Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

İntrakraniyal beyin metastazı modellemesi, tümör boyutunun izlenememe ve tedaviye tam ve zamanında yanıt verilememesi ile karmaşıktır. Sunulan metodoloji çiftler manyetik rezonans görüntüleme analizi ile intrakranial tümör enjeksiyonu, kombine edildiğinde, hassas ve tutarlı enjeksiyonlar, gelişmiş hayvan izleme ve doğru tümör hacmi ölçümleri yetiştirir.

Abstract

Kanserin metastatik yayılımı hastalığın ilerlemesinin talihsiz bir sonucudur, agresif kanser alt tipleri, ve/veya geç tanı. Beyin metastazları özellikle yıkıcı, tedavisi zor, ve kötü bir prognoz vermek. Amerika Birleşik Devletleri’nde beyin metastazlarının kesin insidansı tahmin etmek zor olsa da, ekstrakraniyal tedaviler kanser tedavisinde daha etkili olmaya devam olarak artması muhtemeldir. Bu nedenle, bu sitede metastaz tedavisinde yeni terapötik yaklaşımlar belirlemek ve geliştirmek gereklidir. Bu amaçla, kanser hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyon hangi model beyin metastazı için iyi kurulmuş bir yöntem haline gelmiştir. Daha önce, tümör büyümesini doğrudan ölçememe bu modele teknik bir engel olmuştur; ancak, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi küçük hayvan görüntüleme yöntemlerinin kullanılabilirliğinin ve kalitesinin artması, deneysel dönemde tümör büyümesini zaman içinde izleme ve beyindeki değişiklikleri çıkarabilme yeteneğini büyük ölçüde geliştirmektedir. Burada minofimetümörü tümör hücrelerinin immünoyitif farelere intrakranial enjeksiyonu ve ardından MRG ile gösterildiği gösterilmiştir. Sunulan enjeksiyon yaklaşımı, hassasiyeti artırmak ve teknik hatayı azaltmak için dijital olarak kontrol edilen, otomatik matkap ve iğne enjeksiyonu ile izofluran anestezi ve stereotaktik kurulum kullanır. MRG Ohio State Üniversitesi James Kapsamlı Kanser Merkezi Küçük Hayvan Görüntüleme Paylaşılan Kaynak bir 9.4 Tesla aracı kullanılarak zaman içinde ölçülür. Tümör hacim ölçümleri ImageJ kullanımı ile her zaman noktasında gösterilmiştir. Genel olarak, Bu intrakranial enjeksiyon yaklaşımı hassas enjeksiyon için izin verir, günlük izleme, ve doğru tümör hacmi ölçümleri, hangi büyük ölçüde beyin metastaz sürücüleri üzerinde yeni hipotezler test etmek için bu model sisteminin yarar geliştirmek kombine.

Introduction

Beyin metastazları erişkin primer merkezi sinir sistemi^{tümörlerinden}10 kat daha yaygındır ve akciğer kanseri, meme kanseri ve melanom en yüksek insidansını gösteren hemen hemen her katı tümör tipinde bildirilmiştir². Ne olursa olsun birincil tümör sitesi, beyin metastazı gelişimi genellikle bilişsel gerileme ile ilişkili kötü bir prognoz yol açar, kalıcı baş ağrısı, nöbetler, davranışsal ve / veya kişilik değişiklikleri^1,3,4,5. Meme kanseri açısından, hastalığın önlenmesi ve tedavisinde birçok ilerleme olmuştur. Ancak, meme kanseri tanısı kadınların% 30 metastaz geliştirmek için devam edecek, ve evre IV hastalığı olanların, yaklaşık% 7 (SEER 2010-2013) beyin metastazı var^6,7. Beyin metastazı için mevcut tedavi seçenekleri cerrahi rezeksiyon, stereotaktik radyocerrahi ve / veya tüm beyin radyoterapisi içerir. Ancak, bu agresif tedavi ile bile, bu hastalar için ortanca sağkalım kısa bir 8-11 ay^7,8,9. Bu acımasız istatistikler, yeni, etkili tedavi stratejilerinin tanımlanması ve uygulanması gereğini kuvvetle desteklemektedir. Böylece, beyne metastaz tüm kanserler olduğu gibi, düzgün laboratuvarda meme kanseri ilişkili beyin metastazı modeli esastır (BCBM) alanında önemli gelişmeler sağlamak için.

