Yöntem makalesi

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

DOI:

10.3791/61313

⸱

9 Eylül 2020

 ,  , 
1Department of Pathology and O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham, 2Surgical Discovery Centre, Department of Veterinary Medicine, University of Cambridge

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik metastazı modellerinde metastaz düzgün bir şekilde veya %100 insidansla gelişmez. Doğrudan intraosseöz tümör hücresi enjeksiyonu akciğerin embolizasyonu ile sonuçlanabilir. Primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını, kemik içine solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleyen, tekrarlanabilir engraftman ve büyümeye yol açan tekniğimizi sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer kemik tümörleri veya solid tümörlerden kemik metastazı ağrılı osteolitik, osteoblastik veya mikst osteolitik / osteoblastik lezyonlara neden olur. Bu lezyonlar kemik yapısını bozar, patolojik kırık riskini artırır ve hastaları sınırlı tedavi seçenekleriyle baş başa bırakır. Primer kemik tümörleri uzak organlara metastaz yapar ve bazı tipleri diğer iskelet bölgelerine yayılabilir. Bununla birlikte, son kanıtlar, birçok katı tümörle, kemiğe yayılmış kanser hücrelerinin, nihayetinde diğer organ sistemlerine metastaz yapan hücrelerin birincil kaynağı olabileceğini düşündürmektedir. Primer kemik tümörlerinin çoğu sinjenik veya ksenogreft fare modeli, tümör hücresi süspansiyonlarının intra-osseöz (ortotopik) enjeksiyonunu içerir. Katı tümörlerden iskelet metastazının bazı hayvan modelleri de doğrudan kemik enjeksiyonuna bağlıdır, diğerleri ise hücreleri intravasküler olarak veya primer tümörün organına enjekte ederek kemik metastatik kaskadının ek adımlarını özetlemeye çalışır. Bununla birlikte, bu modellerin hiçbiri güvenilir bir şekilde veya% 100 insidansı ile kemik metastazı geliştirmez. Ek olarak, tümör hücrelerinin doğrudan intra-osseöz enjeksiyonunun, akciğerin potansiyel tümör embolizasyonu ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu embolik tümör hücreleri aşılanır, ancak metastatik kaskatı özetlemez. Taze veya kriyokorunmuş tümör fragmanlarının (tümör hücreleri artı stromadan oluşan) minimal invaziv bir cerrahi teknik kullanılarak doğrudan proksimal tibiaya implante edildiği bir fare osteosarkom modeli sunduk. Bu hayvanlar tekrarlanabilir engraftman, büyüme ve zamanla osteoliz ve akciğer metastazı geliştirdi. Bu teknik, solid tümör kemik metastazını modellemek için kullanılacak çok yönlülüğe sahiptir ve optik veya ileri görüntüleme ile izlenebilen bir veya daha fazla hücre tipi, genetiği değiştirilmiş hücreler, hasta kaynaklı ksenogreftler ve / veya etiketli hücrelerden oluşan greftleri kolayca kullanabilir. Burada, primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını kemiğe solid tümör greft implantasyonu kullanarak modelleyen bu tekniği gösterdik.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan ve hayvan hastalıklarının fare modelleri, biyomedikal araştırmalarda giderek daha popüler hale geliyor. Bu bağlamda fareleri kullanmanın yararı, anatomi ve fizyolojilerinin insanlara çok benzemesidir. Olgunluğa ulaşmak için doğum sonrası yaşamda nispeten kısa bir gebelik süresine ve süresine sahiptirler ve büyük ölçüde nispeten düşük bir maliyet ve barınma kolaylığı ile ilişkilidirler, ancak artan geliştirme veya satın alma maliyetleri daha yüksek derecelerde genetik modifikasyon, immün yetmezlik ve / veya insancıllaştırma ile ilişkilidir1. Akraba suşların kullanımı, çalışmanın dahil edilmesinden önce büyük ölçüde tekdüze bir hayvan popülasyonu ile sonuçlanır. Genomlarının tam bir bilgisi, insanlara yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Fare genomunda birçok hastalık süreci için ortolog moleküler hedefler tanımlanmıştır ve şimdi kolayca elde edilebilen fareye özgü reaktiflerin kapsamlı bir kütüphanesi bulunmaktadır. Bu nedenle, daha büyük hayvan modellerine kıyasla daha hızlı ve daha ucuz bir şekilde nispeten yüksek verimli analiz için fırsat sağlarlar1. Ek olarak, belirli genlerin küresel olarak veya hücre tipine özgü bir şekilde ve / veya yapısal veya indüklenebilir bir şekilde aşırı ekspresyonuna veya silinmesine izin veren genetik düzenleme stratejilerinin ortaya çıkmasıyla, insan ve hayvan hastalıklarının araştırılması için biyolojik olarak çok yararlı bir model sistemi temsil etmektedirler2.

