Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

12.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61542

⸱

25 Ağustos 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurology Clinic and National Center for Tumor Diseases, University Hospital Heidelberg, 2Bioinformatics and Omics Data Analytics, German Cancer Research Center (DKFZ), 3Clinical Cooperation Unit Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), 4Division of Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University of Heidelberg, INF 400, Heidelberg, Germany

Bu makalede

Özet

Tümör içi heterojenlik gliomalar da dahil olmak üzere tümörlerin doğal bir özelliğidir. Tek çekirdek RNA ve ATAC dizileme çalışmaları için tek çekirdekleri taze donmuş glioma dokularından izole etmek için tamponlar ve gradyan santrifüjleme kombinasyonunu kullanan basit ve verimli bir protokol geliştirdik.

Özet

Erişkin dağınık gliomalar tümörler arası ve tümör içi heterojenlik sergiler. Yakın zamana kadar, büyük ölçekli moleküler profilleme çabalarının çoğu, beyin tümörlerinin moleküler sınıflandırılmasına yol açan toplu yaklaşımlara odaklanmıştır. Son beş yılda, tek hücreli dizileme yaklaşımları gliomaların birkaç önemli özelliğine vurgu yaptı. Bu çalışmaların çoğunluğu, akış sitometrisi veya antikor bazlı ayırma yöntemlerini kullanarak tek hücreleri izole etmek için taze beyin tümörü örneklerinden yararlanmıştır. İleride, biyobankalardan taze dondurulmuş doku örneklerinin kullanılması tek hücre uygulamalarına daha fazla esneklik sağlayacaktır. Ayrıca, tek hücreli alan ilerledikçe, bir sonraki zorluk tümör karmaşıklığını daha iyi çözmek için tek bir hücreden veya aynı örnek hazırlığından çoklu omik verileri oluşturmak olacaktır. Bu nedenle, tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) ve transposase-Accessible Chromatin için tek çekirdekli Tahlis gibi çeşitli yöntemler için veri üretimine izin veren basit ve esnek protokoller alan için önemli olacaktır.

10x genomik platformu gibi erişilebilir mikroakışkan aletlerle birleştiğinde tek hücre alanındaki son gelişmeler, araştırma laboratuvarlarında tek hücre uygulamalarını kolaylaştırmaktadır. Beyin tümörü heterojenliğini incelemek için, tek çekirdeğin taze donmuş gliomalardan izolesi için geliştirilmiş bir protokol geliştirdik. Bu protokol varolan tek hücre protokollerini birleştirir ve bir homojenleştirme adımini ve ardından filtrasyon ve arabellek aracılı gradyan santrifüjünü birleştirir. Elde edilen örnekler, aynı çekirdek preparatından tek çekirdek gen ekspresykülü ve kromatin erişilebilirlik verileri oluşturmak için kullanılabilecek saf tek çekirdek süspansiyonlarıdır.

Giriş

Yetişkinlerde en sık görülen primer beyin tümörü olan dağınık alt derece gliomalar (LGG), sıklıkla serebral yarımkürede ortaya çıkan infiltratif neoplazmlardır. LGG'ler sadece tümör popülasyonu tarafından değil, aynı zamanda tümör gelişimi ve ilerlemesinde karmaşık bir şekilde yer alan kötü huylu olmayan hücreler tarafından da yönlendirilen tümör içi heterojenliği hem inter-hem de intra-tümör heterojenliği sergiler 1,2,3,4,5.

Son on yılda gliomalar alanında toplanan bir dizi genomik veri vardır. Bu veriler esas olarak toplu tümör dizileme çalışmalarından gelir ve moleküler karakterizasyona ve beyin tümörlerinin mevcut sınıflandırılmasına son derece katkıda bulunmuştur5,6, 7,8,9,10,11. Bununla birlikte, bu çalışmalar gliomalarla ilişkili geniş moleküler manzarayı ortaya ortaya sürse de, terapötik müdahale konusunda hala hayal kırıklığı yaratan bir ilerleme eksikliği vardır. Beyin tümörlerinde tedavi direncinin önündeki engellerden biri de tümör içi heterojenliktir. Bu sorunu çözmek için, çeşitli çalışmalar tek hücreli düzeyde bir tümörde bulunan genomik, transkriptomik, proteomik ve epigenetik heterojeniteye odaklanmıştır12,13 ,14,15,16,17.

