Yöntem makalesi

Tümöre Sızan Miyeloid Hücrelerin Flow Sitometri ve Adoptif Transfer ile Fonksiyonel Analizi

3.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61511

⸱

5 Mart 2021

 ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, murin, intradermal veya subkutan tümör modellerinde solid tümör ayrışması ve miyeloid hücre izolasyonu için güvenilir yöntemler sağlar. Akış sitometrisi, tümör mikroçevresi içindeki heterojen miyeloid popülasyonlarının fenotipik karakterizasyonuna izin verir ve sıralama, evlat edinen transfer bağlamında işlevselliklerini gösterecektir.

Özet

Tümöre sızan miyeloid hücre bölmesi, tümör tarafından büyümesini desteklemek için kullanılan geniş ölçüde immünosupresif hücrelerin heterojen bir popülasyonunu temsil eder. Tümör ve sekonder lenfoid dokuda birikmeleri, antitümör immün yanıtlarının baskılanmasına yol açar ve bu nedenle terapötik müdahale için bir hedeftir. Lokal sitokin ortamının tümöre sızan miyeloid hücrelerin fonksiyonel programlamasını belirleyebildiği bilindiğinden, antitümör miyeloid hücre aktivitesine daha elverişli bir sitokin manzarasını ifade etmek için tümör mikroçevresini (TME) manipüle etmek için stratejiler geliştirilmiştir. Tümöre sızan miyeloid hücrelerde tedaviye bağlı değişiklikleri değerlendirmek için bu makale, lökosit iyileşmesine hazırlık olarak intradermal/subkutan tümör dokusunu katı tümör taşıyan farelerden ayırma prosedürünü özetleyecektir. İzole edilmiş lökositler içindeki heterojen miyeloid popülasyonlarının tanımlanmasını ve benzersiz miyeloid fenotiplerinin karakterizasyonunu sağlamak için akış sitometrik analizi için stratejiler sağlanacaktır. Son olarak, bu makale, fonksiyonel tahliller için canlı miyeloid hücrelerin saflaştırılması ve evlat edinici transfer bağlamında terapötik değerlerinin belirlenmesi için bir yolu açıklayacaktır.

Giriş

Tümör mikroçevresi (TME), hızla çoğalan neoplastik hücrelerden ve çevreleyen heterojen bir stromal hücre kompartmanından oluşur. Büyüyen tümörler genellikle zayıf vaskülarize olduğundan, TME benzersiz bir şekilde hipoksi, besin yoksunluğu ve asidoz1 ile karakterize edilen periferik bir bölgedir. Bu manzarada hayatta kalabilmek için, tümör stres tepkileri ve metabolik yeniden programlama, doku yeniden şekillenmesini ve anjiyogenezi destekleyen çözünür faktörlerin salgılanmasının yanı sıra bağışıklık hücrelerinin seçici olarak toplanmasına neden olur2. Miyeloid hücreler, TME'de en bol bulunan hematopoietik hücre türlerinden biri olduğundan, TME'de tümöre sızan miyeloid hücrelerin rolünü incelemeye artan bir ilgi vardır.

Miyeloid hücreler, monositler, makrofajlar, dendritik hücreler ve granülositler dahil olmak üzere doğuştan gelen heterojen ve plastik bir bağışıklık hücreleri grubudur. Doku homeostazında ve adaptif immün yanıt regülasyonunda kritik rollere sahip olmalarına rağmen, işlevleri lokal mikroçevre içindeki aktivasyon sinyallerinin bileşimine bağlı olarak polarize olabilir3. Tümörler, TME içinde çözünür faktörlerin salgılanması yoluyla miyeloid hücre özelliklerinden yararlanır. Bu alternatif sinyaller, miyelopoezi olgunlaşmamış farklılaşmaya yönlendirebilir ve mevcut tümöre sızan miyeloid hücrelerin3 işlevini çarpıtabilir. Gerçekten de, TME içindeki miyeloid hücreler genellikle kanserin ilerlemesini teşvik eder ve antitümör bağışıklık tepkilerini baskılayarak kanser tedavisi üzerinde olumsuz etkilere yol açabilir.