Kanser, fare modellerinin büyük faydaya sahip olduğu bir alandır. Kanserin genetik fare modelleri, hücrelerin onkojenik transformasyona uğraması için onkogenlerin veya tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonunun tek başına veya kombinasyon halinde modülasyonuna dayanır. Primer veya yerleşik tümör hücre hatlarının farelere enjeksiyonu da gerçekleştirilir. İnsanlardan veya fareler de dahil olmak üzere diğer hayvan türlerinden hücre hatlarının veya dokuların tanıtılması, in vivo olarak en yaygın kullanılan kanser modeli olmaya devam etmektedir. İmmün sistemi baskılanmış farelerde farklı türlerden (ksenogreftler) hücrelerin ve dokuların kullanımı en yaygın olarak gerçekleştirilir2. Bununla birlikte, hem konakçının hem de alıcının aynı türden olduğu allogreft tümör hücrelerinin veya dokularının kullanılması, sinjenik sistemlerde aynı konakçı fare suşu ile birleştirildiğinde sağlam bir bağışıklık sistemi ile etkileşime izin verir3.

Primer kemik tümörleri veya solid tümörlerden kemik metastazı ağrılı osteolitik, osteoblastik veya mikst osteolitik / osteoblastik lezyonlara neden olur 3,4. Bu tümörler kemik yapısını bozar, patolojik kırık riskini arttırır ve hastaları sınırlı tedavi seçenekleriyle baş başa bırakır. Primer kemik tümörleri uzak organlara metastaz yapar ve bazı tipleri diğer iskelet bölgelerine yayılabilir. Meme kanserli hastalarda kemik, metastatik hastalığın ilk metastazının en sık görüldüğü ve ilk ortaya çıktığı yerdir 5,6. Ek olarak, yayılmış tümör hücreleri (DTC'ler) diğer organlarda metastaz tanısı konmadan önce kemik iliğinde bulunur ve gelişimini öngörür7. Bu nedenle, kemikte bulunan kanser hücrelerinin, nihayetinde diğer organ sistemlerine metastaz yapan hücrelerin kaynağı olduğuna inanılmaktadır. Ağırlıklı olarak akciğer ve lenf nodlarında metastaz geliştiren ve tümör tipine ve enjeksiyon tekniğine bağlı olarak, potansiyel olarak diğer organ sistemlerinde metastaz geliştiren birçok fare katı tümör metastazı modeli mevcuttur3. Bununla birlikte, kemik metastazının fare modelleri, güvenilir bir şekilde, bölgeye özgü iskelet metastazı üreten ve fareler primer tümör yükünden veya metastazdan diğer organlara erken çıkarma kriterlerine ulaşmadan önce kemik metastazı geliştiren eksiktir. Primer kemik tümörü osteosarkomunun, solid tümör allogreftinin farelerin proksimal tibiasına cerrahi implantasyonuna dayanan bir modelini sunduk8. Kemik tümörleri farelerin %100'ünde oluşmuş ve %88'inde pulmoner metastaz gelişmiştir. Bu metastaz insidansı, insanlarda klinik olarak yaygın olarak bildirilenleri aşmaktadır (~% 20-50), ancak akciğer osteosarkom için en sık metastaz yeri olduğu için büyük ilgi çekmektedir 9,10,11. Bu model primer kemik tümörlerinin modellenmesinde avantajlı olmakla birlikte, meme, akciğer, prostat, tiroid, hepatik, renal ve gastrointestinal tümörler gibi diğer osteotropik solid tümörlerden kemik metastazının modellenmesinde de büyük faydası vardır.