Son birkaç yıldır tek hücre alanında dikkat çekici teknolojik gelişmeler olmasına rağmen, en önemli sınırlayıcı faktörlerden biri, hücreleri izole etmek ve bu deneyleri gerçekleştirmek için gereken taze örneklerin mevcudiyetidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için,18 , 19hücreleri yerine çekirdek kullanarak donmuş dokulardan snRNA-seq ve snATAC-seq gibi tahliller yapmak için birkaç başarılı girişimolmuştur. Bu yöntemlerin çoğu floresan ile etkinleştirilen hücre sıralama (FACS) veya filtrasyon stratejilerine dayanır. Hem tek hücreli hem de tek çekirdekli yaklaşımların güçlü ve dezavantajları vardır. Tek hücreli yaklaşımlar mitokondriyal transkriptleri korur, bu da bilgilendirici olsa da, yüksek bollukları nedeniyle transkriptome kapsamını azaltabilir. Tek çekirdek izolasyon yaklaşımları mitokondriyal fraksiyonun yüksek bir yüzdesini ortadan kaldırır, böylece nükleer transkriptlerin daha derinlemesine kapsanmasına izin verir20.

RNA-seq ve ATAC-seq dahil olmak üzere tek hücreli genomik verileri test etmek için son yıllarda kullanılan çeşitli ticari platformlar vardır. En belirgin platformlardan biri, tek hücreli gen ekspresyumu ve tek hücreli ATAC profilleme için 10x Genomik Krom platformudur. Platform mikroakışkan odaların yardımıyla çalıştığından, herhangi bir döküntü veya agrega sistemi tıkayabilir ve bu da veri, reaktif ve değerli klinik örneklerin kaybına yol açabilir. Bu nedenle, tek hücreli çalışmaların başarısı büyük ölçüde tek hücrelerin/ çekirdeklerin doğru izolasyonuna bağlıdır.

Burada göstereceğimiz protokol, DroNc-seq ve Omni-ATAC-seq protokollerinin biraz değiştirilmiş bir kombinasyonudur ve insan beynindeki nörolojik bozuklukları ve nöronal hücre tiplerini anlamak için snRNA-seq kullanan son çalışmalara benzer bir yaklaşım kullanır18,19,21,22,23,24. Protokol, donmuş numunelerin enzipmatik/mekanik ayrışmasının ve ardından filtrasyon ve gradyan santrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanır ve tek çekirdeğin taze dondurulmuş glioma dokularından hızlı ve doğru bir şekilde izole edilmesini sağlar. Bu protokolü, beyin tümörü örneklerinden aynı çekirdek hazırlığından snRNA-seq ve snATAC-seq verileri oluşturmak için başarıyla kullandık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Almanya'nın Heidelberg kentindeki Ulusal Tümör Hastalıkları Merkezi (NCT)- doku bankasından taze dondurulmuş glioma örnekleri alındı. Hasta materyalinin kullanımı Heidelberg Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı ve çalışmaya dahil edilen tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Deneysel hazırlık

  1. Tüm adımları buz üzerinde veya 4 °C'de gerçekleştirin.
  2. 4 °C'ye kadar soğuk öncesi tüpler, bulaşıklar, jiletler, Douncers ve pestles.
  3. Tüm arabellekleri önceden hazırlayın. Bu tamponlar oda sıcaklığında stabildir. Steril filtrasyon, özellikle sakkaroz için önerilir. Stok hazırlıkları Corces ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bkz. Tablolar 1-7.
  4. Sıvı nitrojen veya -80 °C dondurucu deposundan numuneleri çıkarın ve Adım 2.1'e kadar kuru buzda tutun.