Bugüne kadar, araştırmacılar beyne metastaz mekanizmaları çalışmak için çeşitli metodolojiler kullandık, her biri farklı avantajları ve sınırlamaları^{ile 10,11}. Kuyruk damarı ve intrakardiyak enjeksiyon gibi deneysel metastaz yöntemleri tümör hücrelerini vücuda yaymakta ve enjekte edilen hücrelere bağlı olarak diğer metastatik bölgelerde büyük tümör yüküne neden olabilir. Bu sonuçlar daha sonra özellikle beyne metastaz çalışıyorsanız kafa karıştırıcı. İntrakarotid arter enjeksiyon yöntemi özellikle tümör hücrelerinin beyin tohumlama hedefleyen olarak avantajlı ama teknik olarak gerçekleştirmek zor olabilir gibi sınırlıdır. Ortotopik primer tümör rezeksiyonu genellikle tüm metastatik kaskad recapitulates olarak metastaz en klinik olarak ilgili modeli olarak kabul edilir. Ancak bu yaklaşım, lenf düğümü, akciğer ve karaciğer gibi diğer metastatik bölgelere kıyasla beyin metastazı oranlarının önemli ölçüde daha düşük olması için spontan metastaz için uzun süreli bekleme sürelerini içerir. Genellikle, hayvanlar beyin metastazı gelişiminden önce bu diğer metastatik sitelerde tümör yükü nedeniyle çalışmalardan çıkarılmalıdır. Beyin tropik hücre hatları içeren diğer yöntemler beyne metastaz etkilidir; ancak, bu modeller geliştirmek için zaman almak ve genellikle yayılma ile tropizm kaybetmek sınırlıdır. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, araştırmacılar^,rutin beyin^11,12,^13,,14 değişen metodolojileri 15 ,^{16,16,17,18,19}kanser metastazı modeli için intrakranial enjeksiyon yöntemi ni kullandılar. Bu yaklaşımın da benzer şekilde sınırlamaları olduğu kabul edilmektedir, en önemlisi primer tümörün intravazasyonu, kan beyin bariyerinden penetrasyon ve beyin içinde kurulması dahil olmak üzere erken metastatik adımların araştırılmasına izin vermemektedir. Ancak, araştırmacıların test etmek için izin yok (1) hangi tümör türetilmiş faktörler beyin içinde büyüme aracılık (örneğin, tümör hücrelerinde bir onkojenik faktörün genetik manipülasyon), (2) metastatik mikroortamda değişiklikler bu sitede kanser büyümesini nasıl alter (örneğin, değişmiş stromal bileşenleri ile transgenik fareler arasında karşılaştırma) ve (3) kurulan lezyonların büyümesi üzerinde yeni terapötik stratejilerin etkinliği.