Bu modelin geliştirilmesinin mantığı, primer kemik tümörlerini veya kemik metastazını modellemek için tipik olarak proksimal tibia veya distal femura geleneksel intra-osseöz enjeksiyona bir alternatif geliştirmekti12. Öncelikli amacımız bu tekniğin bilinen bir kısıtlılığını, yani akciğerin tümör embolizasyonunu hafifletmekti. Bu, bu embolik tümör hücrelerinin engraftmanı ve akciğerlere metastaz yapan yerleşik bir primer kemik tümöründen tam metastatik kaskatı özetlemeyen "yapay metastaz" ile sonuçlanır 8,13. Bu aynı zamanda yerleşik bir kemik metastazının uzak bir bölgeye yayıldığı durum olacaktır. Ek olarak, bu teknik, ortotopik veya intravasküler enjeksiyon teknikleriyle karşılaştırıldığında, kemikte ve tekdüze bir bölgede daha fazla engraftman ve tümör büyümesi insidansı sağlayacak bir kemik metastazı modeli üretmek için geliştirilmiştir. Bu modelin, açıklanan bu tekniklere göre belirgin avantajları vardır. Bu model, tümör hücrelerinin kemiğe kontrollü ve tutarlı bir şekilde verilmesini içerir. Ayrıca, pulmoner embolizasyonu takiben yapay akciğer metastazını önler ve temel bir tekdüze çalışma popülasyonu oluşturur. Primer tümörlerden veya diğer organlara metastaz sonucu oluşan erken çıkarma kriterleri riski olmadan bu model ile bölgeye özgü tümörlerin yararı vardır. Son olarak, bu model, hasta kaynaklı ksenogreftlerin kullanımı da dahil olmak üzere modifikasyon için büyük bir faydaya sahiptir.

Sunulan model, cerrahi bir yaklaşımı takiben kemiğe doğrudan hücre süspansiyonu enjeksiyonu ile benzerlikler göstermektedir, ardından korteksten enjeksiyon veya kortekste küçük bir kusur yaptıktan sonra kemik iliği boşluğuna verilmesi (medüller boşluğu raybalama ile veya olmadan)8,14,15,16,17. Bununla birlikte, bir tümör allogreftinin implantasyonu bu tekniği belirgin şekilde farklı kılar. Bu nedenle, bu raporun amacı, daha önce tarif edilen modellerin birçok sınırlamasının üstesinden gelen primer kemik tümörleri ve solid tümörlerden kemik metastazı modelini göstermektir. Hücre kültürü, fare modelleri, fare anestezisi ve cerrahisi ve fare anatomisi konusunda deneyime sahip araştırma grupları, farelerde birincil kemik tümörlerini veya kemik metastazını modelleme tekniğimizi yeniden üretmek için iyi donanımlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Cambridge Üniversitesi, Cambridge, İngiltere'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hücre hatlarının hazırlanması

  1. Geleneksel hücre kültürü veya farelere enjeksiyon için laboratuvarın standart hücre kültürü protokollerine uygun olarak hücre hatlarını büyütün. Burada kullanılan standart protokoller, Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu (FBS), L-glutamin ve penisilin / streptomisin (bundan böyle tam büyüme ortamı olarak anılacaktır) içeren modifiye Eagle's besiyerinde büyümedir.
    NOT: Bu deneyde, Abrams osteosarkom hücreleri Balb / c Foxn1 nu / nu farelerde kullanılmıştır. Meme kanseri çalışmaları için, Balb / c farelerde 4T1 hücreleri ve C57BL / 6 farelerde EO771 hücreleri kullanılır.
  2. Havalandırmalı doku kültürü şişelerinde veya 6 kuyucuklu doku kültürü plakalarında 37 ° C'de% 5 CO2'de hücreleri büyütün.
  3. İlgilenilen hücre hattını geçin ve hücreler bu hücrelerin farelere enjeksiyonu ile yaygın olarak kullanılan bir akıcılığa ulaştığında hücreleri enjeksiyon için hazırlayın.