2. Doku diseksiyonu ve ayrışması

  1. Taze dondurulmuş doku örneğini (10-60 mg) önceden soğutulmuş bir Petri kabına aktarın. Taze donmuş dokuyu jiletle buz üzerinde küçük parçalara ayırın/doğrayın.
  2. Önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe 500 μL soğutulmuş çekirdek liziz tamponu ekleyin. Doku parçalarını çekirdek liziz tamponu içeren 1,5 mL tüpe yerleştirin ve bir Douncer'a(Malzeme Masası) aktarın.
    NOT: İki Dounce homojenizatör pestlesi vardır: ilk numune azaltma için "gevşek" veya "A" pestle ve tam numune homojenizasyonu için "sıkı" veya "B" pestle.
  3. Sürtünme azaltılana kadar doku parçalarını yaklaşık 20 vuruş boyunca "gevşek" pestle ile yapın. Döküntü varsa, numune 100 mm'lik bir süzgeçle filtrasyon ile önceden temizlenebilir.
  4. Tam doku homojenizasyonu elde etmek için 20 inme için "sıkı" pestle ile yapın.
  5. Homojenatı (yaklaşık 500 μL) önceden soğutulmuş 2 mL'lik bir tüpe aktarın. 1 mL soğutulmuş lizis tamponu ekleyin. Hafifçe karıştırın ve 5 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Geniş delikli pipet ucu ile hafifçe karıştırın ve kuluçka sırasında 1-2 kez tekrarlayın.
  6. 30 μm süzgeç ağı kullanarak tüm homojenatı filtreleyin, 15 mL Falcon tüpüne toplayın ve önceden soğutulmuş yeni bir 2 mL tüpe geri aktarın. Tek bir süzgeç tipik olarak tüm homojenat için yeterlidir.
  7. Büyük kalıntıların giderilmesini ve nükleer zarın sağlamlığını doğrulamak için hafif bir mikroskop altında kontrol edin. Çekirdeklerin yuvarlak olması ve nükleer zarın bozulmaması gerekir. Enkaz varsa, çekirdekler yeniden filtrelenebilir.
  8. Çekirdekleri 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüj üzerinde santrifüj. Çekirdeği içeren pelet ile ~50 μL geride bırakarak süpernatant çıkarın. Peleti 1 mL'lik başka bir çekirdek liziz tamponunda hafifçe yeniden dürt ve buzda 5 dakika kuluçkaya yatır.
  9. Çekirdeği 500 x g'da 4°C'de 5 dakika santrifüj edin. Peletin rahatsız etmeden süpernatantını çıkarın, 500 mL 1x homojenizasyon tamponu (HB)(Tablo 4)ekleyin ve yeniden canlandırmadan 5 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, çekirdeği 1x HB'nin 1,0 mL'lik başka bir yerine yeniden kullanın.
  10. Çekirdeği 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. Süpernatant çıkarın ve çekirdeği 200 μL 1x HB'de yeni bir 2.0 mL tüpe hafifçe yeniden kullanın.

3. Degrade santrifüjleme

  1. % 25 iyodixanol son konsantrasyon vermek için 200 μL%50iyodixanol çözeltisi ( Tablo 5 ) ekleyin. 300 mL'ye ayarlanmış pipetle 10 kez iyice karıştırın.
  2. % 25 karışımın altına 300 μL% 29 iyodiksanol çözeltisi (Tablo 6) ekleyin. Katmanların karışımını önlemek için P1000 ince uç kullanın.
  3. % 29 karışımın altına 300 μl% 35 Iyoksisanol çözeltisi (Tablo 7) ekleyin. Katmanların karışımını önlemek için P1000 ince uç kullanın.
    Dikkat: Bu adım, aşırı hacimli yer değiştirmeyi önlemek için pipet ucunun pipet ucunun pipet ucunun kademeli olarak kaldırılmasını gerektirir.
  4. Numuneleri sallanan bir kova santrifüjüne yerleştirin, fren kapalıyken 4 °C'de 3.500 x g'da 20 dakika döndürün.
  5. Numuneleri sallamadan hafifçe çıkarın ve ışık altında gözlemleyin. İkinci ve üçüncü katman arasında % 95 saf çekirdekten oluşan net bir beyaz bant görünmelidir (Şekil 1).

4. Çekirdeklerin izolasyonu

  1. %29-%35 ara fazda beyaz çekirdek bandına kadar üst katmanları aspire edin.
  2. Çekirdek bandını 200 mL hacimde toplayın, taze bir tüpe aktarın ve 20 μm filtreli filtre(Malzeme Masası).
    NOT: Çekirdeğin filtrasyondan önce yeniden dürtülmesi gerekmez.
  3. Büyük kalıntıların giderilmesini ve nükleer zarın sağlamlığını doğrulamak için hafif bir mikroskop altında kontrol edin. Çekirdeklerin yuvarlak olması ve nükleer zarın bozulmaması gerekir.
  4. Bir hemositometrede Trypan mavi boyama ve snRNA-seq / snATAC-seq için aliquot çekirdekleri kullanarak çekirdekleri sayın.