İmmünsüpresif miyeloid hücrelerin tükenmesini teşvik eden terapötik stratejilerin tümör büyümesini geciktirdiği gösterilmiş olsa da4, hedef özgüllüğün olmaması, immünostimülatör miyeloid hücrelerin çıkarılması riskini taşır ve bu da kanserin çözülmesine yardımcı olur. Bu enflamatuar miyeloid hücreler, doğrudan tümör hücresinin öldürülmesi ve sitotoksik CD8 + T hücrelerinin aktivasyonu dahil olmak üzere derin antitümör etkiler gösterebilir5. Alternatif olarak, TME'deki miyeloid hücrelerin bileşimini ve işlevini normalleştiren stratejiler terapötik başarı göstermiştir6; Bununla birlikte, bir antitümör fenotipine yönelik yeniden eğitimlerinin altında yatan biyolojik mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Sonuç olarak, kanser tedavisinin daha da iyileştirilmesi için tümör miyeloid hücrelerinin kapsamlı bir karakterizasyonu gereklidir.

Ne yazık ki, miyeloid hücre izolasyonu için tümörlerin tekrarlanabilir ayrışması zordur. Tümör kaynaklı miyeloid hücreler, diğer lökosit alt kümelerine kıyasla ex vivo manipülasyona duyarlıdır ve tümör işlemenin agresifliği, enzimatik epitop bölünmesine ve geri kazanılan hücrelerin canlılığının azalmasına neden olabilir7. Bu yöntemin amacı, analiz için yüzey belirteç bütünlüğünü ve fonksiyonel çalışma için hücresel canlılığı korumak için güvenilir bir tümör ayrışması aracı sağlamaktır. Çeşitli hücresel alt kümelerin tekrarlanabilir salınımını arttırmak için daha sert enzimatik karışımları tercih eden tümör infiltre eden lökosit (TIL) izolasyon protokolleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem miyeloid hücre geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için daha konservatif enzimatik sindirimi destekler. Daha fazla karakterizasyon ve/veya sıralama için murin tümörü miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için üst düzey çok renkli akış geçit stratejileri de sağlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tüm hayvan çalışmaları, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerine uygundur ve McMaster Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Tümör hasadı ve ayrışması

  1. 6-8 haftalık, dişi, C57BL / 6 fareleri Nguyen ve ark.8 tarafından tarif edildiği gibi 2 × 105 B16 melanom hücreleri ile intradermal / subkutan olarak aşılayın.8 Hasattan önce 7 gün boyunca tümörlerin büyümesine izin verin.
  2. Fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın ve bunu yaparken tümörü bozmamaya dikkat edin. Hasattan önce fareye %70 etanol püskürtün.
  3. Bir neşter ve makas kullanarak, intradermal / subkutan tümörü çevreleyen dokudan (bağlı tümör boşaltan lenf düğümleri dahil) cerrahi olarak çıkarın ve tümörleri önceden tartılmış bir mikrofüj tüpüne yerleştirin. Buz üzerinde tutun.
    NOT: Tümör hasadını hayvan kullanımı için bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Daha büyük tümörler için 15 mL'lik konik bir tüp kullanın.
  4. Tümörleri tartın ve tümörleri tüp içinde veya 6 oyuklu bir plakada küçük parçalara ayırmak için makas kullanarak her tüpe% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile 500 μL RPMI-1640 ortamı ekleyin.
    NOT: Tümör parçaları, sindirim ortamı eklendikten sonra elektrikli bir pipetleyici tarafından karıştırılacak kadar küçük olmalıdır.
  5. RPMI-1640 ortamında% 10 FBS ve 5 mM kalsiyum klorür ile 0.5 mg / mL'de kollajenaz tip IV'ü ve 0.2 mg / mL'de DNazı çözerek ayrışma karışımını hazırlayın.
    NOT: Kollajenaz aktivitesini en üst düzeye çıkarmak için ayrışma karışımı taze olarak hazırlanmalıdır.
  6. Kıyılmış tümör süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 0.25 mg tümör başına 10 mL ayrışma karışımı ekleyin. Tüpü, 200 rpm çalkalama ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca sıcaklık kontrollü bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin. %10 FBS ve 2 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) içeren iki hacim soğuk RPMI-1640 ortamı ekleyerek kollajenaz aktivitesini nötralize edin ve 4 °C'de 10 dakika buzdolabında saklayın.
  7. Süspansiyonu kısaca girdaplayın ve 50 mL'lik bir konik tüp üzerinde 40 μm'lik bir süzgecin içine pipetleyin. Artık tümör dokusunu ayrıştırmak için bir şırınga pistonu ve nötralize edici ortam kullanın ve süzgeçten yıkayın. Süspansiyonu 5 dakika (500 × g, 4 °C) santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti %2 FBS ve 1 mM EDTA ile fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.