İntrakraniyal enjeksiyon modelinin potansiyel faydası göz önüne alındığında, enjeksiyon sırasında teknik hatayı azaltmak ve zaman içinde tümör büyümesini tam olarak izlemek kesinlikle gereklidir. Burada açıklanan yöntem, inhale gaz anestezisinin sürekli dosing ve stereotaktik matkap ve enjeksiyon standı kullanılarak beyin parankim içine tümör hücrelerinin doğrudan implante içerir. Gaz anestezisi uygulamak, anestezinin derinliğini ve uzunluğunu hassas bir şekilde ayarlayarak hızlı ve sorunsuz bir şekilde iyileşmesini sağlar. Dijital olarak kontrol edilen, otomatik matkap ve iğne enjeksiyon sistemi enjeksiyon yeri hassasiyetini artırır ve genellikle delme ve serbest enjeksiyon yöntemlerinin neden olduğu teknik hatayı azaltır. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanımı tümör büyümesi, tümör hacmi, doku yanıtı, tümör nekrozu ve tedaviye yanıt ın izlenmesinde hassasiyeti daha da artırır. MRG yumuşak dokular için tercih edilen görüntüleme modalitesi^20,21. Bu görüntüleme tekniği iyonlaştırıcı radyasyon kullanmaz ve özellikle çalışma sırasında çoklu görüntüleme seansları için Bilgisayarlı Tomografi (BT) tercih edilir. MRG mevcut yumuşak doku kontrastı sonra BT veya ultrason görüntüleme (USG) çok daha büyük bir aralığı vardır ve daha ayrıntılı olarak anatomi sunar. Daha duyarlı ve beyin içinde anormallikler için özgüdür. MRG, 2D USG veya 2D optik görüntülemede olduğu gibi konuyu fiziksel olarak hareket ettirmek zorunda kalmadan herhangi bir görüntüleme düzleminde yapılabilir. Kafatasının diğer görüntüleme yöntemlerinde olduğu gibi MRSinyalini zayıflatmadığını belirtmek önemlidir. MRG, BT veya USG’deki kemik ten artefaktlarla gizlenebilecek yapıların değerlendirilmesine olanak tanır. Ek bir avantajı mri için birçok kontrast ajanlar olmasıdır, hangi lezyon algılama sınırını artırır, nispeten düşük toksisite veya yan etkileri ile. Daha da önemlisi, MRG tümör hacminin deşifre sınırlı nekropsi sırasında histolojik değerlendirme aksine gerçek zamanlı izleme sağlar. Biyolüminesans görüntüleme gibi diğer görüntüleme yöntemleri, zaman içinde erken tümör tespiti ve izlenmesi için gerçekten etkilidir; ancak bu yöntem hücre hatlarının genetik manipülasyonu (örn. luciferase/GFP etiketlemesi) gerektirir ve hacimsel ölçümlere izin vermez. MR görüntülerinin hasta takibi ve downstream hacimsel analizini yansıttığından MRG’nin nekropsi^22’dehistolojik tümör boyutuyla güçlü bir şekilde ilişkili olduğu bilinmektedir. MRG taraması ile seri izleme, ortaya çıkması halinde nörolojik bozuklukların klinik takibini de arttırır.