5. Tek çekirdek RNA ve ATAC seq

  1. Çekirdekleri tek hücre gen ekspresyon ve tek hücreli ATAC reaktif kitlerini ( Malzeme Tablosu ) kullanarak hemenişleyin.
    NOT: 10x Genomik sistemi için çekirdek örnek konsantrasyonları snRNA-seq için μL başına 1500-3000 çekirdek ve snATAC-seq için m μL başına 3500-7000 çekirdektir. Çekirdek 1x PBS kullanılarak seyreltilebilir.
  2. Genomik Çekirdek Tesisi'nde elde eden kitaplıkları sıralayın.
  3. Verilerin kalite kontrol analizini gerçekleştirin. Çekirdekler, Benzersiz Moleküler Tanımlayıcı (UMI) >1000, gen sayısı >500 ve mitokondriyal genlerin yüzde <5'i içeriyorsa ve ÜM'lerin ve genlerin ortalama + üç standart sapması içindeyse daha fazla analiz için dahil edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tek çekirdek genomik sınırlı veri ve protokollere sahip gelişen bir alandır. Tek çekirdek tahlillerinin sonucunu etkileyen kritik bir faktör saf ve sağlam çekirdeklerin izolasyonudur. Yayınlanan iki protokolü (DroNc-seq ve Omni-ATAC-seq protokolleri) birleştirerek taze donmuş glioma doku bloklarından yüksek kaliteli ve saf çekirdekleri nispeten kısa sürede izole ettik ve böylece transkriptlerin stabilitesini koruduk (Şekil 1).

İyodixanol/sakkaroz gradyanı kullanıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tümör içi heterojenlik alanı heyecan verici bir aşamadadır ve mevcut bilgiye meydan okumak ve genişletmek için yeni tahliller ve platformlar geliştirilmektedir. Tümör içi heterojenlik gliomalarda hastalığın ilerlemesine ve mevcut tedavi yöntemlerine direnç gösteren önemli bir faktördür28. Beyin tümörleri üzerinde yapılan son çalışmalar, aynı tümör içindeki hücresel heterojenliği daha iyi karakterize etmek için tek hücreli transkriptomik ve epigenomik tahliller kullanarak bu önemli hususa odaklanmı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Alman Kanser Merkezi'ndeki (DKFZ) Tek Hücreli Açık Laboratuvar'a (scOpenLab) yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu araştırma Alman Kanser Yardımı, Max-Eder Programı hibe numarası 70111964 (S.T.) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-MerkaptoetanolSigmaM6250
CaCl2Sigma21115-100ML
Dounce HomojenizatörAktif motif40401
EDTA (0.5 M)Thermo ScientificR1021
Falcon 15 mL Konik Santrifüj TüpleriFisher Scientific352096
İodiksanol (aka Optiprep)Kök hücre teknolojileri07820
MACs Akıllı Süzgeçler (30 & mikro; m)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS Akıllı Süzgeçler (100 & mikro; m)Miltenyi Biotec130-098-463
Mg (Ac) < sub>2< / sub>Sigma63052-100ML
NP-40Abcamab142227
Çekirdek İzolasyon Kiti: Nuclei EZ PrepSigmaNUC101-1KT
Fenilmetansülfonil florür (PMSF)SigmaP7626
Ön Ayırma Filtreleri (20 & mikro; m)Miltenyi Biotec130-101-812
Güvenli kilit tüpleri 1.5 mLEppendorf0030120086
Güvenli kilit tüpleri 2.0 mLEppendorf0030120094
Tek Hücreli ATAC10x Genomik Tek Hücreli
Gen Ekspresyonu10x Genomik
SükrozSigmaS0389
Geniş Delikli pipet uçları (1000 & mikro; L)Themo Fisher Scientific2079GPK
Geniş Delikli pipet uçları (200 & mikro; L)Themo Fisher Bilimsel2069GPK

Kaynaklar

  1. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
  2. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  3. Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
  4. Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
  5. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  6. Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
  7. Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
  8. Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
  9. Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
  10. Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
  11. Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).
  12. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
  13. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  14. Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
  15. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  16. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  17. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  18. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
  21. Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
  22. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  23. Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).
  24. Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
  26. Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
  27. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  28. Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
  29. Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
  30. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  31. Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
  32. Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
  33. Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Taze Dondurulmuş DokuTek Çekirdek ATAC-seqGradyan SantrifügasyonIodixanol SolüsyonuÇekirdek Lizis TamponuFiltrasyon BasamaklarıHemositometre SayımıTrypan Blue Boyama
Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.