2. TIL zenginleştirme ve akış sitometrik boyama (FACS)

  1. Miyeloid hücre karakterizasyonu için TIL'leri zenginleştirmek için, üreticinin talimatlarına göre biyotinile CD45.2 antikorları ile biyotin pozitif seçim için tasarlanmış bir manyetik hücre ayırma kiti kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Hücreleri 200 μL FACS tamponunda (% 0.5 w / v sığır serum albümini (BSA) içeren PBS) yeniden süspanse edin ve bunları 96 oyuklu bir U-alt plakaya aktarın.
    NOT: 1 × 108 hücre / mL'lik bir boyama konsantrasyonunu aşmayın. Hacmi ayarlayın ve yüksek hücre sayılarını telafi etmek için numuneleri birden çok kuyuya bölün.
  3. Plakayı 5 dakika (500 × g, 4 °C) santrifüjleyin ve süpernatanı atın. FACS tamponunda 50 μL Fc blok çözeltisi (1:200 saflaştırılmış sıçan anti-fare CD16 / CD32 [ Malzeme Tablosuna bakınız] seyreltme, 2.5 μg / mL nihai konsantrasyon) ekleyin ve hücreleri pipetleme ile yeniden süspanse edin. 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
  4. 2x konsantrasyonda yüzey boyama antikoru (1:50 CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) ve sabitlenebilir canlılık boyası (FVS, 1:500 seyreltme) içeren 50 μL FACS tamponu ekleyin ve hücreleri pipetleme ile karıştırın. 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    NOT: Işığa maruz kalmayı en aza indirmek için plakayı alüminyum folyo ile örtün. Optimal seyreltmeyi ampirik olarak belirlemek için deneyden önce antikorlar titre edilmelidir.
  5. Her oyuğa 200 μL FACS tamponu ekleyerek, süspansiyonu santrifüjleyerek (5 dakika, 500 × g, 4 ° C) ve süpernatanı atarak hücreleri iki kez yıkayın.
  6. Her oyuğa 100 μL fiksasyon/geçirgenleştirme solüsyonu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, hücreleri pipetleyerek karıştırın ve 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
  7. Her kuyucuğa 100 μL 1x geçirgenleştirme tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, plakayı 5 dakika (500 × g, 4 °C) santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  8. Her oyuğa 200 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyerek, süspansiyonu santrifüjleyerek (5 dk, 500 × g, 4 °C) ve süpernatanı atarak hücreleri yıkayın.
    NOT: Deney, hücreleri geçirgenleştirme tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra gece boyunca duraklatılabilir. Numuneyi 4 °C'de ve ışıktan koruyarak saklayın. Santrifüjlemeden önce hücreleri kısa bir süre karıştırdıktan sonra devam edin.
  9. 1x konsantrasyonda hücre içi boyama antikoru (1:100 nitrik oksit sentaz 2 (NOS2), arginaz 1 (Arg1)) içeren 100 μL geçirgenlik tamponu ekleyin ve hücreleri pipetleme ile karıştırın. 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    NOT: Işığa maruz kalmayı en aza indirmek için plakayı alüminyum folyo ile örtün. Optimal seyreltmeyi ampirik olarak belirlemek için deneyden önce antikorlar titre edilmelidir.
  10. Her kuyucuğa 100 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin, plakayı 5 dakika (500 × g, 4 °C) santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  11. Her bir oyuğa 200 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyerek, süspansiyonu santrifüjleyerek (5 dk, 500 × g, 4 °C) ve süpernatanı atarak hücreleri yıkayın.
  12. Hücreleri 300 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi analizi yapmadan önce numuneyi 40 μm süzgeç kapaklı 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpten süzün.