2. Hayvanlar

  1. Hayvanların hızlı büyüme fazının ötesinde olduklarından ve yetişkinlik ve iskelet olgunluğuna ulaştıklarından emin olmak için deri altı tümör oluşumu için en az 6-8 haftalık olan Balb / c Foxn1 nu / nu farelerini kullanın.
  2. Erkek veya dişi fareler kullanın. Hormona duyarlı hücre hatlarını seçerken istisnalar yapın (örneğin, dişi farelerde meme kanseri hücreleri ve erkek farelerde prostat kanseri hücreleri).
  3. Ksenogreft deneyleri için, normal koşullar altında sağlam bir fare bağışıklık sistemi ile uyumsuz olan hücre hattına dayanan immün yetmezlikli atletik çıplak fareler kullanın.
  4. Murin hücre hatlarını kullanan allogreft deneyleri için, bu aynı zamanda farklı fare genetik ve bağışıklık geçmişlerine dayanarak da önerilir. Bununla birlikte, sinjenik deneyler için, ilgilenilen hücre çizgisiyle aynı suştaki hayvanları kullanın.
  5. Kurumun hayvancılık politikalarına bağlı olarak standart yoğunluklarda ev hayvanları.

3. Subkutan tümörler

  1. Tripsinizasyon yoluyla kültürden hücre hatlarını toplayın ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın.
  2. Hücre canlılığını değerlendirin ve tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücre yoğunluğunu belirleyin. Hücreleri saymak için bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanın. Deri altı tümörleri oluşturmak için farelere enjeksiyon için minimum% 90'lık bir hücre canlılığı kullanılmalıdır.
  3. Hücre yoğunluğunu, 0,1 ila 0,15 mL (100 ila 150 μL) steril PBS'nin son hacminde 1-2 x 105 hücre enjekte edecek şekilde ayarlayın. Enjeksiyona kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
  4. Alternatif olarak, pelet hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj edilerek. Süpernatantı atın ve peletlenmiş hücreleri seyreltilmemiş steril bazal membran matris ortamında yeniden askıya alarak 0,1 ila 0,15 mL'lik (100 ila 150 μL) son hacimde 1-2 x 105 hücre elde edin. Daha sonraki kullanıma kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
  5. Oksijen anestezisinde izofluran ile deri altı tümör büyümesi için kullanılacak fareleri anestezi altına alın. 2 L/dak oksijende %5 izofluran indüksiyon dozu ve 2 L/dak oksijende %2-3 izofluran idame dozu kullanın. Daha fazla ilerlemeden önce yanıp sönme veya pedal reflekslerinin eksikliğini kontrol edin.
    NOT: İzofluran inhalasyonel bir anesteziktir. İzofluranı, uygun süpürme ve serbest gaz toplama sistemleri ile iyi havalandırılan bir alanda kullanın. Anestezi indüksiyonu, bakımı ve izlenmesi için bir plan geliştirmek ve laboratuvar personelinin anestezi izleme ve inhalan anestezik ajanların kullanımı konusunda uygun eğitime sahip olduğundan emin olmak için lütfen kurumsal veteriner hekim personeline danışın.
  6. Anestezi uygulanan farelerin toraksının dorsal bölgesinden veya karnından saçları epilasyon çözeltisi veya elektrikli bir kesme makinesi ile çıkarın. Cilde gelebilecek olası travmayı en aza indirmek için epilasyon solüsyonu tercih edilir. Atimik çıplak fareler kullanıyorsanız bu adımı atlayın.
  7. Hücre süspansiyonunun enjeksiyonundan önce hazırlanan alanı% 70 etanol çubukla temizleyin.