Genel olarak, seri MRG takip stereotaktik intrakranial tümör enjeksiyonu sunulan yöntem bize kanserde beyin metastaz mekanizmaları çalışma için güvenilir, öngörülebilir ve ölçülebilir sonuçlar üretmek sağlar.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler Ohio State Üniversitesi’ndeki (P.I. Gina Sizemore) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır; Protokol #2007A0120). Steril teknikler, sarf malzemeleri, aletlerin yanı sıra kürk çıkarma ve kesi bölgesinin steril hazırlanması da dahil olmak üzere tüm kemirgen sağkalım cerrahisi IACUC politikaları takip edilmektedir. 1. Meme kanseri hücrelerinin intrakranial enjeksiyon NOT: Burada açıklanan yöntemde primer MMTV-PyMT tümöründen elde edilen DB7 murine mamino tümör hücre hattıkullanılmıştır 23. Daha önceki çalışmalarda insan hastalığı12taklit histoloji ile BCBM bir model olarak DB7 hücrelerinin intrakranial enjeksiyon kurduk. Daha da önemlisi, db7 hücreleri bu fare suş türetilmiştir gibi bağışıklık yetkili FVB / N fareler bu model için kullanılır. Bu bir meme kanseri modeli olduğu gibi, yetişkin kadın fareler bu çalışmalar için kullanılır. Hücreleri hazırlayın. Steril bir başlık, standart teknikler kullanarak hücre kültürü plakaları aspire medya. Hücreleri 1x DPBS ile yıkayın ve üreticinin protokolünü kullanarak trypsine. Tripsin reaksiyonu durdurmak ve hemositometre veya tercih edilen yöntem kullanarak hücrelerin konsantrasyonu belirlemek için FBS içeren ortam uygun bir hacim ekleyin. 4 °C’de 4 dk için 300 x g pelet hücreleri. Aspire ortam, 1x DPBS ile yıkayın, 4 °C’de 4 dk için 300 x g’de yeniden döndürün. 1x DPBS’deki hücreleri uygun bir konsantrasyona, enjekte edilebilir hacim başına yaklaşık 50.000 hücreye 2 μL’lik bir şekilde yeniden askıya alın.NOT: Hücre numarası hattın saldırganlığına bağlıdır ve araştırmacı tarafından belirlenmesi gerekir. Biz rutin olarak 2 μL kullanmak, ancak hacimleri kullanımı <6 μL15,16,17,18,19bildirilir. Düşük hacimler hassasiyeti korumak için çok önemlidir. Canlılığı korumak için enjekte edilene kadar yeniden askıya alınan hücreleri buza yerleştirin. Fareleri ameliyata hazırlayın. Kürklü fareler için: ya tüy dökücü krem/losyon ile ya da tıraş yaparak kürkü kafatasından çıkarın. Ameliyattan önce 24-48 saat içinde bunu yapın çünkü bu adımı ameliyata çok yakın bir şekilde yapmak cilt kalitesini ve dikiş mukavemetini bozabilir.NOT: Kadın fvb/N fareleri ağırlıklı olarak kadın hastalığı olan metastatik meme kanseri çalışması nedeniyle yaklaşık 25 g ağırlığında kullanılmıştır. IACUC tarafından belirlenen ve veterinerhekime katılan analjezikler uygulayın: Buprenorfin SR-LAB deri altı enjeksiyonu (0.05-0.1 mg/kg doz, Buprenorfin stoku: 0.0025-0.088 mL dozaj için 0.5 mg/mL) ameliyattan en az 24 saat önce 72 h analjezi sağlamak için, gerekirse ilk dozdan sonra 48-72 saat tekrarlanabilir. Ayrıca ameliyattan önce en az 24-48 saat olmak üzere nSaid (içme suyunda ibuprofen) uygulayın ve ameliyat sonrası en az 72 saat analjezi sağlamak için ameliyattan sonra 2-7 gün devam edin.NOT: Ohio State Üniversitesi’nde, Buprenorphine SR-LAB kontrollü bir madde olduğu gibi University Lab Hayvan Kaynakları Veteriner personeli tarafından yönetilmektedir. Stereotaktik