3. Fonksiyonel çalışmalar için tümör miyeloid hücre sınıflandırması

  1. Akış sitometrisi analizi ile istenen miyeloid hücre popülasyonlarını belirledikten sonra, üreticinin talimatlarına göre CD11b- veya CD11c-pozitif seçimi için tasarlanmış bir manyetik hücre ayırma kiti ile sıralama için toplu miyeloid hücreleri önceden zenginleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. İstenen miyeloid hücre alt kümeleri için spesifik yüzey boyama antikorları (CD11b, Ly6C, Ly6G'nin 1:100 seyreltilmesi) kullanarak, önceden zenginleştirilmiş hücreleri adım 2.2-2.5'te tarif edildiği gibi boyayın.
    NOT: Canlı miyeloid hücrelerin sıralanmasını sağlamak için düzeltilebilir canlılık boyası ekleyin. 1 × 108 hücre / mL'lik bir boyama konsantrasyonunu aşmayın. Hacmi ayarlayın ve yüksek hücre sayılarını telafi etmek için numuneleri birden çok kuyuya bölün.
  3. Hücreleri soğuk ayırma tamponunda yeniden süspanse edin (% 1 w / v BSA, 25 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve 1 mM EDTA ile PBS). Numuneyi 40 μm süzgeç kapaklı 5 mL yuvarlak tabanlı polipropilen tüpten süzün. Hücreleri buz üzerinde tutun ve tüpü alüminyum folyo ile kaplayın.
    NOT: Hücrelerin/hacim konsantrasyonunu, sıralama için istenen cihaz özelliklerine göre ayarlayın.
  4. Yakalama ortamına sahip bir numune toplama tüpü hazırlayın (% 50 FBS'li PBS içeren 5 mL yuvarlak tabanlı polipropilen tüp).
    NOT: Sınıflandırmadan önce tüpleri gece boyunca 5 mL yakalama ortamı ile kaplayın. Numuneyi çalıştırmadan önce ertesi gün yakalama ortamının 1-2 mL hariç hepsini atın.
  5. Numune basıncını azaltmak ve damlacık oluşumunda bozulmaları önlemek için sıralayıcı cihaz ayarlarını değiştirin. 130 μm meme ucunu donatın ve 10 psi ayarını kullanın. Numuneyi, 100 rpm'de periyodik numune çalkalama ile düşük bir akış hızında çalıştırın ve damlacıkların birikmesinin tüpün merkezinde olduğundan emin olun. Sıralamadan sonra numuneyi buz üzerinde tutun.
  6. Numuneyi 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. Tüpü 5 dakika (500 × g, 4 °C) santrifüjleyin, süpernatanı atın ve fonksiyonel tahliller veya evlat edinme transferi için peleti istenen ortamda yeniden süspanse edin.