  8. Omuz bıçaklarının hareketinden etkilenmemek için hücreleri göğüs kafesinin veya karnın dorsal bölgesine deri altından enjekte etmek için 27 G iğneli 1 mL'lik bir tüberkülin şırıngası kullanın. Alternatif olarak, hücreleri ticari olarak temin edilebilen hücre dışı matriste bir süspansiyon olarak deri altından enjekte edin.
    NOT: Ticari olarak temin edilebilen hücre dışı matrise enjeksiyon, hücre süspansiyonunun deri altı boşluğundaki göçünü sınırlayacaktır, çünkü bu matrisler oda sıcaklığında katılaşır.
  9. Fareleri ambulatuvara kadar bireysel kafeslerde bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarın. Fareler daha sonra temiz, kuru yataklarla normal kafeslerine yerleştirilebilir.
  10. Dorsal toraks veya karın bölgesini kaplayan subkutan tümörün boyutunu bir kumpas ile izleyin ve deri altı tümörlerin ülsere olmadığından veya farelerin kurumların hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından belirlenen erken çıkarma kriterlerini karşılamadığından emin olmak için haftalık olarak vücut ağırlıklarını ölçün. Cilt ülserasyonu veya santral tümör nekrozu riskini azaltmak için herhangi bir boyutta maksimum 15 mm'lik bir tümör boyutu önerilir.
    NOT: İzin verilen maksimum tümör boyutunu/hacmini belirlemek için yerel kılavuzlara başvurun.
  11. Üç ila dört hafta sonra deri altı tümörleri taşıyan fareleri CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın. Kurumun fare ötenazisi için kabul edilebilir politikalarına uyun.
  12. Aseptik cerrahi teknik kullanarak deri altı tümörleri toplayın. Tüyü çıkardıktan sonra% 70 etanol ile tümörün üstündeki cildi daha önce olduğu gibi sterilize edin (varsa). Tümörün üzerini örten deriden #15 neşter bıçağı ile (neşter bıçağı saplı veya neştersiz) kesin. Tümörü çevreleyen bağlı yumuşak dokulardan bir çift steril cerrahi makasla keskin bir şekilde diseke edin.
  13. Tümörü, tam büyüme ortamı içeren 6 delikli doku kültürü plakalarına yerleştirin ve #15 neşter bıçağı ile (neşter bıçağı saplı veya sapsız) önceden belirlenmiş boyutta (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm - 0,25 mm 3'e kadar3 ila 1 mm x 1 mm x 1 mm - 1 mm3) birden fazla küçük parçaya bölün.
  14. Tümör fragmanlarını intratibial implantasyon zamanına kadar oda sıcaklığında steril tam büyüme ortamında tutun. Lusiferaz veya floresan muhabir genleri taşıyan hücre hatları için, farelere intratibial implantasyondan önce tümör canlılığını doğrulamak için ex-vivo biyolüminesan veya floresan görüntüleme kullanın.
  15. Kriyoprezervasyon için,% 20 FBS ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş tam büyüme ortamına aynı kriyoviyal içine birden fazla parça yerleştirin. Ticari bir kriyoprezervasyon sistemi kullanarak –80 °C'de kademeli olarak dondurun ve sıvı azotta uzun süre saklayın. Tümör fragmanlarını sonraki analizler için koruyun, ancak gelecekteki implantasyon için değil, sıvı azot daldırma kullanarak anında dondurma ile koruyun. Bu donmuş tümör parçalarını -80 ° C'de uzun süre saklayın.
    NOT: Daha önce snap frozen tümörlerin in vivo8 infüzyon yapmayacağı ve büyümeyeceği bildirilmiştir.