üniteleri ameliyatiçin hazırlayın. Tüm anestezi makinelerini, dijital Vernier pullarını ve dijital enjektörleri açın.NOT: Tüm cerrahi aletler ameliyattan önce yeterince temizlenmeli ve sterilize edilmelidir. Biyolojik güvenlik kabininde indüksiyon odası ekli anestezik makineleri kullanmak(Şekil 1A). Anestezi makinelerinden gelen tüm tüplerin stereotaktik çerçevelere(Şekil 1B, inset 1C)bağlı olduğundan ve tüplerdeki kelepçelerin kullanılan tüm üniteler için açık olduğundan emin olun. Ameliyat için kullanılmayacak stereotaktik çerçevelere giden tüplerüzerindeki kelepçeleri kapatın. Anestezi makinelerini fare ağırlığına göre tavsiye edilen burun konisi akış hızına ayarlayın (örn. 25 g hayvan ağırlığı: burun konisi akış hızı 34 mL/dk).NOT: Bu stereotaktik kurulumda yer alan baş tutucu sadece yetişkin fareler için önerilir. Stereotaktik kuruluma dahil edilen üretici önerilerinin izlenmesini sağlayın. Şırıngada önceden doldurulmuş uygun anestezinin (örneğin, isoflurane) anestezi makinesine bağlı olduğundan emin olun(Şekil 1B).NOT: Şırınganın aşırı astarlanması ameliyat sırasında farelere çok fazla anestezi verilmesine ve anestezik doz aşımına neden olabilir. Sahne kilidini bükerek, her matkabın içine bir matkap ucu adaptörü ve 1 mm matkap ucu yerleştirerek matkapları hazırlayın ve bit kilidi elle sıkarak matkabı kilitleyin. Stereotaktik çerçevelere matkaplar takın (Şekil 1C). 1x DPBS 5 alternatif yıkama ile Temiz Hamilton şırıngalar, sonra 70% etanol, sonra bir kez daha 1x DPBS. Hayvan enjeksiyon için hazır olana kadar bir kenara yerleştirin. Dijital enjektörü 0,4 μL/dk ve 2 μL’lik bir hedefle teslim etmek üzere ayarlayın. Bu hız ve hacim beyne tümör hücrelerinin yavaş giriş için izin, hangi basınç ve ilişkili hasarı azaltır. Fareleri stereotaktik çerçevelere yerleştirin. Söz konusu indüksiyon odasını kullanarak fareleri (örn. isoflurane) anesthetize edin. Derin bir anestezik düzlemde işlem boyunca fareler imuhafaza edin. Makine tarafından uygulanan % anestezi, akış hızı, uyarım derecesi ve vücut ısısı gibi bir dizi faktöre bağlıdır. Ritmik solunum için değerlendirerek anestezi derinliği için prosedür boyunca fareleri sık sık izleyin (hayvan nefes nefese değildir); palpebral refleks eksikliği (bir pamuk ucu aplikatör ile uyarıldığında göz kapaklarının çırpınma); ve parmak çimdik eksikliği (parmak lar çimdik leme zararlı uyarıcı üzerine ekstremite çekilmesi).NOT: Farklı fare suşları anesteziye farklı bir tepki verecektir. Fareler uygun, derin bir anestezik düzlemde kaldıktan sonra fareleri stereotaktik birime aktarın. Fare vücut ısısını ve uygun bir anestezi düzlemini korumak için stereotaktik makinedeyken bir ısıtma yastığı kullanın.NOT: Düşük profilli elde etmek için ters pipet ucu kutusuna yerleştirilen havayla çalışan el ısıtıcıları kullanıyoruz (Şekil 1D’dekifare yükseltme kutusu). Farenin ağzını açın ve dişleri stereotaktik çerçevenin üzerinde burun parçası üzerinde bulunan ağız çubuğunun çukuruna yerleştirin(Şekil 2A). Burun konisini farenin burnunun/ağzının üzerine kaydırın (Şekil 2B). Fareleri başları kadar düz bir şekilde ağız çubuğuna yerleştirin. Bir pamuk ucu aplikatörünün künt ucuyla ağzı yavaşça açın ve yerine kaydırın. Burun