4. Saflaştırılmış tümör miyeloid hücrelerinin evlat edinici transferi

  1. 6-8 haftalık, dişi, C57BL / 6 fareleri, 30 μL PBS'de yeniden süspanse edilmiş 1 ×10 6 B16 melanom tümör hücresi ile intradermal olarak aşılayın.
    NOT: Fareleri, evlat edinme transferi sırasında tümör büyümesi 100 mm'yi3 aşmayacak şekilde önceden aşılayın.
  2. PBS'de sıralanan tümör miyeloid hücrelerini 25 mM HEPES ve 1 mM EDTA ile 2 × 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Numuneyi 40 μm süzgeç kapaklı 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpten süzün. Buz üzerinde tutun.
  3. % 3 izofluran ile anestezi altında fareleri indükleyin ve koruyun. Oküler kuruluğu / yaralanmayı önlemek için oftalmik merhem sürün.
  4. 50 μL hücre süspansiyonu ile 31 G'lik bir şırınga yükleyin. Şırıngayı hafifçe sallayarak hava kabarcıklarını çıkarın. Enjeksiyon bölgesini alkollü bir bez kullanarak temizleyin.
  5. Steril forseps kullanarak, tümörün tabanındaki cildi kaldırın. Tümöre cildin altından girmek için iğneyi deri altı boşluğuna hafif yukarı doğru bir açıyla sokun. İğneyi çevreleyen cildi sıkıştırmak için forsepsleri kullanın ve şırınga hacmini yavaşça dağıtın. İğneyi yavaşça çıkarırken cildi forseps ile sıkıştırmaya devam edin ve olası sızıntıyı temizlemek için pamuklu çubuk kullanın.
    NOT: İstenirse herhangi bir ek terapötik tedaviye devam edin.
  6. Farelerin anesteziden kurtulmasına izin verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sonuçlar, bu yöntemin katı murin tümörlerinden yüksek miktarda miyeloid hücre verimi ürettiğini göstermektedir. Reseptör bütünlüğünün ve hücresel canlılığın korunması, istenen miyeloid alt kümelerinin güvenilir fonksiyonel analizini kolaylaştırır. Miyeloid hücre izolasyonundaki bu gelişmeler, evlat edinen T hücre tedavisi sırasında TME'nin sınıf I histon deasetilaz inhibitörü (HDACi), MS-275 ile normalleşmesi üzerine intratümöral miyeloid hücrelerin değişen fonksiyonunun ayırt edilmesini sağlamıştır. TIL izolasyon protok...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tümöre sızan miyeloid hücreler, tümör içinde değişen aktivasyon ve farklılaşma durumlarında bulunmasına rağmen, tümörle ilişkili DC'ler (TADC'ler), tümörle ilişkili nötrofiller (TAN'lar), miyeloid türevli baskılayıcı hücreler (MDSC'ler) ve tümörle ilişkili makrofajlar (TAM'lar) dahil olmak üzere çeşitli alt kümeler tanımlanmıştır12. Ne yazık ki, bu miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için kullanılan hücre yüzeyi belirteçlerinin örtüşen ifadesi, tümör miyeloid...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ontario Hükümeti tarafından sağlanan fonların yanı sıra Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (FRN 123516 ve FRN 152954), Kanada Kanser Derneği (hibe 705143) ve Terry Fox Araştırma Enstitüsü (TFRI-1073) tarafından sağlanan fonlarla Ontario Kanser Araştırmaları Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 700 Fare Anti-Fare CD45.2BD Biyolojik Bilimler5606931:100
APC-CY7 Fare Anti-Fare NK-1.1BD Biosciences5606181:100
Biotin Fare Anti-Fare CD45.2BD Biyolojik Bilimler553771
BV421 Hamster Anti-Fare CD11cBD Biyolojik Bilimler5627821:100
BV650 Sıçan Anti-Fare F4/80BD Biosciences7432821:100
BV711 Sıçan Anti-Fare CD8aBD Biosciences5630461:100
Kollajenaz, Tip IV, tozGibco17104019
DNase IRoche10104159001
EasySep Fare CD11b Pozitif Seçim Kiti IIKök hücre teknolojileri18970
EasySep Fare CD11c Pozitif Seçim Kiti IIKök hücre teknolojileri18780
EasySep Release Mouse Biotin Pozitif Seçim KitiKök hücre teknolojileri17655
FITC Sıçan Anti-Fare Ly-6CBD Biosciences5531041:100
Sabitlenebilir Canlılık Lekesi 510BD Biosciences5644061:1000
Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözüm Kiti (BD Cytofix/Cytoperm)BD Biosciences
PE Sıçan Anti-CD11bBD Biyolojik Bilimler5573971:100
PE-CY7 Sıçan Anti-Fare CD4BD Biyolojik Bilimler5527751:100
PerCP-CY5.5 Sıçan Anti-Fare Ly-6GBD Biosciences5606021:100
Perma / Yıkama (BD Perma / Yıkama)BD Biosciences554723
Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16 / CD32 (Fare BD Fc Bloğu)BD Biosciences553141
iNOS Monoklonal Antikoru (CXNFT), APCThermo Fisher17-5920-821:100
İnsan/Fare Arginaz  1/ARG1 Floresein konjuge AntikorR& D SistemleriIC5868F1:100
554714