4. Subkutan tümör fragmanlarının cerrahi implantasyonu

  1. Cerrahi implantasyondan önce deri altı tümörün taze veya kriyokorunmuş parçalarını tam büyüme ortamında oda sıcaklığına getirin.
  2. Bölüm 3'te açıklandığı gibi oksijen anestezisinde izofluran kullanarak ilgili suşun farelerini uyuşturun. Devam etmeden önce pedal reflekslerinin eksikliğini kontrol edin. Perioperatif analjezi sağlamak için subkutan buprenorfin'i 0.02-0.05 mg / kg'lık bir dozda uygulayın. Bu, gerekirse ameliyat sonrası dönemde her 6-8 saatte bir tekrarlanabilir.
  3. Cilde potansiyel travmayı en aza indirmek için sağ diz eklemindeki ve arka bacağın proksimal tibiasındaki kılları epilasyon solüsyonu ile çıkarın.
  4. Hazırlanan bölgeyi cerrahi antiseptik ile ovalayın. Önce %70 etanol çubukla ovalayın ve ardından alternatif klorheksidin ve tuzlu su ovma ile ovalayın.
  5. Proksimal tibiayı, eklemi esnetirken ve uzatırken diz eklemine sadece distal bölge olarak görselleştirin.
  6. Ekstremitenin medial kısmında proksimal tibia seviyesinde #15 neşter bıçağı ile (neşter bıçağı saplı veya neştersiz) 3-4 mm'lik bir kesi oluşturun. Proksimal tibianın medial korteksini açığa çıkarmak için deri ve deri altı dokusundan kesin.
  7. Proksimal tibianın medial korteksinde küçük bir delik oluşturmak için ucu döndürürken 25 G'lik bir iğnenin ucuyla hafif bir basınç uygulayın. Bu deliği diz eklemine yaklaşık 2 mm distal olarak, kraniyal ve kaudal tibial korteksler arasında eşit uzaklıkta bir noktada yapın. Tümör fragmanlarının boyutuna bağlı olarak iğne boyutunu seçin.
  8. Tümör parçalarını almak ve proksimal tibianın medüller boşluğuna yerleştirmek için steril forseps kullanın. Tümör parçasını medüller kanala manipüle etmek için 27 ila 30 G'lik bir iğne kullanın. Tümör fragmanlarının boyutuna bağlı olarak, her bir tibia içine en az 0.5 mm3 toplam tümör hacmi implante edin. Bu, oluşturulan tümör fragmanlarının boyutuna bağlı olarak 1 veya daha fazla tümör fragmanının implantasyonunu gerektirebilir.
    NOT: Greftin kemik dışına çıkmasını önlemek veya sınırlamak için yapılan değişiklikler, kemik kusuruna kemik mumu veya kemik çimentosu veya jel köpük veya deri altı yağ greftinin kemikteki deliğin üzerine yerleştirilmesi olacaktır.
  9. Cilt kenarlarını steril sıvı doku yapıştırıcısı veya tek bir cilt sütürü ile yerleştirin. Bu sitede yara klipsleri kullanmayın. Ameliyat sonrası dönemde floresan görüntüleme kullanıyorsanız dikkatli olun, çünkü hem doku yapıştırıcıları hem de dikiş floresan potansiyeline sahiptir.
  10. Fareleri ambulatuvara kadar bireysel kafeslerde bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarın.