konisinin farenin burnunun tamamen üzerinde olduğundan emin olun veya anestezi düzgün bir şekilde teslim edilmeyecektir. Dişler bu oluk içinde oturmazsa burun konisi burunla etkileşime girmez (Inset Şekil 2A). Steril pamuklu bir bez kullanarak, farenin her gözünün üzerine göz yağlayıcı yerleştirin. Göz yağlayıcının uygulanması korneanın kurumasını azaltır ve kornea hasarı ve kornea travmasına bağlı postoperatif komplikasyonlar olasılığını azaltır. Sol kulak çubuğunu sol kulağın medial kanthusuna karşı depresif hale koyarak farenin kafatasını stabilize edin ve stereotaktik çerçevedeki vidayı kullanarak yerine kilitleyin. Daha sonra sağ kulak çubuğunu sağ kulağın medial kanthusuna doğru kaydırın ve stereotaktik çerçeveüzerinde sıkı vidalayın(Şekil 2B).NOT: Kulak çubuklarını yerleştirirken farenin başının düz ve düz olduğundan emin olun. Baş eğri veya açılı ise, enjeksiyon beyinde yanlış yerde olacaktır. Kulak çubukları sadece kafatası orta manuel sondalama ile uyarılma üzerine hareketsiz hale kadar sıkılmalıdır. Kalvariyal bir pencere yap. Hazırlamak ve 3x alternatif bir betadine çözeltisi ve% 70 etanol geçer ile kafa derisi temizleyin. Cerrahi alanın gözlere yakınlığı nedeniyle, betadine solüsyonu cerrahi scrub üzerinde kullanın. Steril bir neşter kullanarak, kafatasının ortanca yönü boyunca deri boyunca 3 mm’lik bir kesi yapın (sagittal sütür çizgisini takip ederek). Keside kanama çok az olmalı. Oluşursa, >30 saniye boyunca steril pamuk ucu aplikatör ile kanama yerinde tutarlı, sağlam basınç uygulayın. Matkapbregma(Şekil 2C)dik tanımlayın ve yönlendirmek, sıfırdan dijital Vernier ölçeği sıfırlamak için emin olun. Matkabı 2 mm lateral sagittal sütüne ve 1 mm anterior’u koronal sütüne taşıyın(Şekil 2C). Tekrarlanabilirlik için, sagittal dikiş hattının sağındaki veya sağındaki konumun tüm hayvanlar için tutarlı olduğundan emin olun. Matkabı en yüksek hızına çevirin. Dönen bitin neden olduğu doku hasarını önlemek için cildin matkaptan uzaklaştırDığından emin olun ve deliniyi kafatasına dikkatlice başlatın. Calvaria’nın yaklaşık 0,5 mm derinliğinde bir delik açarak calvarial pencereye yol açın. Çok fazla matkap düşürmek için dikkatli olun ya da beyne matkap olacaktır. Matkap hareket halindeyken matkap sahasında steril salinin düşmesi, makinetarafından üretilen ve çevre dokuda termal hasara yol açabilecek ısıyı dengeleyebilir. Kalvarial pencere yapıldıktan sonra, matkabı dikkatlice kaldırın ve stereotaktik çerçeveden çıkarın. Matkap parçalarını etanol kullanarak temizleyin ve tekrar kullanılıyorsa bir kenara koyun. Değilse, matkap uçları çıkarın ve% 70 etanol batırın. Kanser hücrelerinin beyne enjekte edilebis Otomatik enjektör ünitesini stereotaktik aygıta takın (Şekil 1D). Temiz bir Hamilton şırıngasında 1x DPBS’de iyice askıda kalmış hücrelerin >2 μL’sini yukarı çekin. Küme oluşumunu azaltmak ve homojen bir hücre bulamacı sağlamak için şırınga doldurmadan hemen önce hücreleri askıya emin olun. Hava cepleri/kabarcıklar olmadığından emin olmak için hücre hacminin 6-8°L’ini yukarı çekmek idealdir. Hamilton şırıngasını enjektör aparatının üzerine yerleştirin ve enjektörün düzgün çalıştığından emin olmak için tek kullanımlık steril