Kaynaklar

  1. Paardekooper, L. M., Vos, W., vanden Bogaart, G. Oxygen in the tumor microenvironment: effects on dendritic cell function. Oncotarget. 10 (8), 883-896 (2019).
  2. Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
  3. Jahchan, N. S., et al. Tuning the tumor myeloid microenvironment to fight cancer. Frontiers in Immunology. 10, 1611(2019).
  4. Srivastava, M. K., et al. Myeloid suppressor cell depletion augments antitumor activity in lung cancer. PLoS One. 7 (7), 40677(2012).
  5. Awad, R. M., De Vlaeminck, Y., Maebe, J., Goyvaerts, C., Breckpot, K. Turn back the TIMe: targeting tumor infiltrating myeloid cells to revert cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 1977(2018).
  6. Strauss, L., et al. Targeted deletion of PD-1 in myeloid cells induces antitumor immunity. Science Immunology. 5 (43), 1863(2020).
  7. Cassetta, L., et al. Deciphering myeloid-derived suppressor cells: isolation and markers in humans, mice and non-human primates. Cancer Immunology, Immunotherapy. 68 (4), 687-697 (2019).
  8. Nguyen, A., et al. HDACi delivery reprograms tumor-infiltrating myeloid cells to eliminate antigen-loss variants. Cell Reports. 24 (3), 642-654 (2018).
  9. Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors. Journal of Visual Experiments: JoVE. (136), e57685(2018).
  10. Engfeldt, P., Arner, P., Ostman, J. Nature of the inhibitory effect of collagenase on phosphodiesterase activity. Journal of Lipid Research. 26 (8), 977-981 (1985).
  11. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visual Experiments: JoVE. (44), e2259(2010).
  12. Schupp, J., et al. Targeting myeloid cells in the tumor sustaining microenvironment. Cellular Immunology. 343, 103713(2019).
  13. Gabrilovich, D. I., Ostrand-Rosenberg, S., Bronte, V. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nature Reviews Immunology. 12 (4), 253-268 (2012).
  14. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  15. Roussel, M., et al. Mass cytometry deep phenotyping of human mononuclear phagocytes and myeloid-derived suppressor cells from human blood and bone marrow. Journal of Leukocyte Biology. 102 (2), 437-447 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ak Sitometrisi AnaliziAdoptif Transfer Prosed rL kosit Geri Kazan mMiyeloid Fenotip KarakterizasyonuT m r Mikro evresi Manip lasyonuSitokin Ortam EtkileriSolid T m r DisosyasyonuCanl Miyeloid H cre PurifikasyonuFonksiyonel Analiz De erlendirmesi
Video yakında

İlgili makaleler