5. Seri ve bitiş noktası değerlendirmesi

  1. Daha önce tarif edildiği gibi oksijen anestezisinde izofluran kullanarak fareleri uyuşturun.
  2. Tibial tümör büyümesini haftalık dijital radyografi, biyolüminesans veya floresan görüntüleme ile invaziv olmayan bir şekilde değerlendirin (lusiferaz eksprese eden hücreler veya floresan muhabir geni kullanılıyorsa). İmplantasyon bölgesindeki uzuvun kaliper ölçümleri uyanık farelerde de yapılabilir.
  3. Tümör taşıyan farelerin geleneksel olarak izlenmesine ek olarak (vücut ağırlığı, aktivite seviyesi, solunum hızı, tımar, duruş, mentasyon ve davranış) fareleri arka ekstremite topallığı, şişlik ve cerrahi alan enfeksiyonu belirtileri açısından haftalık olarak izleyin.
  4. Cilt cerrahi yarasını ilk 10-14 gün boyunca aşırı kızarıklık, şişlik, drenaj ve yara ayrışması açısından cilt yarası iyileşene kadar izleyin. 4-5 hafta sonra, fareleri canlı veya ötenazi sonrası çalışma sonucu değerlendirmesine göre değerlendirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozitif bir sonuç, tümör engraftmanı ve zamanla ilerleyici tümör büyümesi ile ilişkili olacaktır. Tümör tipine bağlı olarak, intraosseöz tümör büyümesi ilerleyici arka ekstremite topallığı ile ilişkili olabilir, ancak birçok tümör eşlik eden kemik hastalığı belirtilerine rağmen topallığa neden olmaz. Başarılı engraftman, ileri görüntüleme ile belgelenmiştir, bu sayede ilgilenilen hücre hattının kemik fenotipiyle ilişkili proksimal tibiada progresif radyografik, μBT veya μMRG değişiklikleri olacaktır (osteolitik, osteobla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazı, bir tümör allogreftinin intratibial implantasyonunu takiben primer kemik tümörleri veya kemik metastazı oluşturma modelimizi belgelemektedir. Bu süreçte birkaç kritik adım olduğuna inanıyoruz. Hem tümör hücresi süspansiyonunun deri altına enjeksiyonu hem de ortaya çıkan tümör fragmanlarının intratibial yerleşimi için güvenli bir anestezi düzlemi oluşturulmalıdır. Hem subkutan allogreftin çıkarılması hem de allogreftin intratibial yerleştirilmesi için cerrahi bölgenin steril hazırlığı yapılmalıdır. Tümör allogref...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Hildreth, NIH tarafından K01OD026527 Ödül Numarası altında finanse edildi.  İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP'nin bu tekniğin geliştirilmesine kritik katkısını kabul etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
#15 neşter bıçağıHenry Schein Ltd.75614Yok
6 oyuklu doku kültürü plakalarıThermo Fisher Scientific10578911Tümör parçalarını kesmek için kullanılır. Hücre kültürü için de kullanılabilir
Abrams osteosarkom hücre hattıUygulanamaz UygulanamazYok
İzofluran buharlaştırıcı ve oksijen tank(lar)ı olan anestezi makinesiVetEquip901805Yok Hayvan
tartıKent ScientificSCL- 1015Yok
BALB/c çıplak fare (nu/nu)Charles River Ltd.NA6-8 haftalık. Erkek veya dişi fareler
Kemik çimentosuDepuy Synthes160504Kemik mumu yerine isteğe bağlı kullanım
Kemik mumuEthiconW31Gİsteğe bağlı
BuprenorfinAnimalcare Ltd.N/ABuprecare 0.3 mg/ml Köpekler ve Kediler için Enjeksiyon Çözeltisi
Karbondioksit ötenazi istasyonuN/AN/AHayvan tesisi içinde sağlanmalıdır
Hücre kültürü inkübatörü 37 °C'ye ayarlanmıştır; C ve %5 karbondioksitHeraeusÇeşitli
Yok Klorheksidin cerrahi önlükVetokinol411412Yok
Cryovials (2 ml)Thermo Scientific Nalgene5000-0020Tümör fragmanları kriyoprezervasyonlu ise isteğe bağlı
D-lusiferin (Ateşböceği), potasyum tuzuPerkin Elmer122799İlgilenilen hücre hattının biyolüminesan raportör geni varsa isteğe bağlı
Dijital kumpasMitutoyo500-181-30Manuel olabilir
Dijital mikroradyografi kabiniFaxitron Bioptics, LLCMX-20Tümör büyümesine kemik yanıtını değerlendirmek için isteğe bağlı
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma Aldrich1371171000Tümör parçalarını kriyoprezervasyonla rezerve ediyorsa isteğe
bağlı Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s ortaThermo Fisher Scientific11965092Yok Etanol
(% 70)Sigma Aldrich2483Yok
Fetal sığır serumuThermo Fisher Scientific26140079Yok
Forseps, DumontFine Science Tools, Inc.11200-33Yok
Dondurucu (– 80 ° C)SanyoMDF-794CTümör parçalarının dondurulması veya dondurulması durumunda isteğe bağlı
HemositometreThermo Fisher Scientific11704939Varsa otomatik hücre sayacı da kullanabilir
Hipodermik iğneler (27 gauge)Henry Schein Ltd.DIS55510Ayrıca 25G (DIS55509) ve 30G (Katalog DIS599) iğneleri de kullanabilir
BuzN/AN/AŞırınga ve hücre süspansiyonu depolaması için bir kapta ideal olarak küçük parçalar
İris makasıFine Science Tools, Inc.14084-08Hiçbiri
İzofluranHenry Schein Ltd.1182098Yok
IVIS Lumina III biyolüminesans/floresan görüntüleme sistemiPerkin ElmerCLS136334İlgilenilen hücre hattında biyolüminesan veya floresan raportör genleri varsa isteğe bağlı
L-glutaminThermofisher scientifc25030081Yok
Sıvı nitrojenBritish Oxygen CorporationNATümör parçalarının dondurulması veya dondurulması durumunda isteğe bağlı
Sıvı nitrojen dewar, 5 litreThermo Fisher ScientificTY509X1Tümör parçalarının dondurularak saklanması durumunda isteğe bağlı
Matrigel® Matris GFR, LDEV İçermeyen, 5 mlCorning Yaşam Bilimleri356230İsteğe bağlı. 10 ml'lik boyutta da mevcuttur (354230)
MikrosantrifüjThermo Fisher Scientific75002549Pelet hücreleri 1200 rpm'de 5-6 dakika
Frosty dondurucu muhafaza ediciFisher Scientific10110051Tümör parçalarının dondurularak saklanması durumunda isteğe bağlı
NAIR Saç çıkarıcı losyon/yağThermo Fisher ScientificNC0132811Alternatif olarak ince bıçaklı bir elektrikli kesme makinesi de kullanılabilir
Penisilin / streptomisinSigma-AldrichP4333Yok
Neşter sapı, # 7 KısaGüzel Bilim Araçları, Inc.10007-12Kabul ettiği sürece kullanıcı tercihi #15 neşter bıçağı
Küçük hayvan ısıtmalı pedVetTechHE006Yok
StereomikroskopGT Vision Ltd.H600BV1Yok
Steril fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023Enjeksiyonlar için ve ayrıca klorheksidin ile dönüşümlü olarak cerrahi fırçalamanın bir parçası olarak kullanın
Doku yapıştırıcısı (steril)3M Corporation84-1469SBAlternatif olarak emilemeyen cilt sütürü (6-0 boyut) kullanabilir
Tripan mavisiThermo Fisher Scientific5250061Yok
Tripsin-EDTAThermo Fisher Scientific25300054 Kullanım %0,05 - %0,25
Tüberkülin şırıngası (0,1 ml gradasyonlu 1 ml)Becton Dickinson309659Luer
Ventiled doku kültürü şişeleri, T-75Corning Yaşam BilimleriCLS3290edilir Gerektiğinde daha küçük veya daha büyük şişeler de kullanabilir
Bay yerine kayma ucu tercih

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  2. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
  3. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  4. Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
  5. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091(2019).
  6. James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
  7. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  8. Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
  9. Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
  10. Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230(2019).
  11. Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
  12. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).
  13. Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
  14. Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777(2016).
  15. Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
  16. Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185(2011).
  17. Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
  18. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  19. Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982(2016).
  20. Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981(2018).
  21. Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
  22. Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
  23. Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130(2019).
  24. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Primer Kemik T m rProksimal TibiaSubk tan T m rOsteoliz Akci er MetastazHasta Kaynakl XenograftTibial T m r B y mesiDijital Radyografi

İlgili makaleler