perdeye az miktarda hacim vererek iğneyi enjeksiyon için asal. Bir pamuk ucu aplikatör ile% 70 etanol ile şırınga silin(Şekil 1D, inset). Bu enjeksiyon yolu boyunca tümör hücre tohumlama riskini azaltarak iğne mili dış varil tümör hücrelerini kaldırır. İğne ucunu kalvarial pencerenin ortasına hizala, neredeyse maruz kalan serebruma dokunarak. Dijital Vernier ölçeğini sıfırla. İğneyi yavaşça beyne 3 mm derinliğe yerleştirin ve devam etmeden önce iğnenin beyinde en az 60 saniye kalmasını bekleyin. Bu zaman dilimi beyin parankim iğne etrafında uyum sağlar, hangi geri basınç ve iğne yolu boyunca tümör hücrelerinin potansiyel sınırdışı azaltır. Enjekte etme alanında, hücrelerin enjeksiyon bölgesine teslimine başlamak için Çalıştır’ı seçin. Bu hacmi enjekte etmek yaklaşık 5 dakika sürer. Bu adım için uzun süre beyin parankim enjeksiyon kuvveti neden ikincil hasarı azaltmaktır. Enjeksiyon protokolü tamamlandıktan sonra, iğnenin en az 3 dakika boyunca beyinde dinlenmesine izin verin, bu da beyin parankiminin enjeksiyona alışmasını sağlar. En az 3 dakika sonra iğneyi beyinden 0,75 mm/dk hızla kaldırın. Sırt basıncı nı ve tümörü iğne yolu takibini azaltmak için bunu son derece yavaş ve tutarlı bir şekilde yapın. İğne beyinden çıktıktan sonra Hamilton şırıngasını enjektörden dikkatlice çıkarın ve adım 1.2.8’de açıklandığı gibi temizleyin. Steril pamuklu bir bez kullanarak kalvarial pencereye sıcak kemik balmumu uygulayın. Kemik balmumu kafatası içinde tümör tutmak için fiziksel bir bariyer görevi görür. Kesiyi kapatın (örn. 5-0 PDS çözünebilir dikişleri basit bir kesik desenveya dikiş klipsleri içinde, hangisi cerrah için en rahatsa). Anestezi nin yönetimini durdurun ve kulak çubuklarını açarak ve kaydırarak, burun konisini fareden kaydırarak ve ağız çubuğundan dişleri çıkararak fareyi cihazdan çıkarın. Fareyi, iyileşmek için 37 °C’ye kadar daha sıcak bir setin üzerine yerleştirin. Genellikle anestezi kesildikten 10-15 dakika sonra meydana gelen kurtarma sırasında fareleri izleyin. Fare kurtarıldıktan sonra, ev sahibi kurumun IACUC tarafından belirlenen erken kaldırma kriterlerini izleyin. 2. Manyetik rezonans görüntüleme Görüntülemeden24 10-20 dakika önce standart intraperitoneal enjeksiyon ile farelere Gadolinyum bazlı kontrast madde (0,1 M MultiHance 100 μL/20 g vücut ağırlığı faresi) uygulayın. Daha sonra% 95 O2 ve% 5 CO2 (yani, oda hava gazı temin) ile karışık bir inhale anestezik (örneğin, isoflurane) ile bir indüksiyon odası kullanarak anestezi. Vücut ısısını korumak için fareyi ısıtılmış bir tutucunun üzerine yerleştirin. Kulak uçları ve bir ısırık çubuğu ile baş güvenli ve bir fare beyin yüzey bobini ile donatılmış 9,4 T mıknatıs yer tutucu. Görüntüleme süresi boyunca anestezi korumak, bir çalışma genellikle fare başına yaklaşık 20 dakika sürer. Bir pnömatik yastık ve küçük hayvan izleme sistemi kullanarak işlem boyunca solunum hızı ve kalp hızı (~ 70 bpm) izleyin. Yerelleştirici görüntü elde edin ve ardından Fare beynini T2 ağırlıklı RARE dizisi (TR = 3500-4228 ms, TE=12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2.0 x 2.0 cm, matris boyutu = 256 x 256, 1 mm veya 0.5 mm dilim kalınlığı, NA=2-4, 15-30 bitişik dilimler) ve gadolinyum bazlı kontrast T1 ağırlıklı nadir dizi (TR = 1200 ms, TE=7.5 ms, RARE Factor = 4 , FOV=2.0 x 2.0 cm, matris boyutu = 256 x 256, 1 mm veya 0.5 mm dilim kalınlığı, NA=2-4, 15-30 bitişik dilim). Görüntüleme sonrası, fareyi iyileşmek için 37 °C’ye kadar daha sıcak bir sete yerleştirin. 