyonfiltre.

7. Mekanik ayırma maddesinin çıkarılması

  1. Ajitasyonu durdurun ve çözeltinin üçte birini (~700 μL) 1.000 μL'lik pipetle üstten yavaşça çıkarın. Kardiyomiyositlerin aspirasyonundan kaçının.
    NOT: Sindirilmemiş doku çıkarılırsa, kardiyomiyositler kabın merkezinde birikir ve bu da hücresiz çözeltinin aspirasyonunu kolaylaştırır. Yoksa, hücre çözeltisini 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücrelerin 35 °C'de 10 dakika boyunca tortulanmasına izin verin, ardından supernatantın 700 μL'ini aspire edin ve hücreleri atın, yeniden askıya alın, 35 mm'lik doku kültürü yemeğine aktarın ve adım 7.2'ye geçin.
  2. Hücrelere 700 μL çözelti 3 ekleyin, ısı plakasında ajitasyon devam ve 10 dakika kuluçka.
  3. 7.1 ve 7.2 adımlarını tekrarlayın.
  4. Çözeltiyi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve kardiyomiyositlerin en az 10 dakika ve en fazla 30 dk oda sıcaklığında tortulanmasına izin verin veya 1 dk boyunca 50 x g'da döndürün. Supernatant'ı tamamen çıkarın ve modifiye Tyrode'un çözeltisinde veya istenen deneme arabelleğinde yeniden askıya alın.
    NOT: Kardiyomiyositler kullanılmadan önce modifiye Tyrode çözeltisinde(Tablo 1)37 °C'de birkaç saat ve %5 CO2'de saklanabilir.
  5. 40x ve 200x büyütme standart bir ışık mikroskobu ile hücre kalitesini doğrulayın.
    NOT: Kardiyomiyositlerin yaklaşık %30-50'si çubuk şeklinde, membran blebs olmadan pürüzsüz olmalı ve açık çapraz striations gösterilmelidir. Canlı hücrelerin sadece %5-10'u spontan kasılmalar göstermelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İzolasyon verimliliğini doğrulamak için protokol fare miyokardiyumile kullanıldı ve elde edilen canlı miyosit sayısı koroner perfüzyon yoluyla izolasyon ve küçük doku parçalarından izolasyon (parça izolasyonu, Şekil 2). Aynı kalplerden öbek izolasyonu ve doku dilimlerinden izolasyon yapıldı. Ancak koroner perfüzyon yoluyla izolasyon için tüm kalp kullanılmıştır. Koroner perfüzyon ağırlıklı olarak çubuk şeklinde ve çapraz striated kardiyomiyositler verdi. Miyokardiyal dilimlerden izolasyonlar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yaşayan kardiyomiyositlerin izolasyonu 40 yıldan daha uzun bir süre önce kurulmuş ve kardiyak araştırmalarda birçok deneysel yaklaşım için ön koşul olmasına rağmen, öngörülemeyen sonuçları olan zor bir teknik olmaya devam etmektedir. Enzim çözeltisi ile koroner arterlerin perfüzyon yoluyla kardiyomiyosit izolasyon yaygın küçük hayvanların kalpleri için kullanılan ve canlı hücrelerin çok sayıda verimleri. Ancak, bu nispeten karmaşık bir sistem ve uzmanlık gerektirir. Ayrıca, çoğu insan doku örnekleri bu yöntem için uygun ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Walter-Brendel Deneysel Tıp Merkezi, LMU Münih'ten Andreas Dendorfer'e dilimleme protokolüile ilgili yardımları için teşekkür ederiz. İnsan miyokardiyal doku örnekleri sağlamak için Kalp Cerrahisi Bölümü'nden Gazali Minabari ve Christian Heim'a, Erlangen Üniversitesi Hastanesi'nden, Erlangen Üniversitesi'nden Hendrik Milting'e, Erich & Hanna Klessmann Enstitüsü'nden Hendrik Milting'e, Ruhr-Üniversitesi Bochum'a ve Erlangen Üniversitesi Hastanesi Çocuk Kardiyoloji Bölümü'nden Muhannad Alkassar'a teşekkür ederiz. Akış sitometrisi desteği için Simon Völkl'e ve Çeviri Araştırma Merkezi'nden (TRC), Erlangen Üniversitesi Hastanesi'nden meslektaşlarımıza teşekkür ederiz. Ayrıca, Hücresel ve Moleküler Fizyoloji Erlangen Enstitüsü'nden Lorenz McCargo ve Celine Grüninger'e mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.

Bu çalışma, Erlangen-Nürnberg Üniversitesi Üniversitesi Hastanesi'ndeki Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) ve Universitätsbund Erlangen-Nürnberg tarafından DZHK (Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasallar< / güçlü >
2,3-bütandionemonoksitCarl Roth3494.1Saflık>% 99
Sığır serum albüminiCarl Roth163.2
CaCl < sub > 2 < / sub >Carl Roth5239.2
Kreatin monohidratAlfa AesarB250009
GlukozMerck50-99-7
HEPESCarl Roth9105.3
KClCarl RothP017.1
KH2PO4Carl Roth3904.2
L-glutamik asitFluka Biochemica49450
Düşük erime noktalı agarozCarl Roth6351.5
MgCl2 x 6H2OCarl RothA537.1
MgSO4Sigma AldrichM-7506
NaClCarl Roth9265.1
NaHCO3Carl Roth8551.2
ParaformaldehitSigma AldrichP6148
TaurinSigma AldrichT8691
Boyalar
Di-8-ANEPPSThermo Fisher ScientificD3167
Fluo-4Thermo Fisher ScientificF14201
FluoVoltThermo Fisher ScientificF10488
Enzimler
Kollajenaz CLS tip IWorthingtonLS0041964 mg / mL
'de insan dokusu için kullanılır (aktivite: 280 U / mg)
Kollajenaz CLS tip IIWorthingtonLS0041761.5 mg / mL 'de sıçan dokusu için kullanılır (aktivite 330 U / mg)
Proteaz XIVSigma AldrichP80380.5 mg / mL
'de sıçan dokusu için kullanılır (aktivite ve ge; 3.5 U / mg)
Proteinaz XXIVSigma AldrichP51470.5 mg / mL < br / >'de insan dokusu için kullanılır (aktivite: 7-14 U / mg)
< güçlü > Malzeme< / güçlü >
Hücre analizörü (LSR Fortessa)BD Bioscience649225
Santrifüj tüpü, 15 mLCorning430790
Santrifüj tüpü, 50 mLCorning430829
Kompakt çalkalayıcıEdmund Bü hlerKS-15 B kontrolüÇalkalama yönü: yatay
Tek kullanımlık plastik pastör pipetleriCarl RothEA65.1Hücre öğütmesi için yalnızca iç uç çapı & ge olan pipetler kullanın; 2 mm
ForsepsFST11271-30
Isı BloğuVWRBARN88880030
Naylon ağ filtre, 180 & mMerckNY8H04700
TC Çanak 100, StandartSarstedt83.3902
TC Çanak 35, StandartSarstedt83.3900
TC Çanak 60, StandartSarstedt83.3901
Vibratom (VT1200S)Leica1491200S001Z-sapmasının kızılötesi destekli düzeltmesi için VibroCheck içerir

Kaynaklar

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116(2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47(2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Vibratom ile Kesilmi KesitlerDoku Kesiti zolasyonuKardiyomiyosit VerimiAk SitometrisiProteaz Kollagenaz Sindirimiubuk ekilli MiyositlerKalsiyum ToleransElektrofizyolojik Analiznsan Miyokardiyumu

İlgili makaleler