3. Hacimsel tümör ölçümleri Toplam tümör hacmi elde edilmesi ImageJ, Ulusal Sağlık Enstitüleri (https://imagej.nih.gov/ij/)25üzerinden ücretsiz olarak indirilebilir bir görüntü işleme yazılımı MRI DICOM veri dosyası açın.NOT: ImageJ, tümör hacim hesaplamaları için gömülü piksel boyutlarını kullanmak için gerekli olan DICOM dosyalarının görüntülenmesini sağlar (bkz. Resim, “uzunluk birimi”nin istenilen şekilde ayarlanabileceği özellikler (örn. mm). Tümörün etrafına bir anahat çizmek için Freehand Selections aracını kullanın. Görünürlüğü artırmak için bu seçimleri karanlık bir odada gerçekleştirin. Oturumlar arasında tutarlılığı korumak için parlaklığı/kontrastı ayarlamayın. Çözümle sekmesinin altında, seçili bölgenin alanını elde etmek için Ölçü’ü seçin. Adım 3.1.1.’de milimetre lik birim seçilirse, alan metreküp olarak verilecektir. İstenirse ctrl+Dseçerek Serbest Seçim’i katıştırın. Düzenleme’ye giderek çıktı rengini değiştirme | Seçenekler | Renk. Görüntüyü RGB görüntüsüne dönüştürün (Resim | Türü | RGB renk) .tif dosya olarak kaydetmeden önce. Tek bir fare için tümör içeren tüm dilimleri ölçmeye devam edin ve değerleri uygun bir veri analizi yazılım programına (örneğin, Microsoft Excel veya GraphPad Prizma) kopyalayın. Toplam tümör hacmi elde etmek için her dilimden alanları toplamı. Dilim kalınlığına (alan/kalınlık) göre alanı düzelttin. 3.1.1.-3.1.5 adımlarını tamamlayın. tüm fareler in toplam tümör hacmine sahip olana kadar. Tümörlerin ana hatlarını biraz subjektif doğası göz önüne alındığında, aynı metodoloji birden çok kez tekrarlanır ve teknik hatayı azaltmak için ortalama ise idealdir. Ölçek çubukları ayarlamak için DICOM veri dosyasını açın ve Analyze | Araçlar | Ölçek Çubuğu. Boyutlar ZATEN DICOM dosyasına gömülü olduğundan, istediğiniz uzunluk/genişliği seçmemem gerekir. Bir RGB görüntüsüne gizli (Resim | Türü | RGB renk) .tif dosya olarak kaydetmeden önce.

Representative Results

Şekil 3, murine meme tümörü hücrelerinin enjeksiyon sonrası iki zaman noktasında (gün 7 ve gün 10) tek bir fare için tümör hacmi nicelemesi genel olarak gözden geçirilme. Bu deney için 50.000 DB7 hücresi enjekte edildi ve hayvanın beyni MRG ile değerlendirildi. Her tarar için 30 dilim (0,5 mm kalınlık) ele geçirildi. Tetkik başına 30 dilimin değerlendirilmesi, enjeksiyon sonrası 7 günde 5 dilimde tümör yükü(Şekil 3A)ve 10 enjeksiy…

Discussion

İntrakranial enjeksiyonun mrg ile seri takibin ardından kullanılması, tümör büyümesini zaman içinde tümör hacmi doğruluğu ile görselleştirme yeteneğini sağlar. Dijital görüntüleme analizinin uygulanması tümör hacmi, kanama, nekroz ve tedaviye yanıt için beyin lezyonlarının yorumlanmasına olanak sağlar.

Her yordamda olduğu gibi, başarı için izlenmesi gereken önemli adımlar vardır. İlk olarak, stereotaktik cihazların dikkatli bir şekilde kurulumu bu tekniğ…

Materials

Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters