Yöntem makalesi

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

DOI:

10.3791/61651

⸱

10 Eylül 2020

 , 
1Department of Entomology, The Ohio State University, 2Insect Transformation Facility, Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas9, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonunu karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, enjeksiyon karışımlarının hazırlanmasından sivrisinek embriyolarının elde ve enjektesine kadar Culex pipiens'innakavt hatlarının nasıl oluşturulacağını ve enjekte edilen sivrisineklerin ve bunların istenen mutasyonlar için soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Culex sivrisinekleri, Batı Nil virüsü ve köpek kalp kurdu ve elephantasis gibi filarial nematodların neden olduğu hastalıklar da dahil olmak üzere insan ve hayvan sağlığını olumsuz etkileyen çeşitli hastalıkların başlıca vektörleridir. Son zamanlarda, CRISPR / Cas9 genom düzenleme, bir rehber RNA (gRNA) ile karmaşık hale gelen bir Cas9 proteinini, Anopheles ve Aedes cinslerine ait sivrisinekler de dahil olmak üzere çeşitli böcek türlerinin taze döşenmiş embriyolarına enjekte ederek bölgeye yönelik mutasyonları teşvik etmek için kullanılmıştır. Culex sivrisineklerini manipüle etmek ve enjekte etmek biraz daha zordur, çünkü bu sivrisinekler yumurtalarını diğer sivrisinek türleri gibi ayrı ayrı değil, sallara dik bir şekilde bırakırlar. Burada gRNA'ların nasıl tasarlanacağı, Cas9 proteini ile nasıl karmaşıklaşacağı, Culex pipiens'in dişi sivrisineklerinin yumurta bırakmaya nasıl teşvik edeceği ve cas9/gRNA ile mikroenjeksiyon için yeni döşenen embriyoların nasıl hazırlanacağı ve enjekte edeceği anlatılacağı açıklanmaktadır. Ayrıca, istenen mutasyon için enjekte edilen sivrisineklerin nasıl arka ve taramadan geçirildiği de açıklanmaktadır. Temsili sonuçlar, bu tekniğin Culex sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik mutasyonları teşvik etmek için kullanılabileceğini ve hafif değişikliklerle diğer sivrisinek türlerinde de boş mutantlar oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Culex sivrisinekleri dünyanın ılıman ve tropikal bölgelerine dağılmıştır ve Batı Nil virüsü1, St. Louis ensefaliti2 ve köpek kalp kurdu3 ve elephantiasis4'eneden olan filarial nematodlar da dahil olmak üzere birkaç ölümcül virüs iletir. Cx. quinquefasciatus , Cx. pipiens pipiensve Cx. pipiens molestus içeren Culex pipienskompleksinin üyeleri, biyolojilerinin birçok alanında çarpıcı varyasyonlar göstermektedir. Örneğin, Cx. quinquefasciatus ve Cx. pipiens molestus kışlayan bir dormancy 5,6, Cx. pipiens pipiens girmek için yetersiz iken sağlam mevsimsel tepkiler gösterir ve kısa günlere yanıt olarak diapause girer7,8. Ek olarak, Cx. pipiens molestus daha antropofilik olma eğilimindedir, Cx. pipiens ve Cx. quinquefasciatus ise daha zoofilik6. Bununla birlikte, Amerika Birleşik Devletleri'nde ve dünyadaki diğer birçok yerde, Cx. pipiens pipiens ve Cx. pipiens molestus'un melezleri fırsatçı besleyiciler olduğu ve hem kuşları hem de insanları ısıracağı için hastalık bulaşmasında güçlü etkileri olan bu türler iç içe geçmiştir9, böylece Batı Nil virüsü için köprü vektörleri olarak hizmet eder. Culex sivrisineklerinin biyolojisinin bu ve diğer büyüleyici yönlerini incelemek kısmen engellenmiştir, çünkü Culex sivrisineklerinin laboratuvarda geri yetiştirilmeleri, sessiz ve kuruluğa dayanıklı yumurta10 üreten Aedes sivrisineklerinden biraz daha zordur ve fonksiyonel moleküler araçlar Culex türleri için iyi gelişmemiştir.

CRISPR / Cas9 genom düzenleme, Güney evi sivrisinek, Culex quinquefasciatus14,15,16dahil olmak üzere birkaç önemli sivrisinek türünün biyolojisini değerlendirmek için kullanılan güçlü bir teknolojidir. Jennifer Doudna ve Emmanuelle Charpentier tarafından geliştirilen bu teknoloji, bakteriyel olarak türetilmiş, CRISPR ile ilişkili endonülonikleazlar tarafından virüslere karşı doğal bir bakteriyel savunmadan yararlanır (Cas proteinleri; Van der Oost ve ark.17tarafından incelenmiştir). Hayvan embriyolarına enjekte edildiğinde, Cas9 proteinleri uygun bir kılavuz RNA ile birlikte genom içinde çift iplikli kırılmalar üretebilir. Bu en sık, endononekleaz aktivitesini genomun belirli bir bölgesine yönlendiren kılavuz RNA'larla karmaşık cas9 proteini kullanılarak yapılır. Cas9 proteini bölgeye özgü çift iplikli bir kırılma yarattıktan sonra, hücresel makine iki mekanizmadan birini kullanarak kırılmayı onarmaya çalışır. birincisi, iki ucun homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) yoluyla birbirine bağlanmasını gerektirir, bu da hataya eğilimlidir ve genomda genellikle işlev dışı proteinlerle sonuçlanabilen çerçeve dışı eklemeler ve silmeler üretir, böylece bir nakavt mutasyonu oluşturur. Alternatif olarak, hücresel makineler, molayı doğru bir şekilde onarmak için benzer diziler bularak homolojiye yönelik onarım (HDR) kullanabilir. Benzer dizi organizma içindeki ikinci kromozom tarafından sağlanabilir (bkz. gözden geçirme18). Bununla birlikte, onarılmış dizi orijinal diziyle tam olarak eşleşirse, Cas9 proteini DNA'yı tekrar kesebilecektir. Alternatif olarak, araştırmacılar, hedef dizinin kesim bölgesinin her iki tarafında homolog diziler içeren bir donör plazmidi de içerebilir ve alternatif bir onarım dizisi (genellikle floresan bir işaret proteini, orijinal genin değiştirilmiş versiyonu veya başka bir değişiklik) kopyalanıp genoma eklenebilir veya "girilebilen".

Embriyo enjekte ederken zamanlama kritiktir ve bu özellikle böceklerde mutasyon oluşturmak için CRISPR / Cas9 genom düzenlemesini kullanırken durumdur. Bunun nedeni, Cas9 proteini ve gRNA'ların sadece embriyo senksiyal durumundayken, hücresel zarlar oluşmadan önce ve embriyo içinde birden fazla çekirdeğe erişilmeden önce mutasyon üretme kapasitesine sahip olmasıdır. Sivrisinekler için, çekirdekler, sıcaklık 19'a bağlı olarak yumurtlamadan yaklaşık2-4saat sonra çevreye ulaşır ve bu nedenle bu süreden önce başarılı mikroenjeksiyon gerçekleşmelidir. Ek olarak, Cas9 proteini erişebileceği herhangi bir nükleer DNA'yı kesecektir, böylece enjeksiyondan kaynaklanan birey, bazıları istenen mutasyona sahip, diğerleri ise olmayan bir hücre mozaiği içerecektir. Bu mutasyonların başarıyla kalıtsal olabilmesi için Cas9 proteininin mikrop hattında bulunan ve gelecekteki yumurta ve sperme yol açacak DNA'yı kesmesi gerekir. Mutasyonların mikrop hattında üretilmesini sağlamak için, böcek germline'ın ataları olan embriyo içindeki kutup hücrelerinin bulunduğu yere yakın tüm malzemeleri enjekte etmek en iyisidir. Kutup hücreleri Culex embriyolarının arka ucuna yakın bulunur20. Embriyo enjekte etmenin yanı sıra, istenen mutasyonu tespit etmek için yavruları geçmek ve taramak için dikkatli bir plan geliştirmek zorunludur.

Bu protokol, enjeksiyon karışımlarını hazırlamak için gRNA'ların nasıl üretilip Cas9 proteini ile nasıl karmaşıklaştırılacağını, ayrıca Culex pipiens'in dişi sivrisineklerinin yumurta bırakmaya nasıl teşviklanacağını ve crispr/ Cas9 aracılı genom düzenlemesi için bu yumurtaların nasıl hazırlanacağını ve enjektelanacağını açıklar. Ek olarak, istenen mutasyonun elde edildiğini doğrulamak için enjekte edilen embriyoların ve soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, bir ilgi geni için boş mutasyonlar ürettik, döngü, Culex pipiensBuckeye suşunda . Bu suş ilk olarak 2013 yılında Columbus, Ohio'da tarlada toplanan sivrisineklerden kuruldu ve Meuti laboratuvarı tarafından korunuyor. Bu protokol, Culex sivrisineklerinin yanı sıra diğer sivrisinek türlerinde CRISPR / Cas9 genom düzenlemesini gerektiren ek çalışmalar için kullanılabilir ve daha genel olarak, crispr / cas9 genom düzenlemesini herhangi bir böcek türüne sağlamakla ilgilidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu araştırma kurumunda, genetiği değiştirilmiş organizmaların laboratuvar tesisinden kaçmamasını veya çıkarılmamasını sağlamak için transgenik böcekler üretilmeden veya korunmadan önce onaylanmış bir Biyogüvenlik Protokolü uygulanmalıdır. Ek hükümet düzenlemeleri de geçerli olabilir. Bu nitelikte bir projeye başlamadan önce, hangi belge ve onayların gerekli olduğunu belirlemek için tüm kurumsal politika ve prosedürleri kontrol edin.

1. GRNA'ların tasarlanması ve enjeksiyon karışımlarının hazırlanması

  1. Bazı gRNA'lar diğerlerinden daha iyi çalıştığından, her hedef gen için 2-5 gRNA tasarlayin. ilgi çekici bir geni hedefleyen gRNA'lar manuel olarak tasarlanabilir veya Chop-Chop gibi ücretsiz programlar kullanılabilir.
  2. Her gRNA etrafında 100-200 bp parça yükseltecek astarlar tasarlayın ve sipariş edin. İdeal olarak, kesim bölgesi PCR ürününün yaklaşık üçte biri ila yarısında bulunmalıdır. Kesimin her yerinde kaç bp üretileceğini unutmayın.
  3. gRNA'ları edinin.
    1. Entegre DNA Teknolojileri, Fisher Scientific, Genescript ve diğerleri gibi ticari şirketlerden gRNA satın alın. Bu en kolay seçenektir.
    2. Alternatif olarak, sonraki izotermal sentez şablonları oluşturmak için PCR amplifikasyon kullanarak laboratuvarda gRNA'lar oluşturun. Port ve ark.21 ve Kistler ve ark.22tarafından açıklanan protokole bakın.
    3. Embriyolara enjekte edilen plazmid yoluyla gRNA'lar sağlayın. Bu durumda, gRNA U6 promotörü tarafından yönlendirilmelidir (ayrıntılar için bkz. 23,24).
  4. Cas9 proteinini elde edin.
    1. Cas9'a Fisher Scientific de dahil olmak üzere çeşitli şirketlerden ticari olarak sipariş verin. Bu en kolay seçenektir.
    2. Cas9 proteini yapın ve Basu ve ark.25 ve Kistler ve ark.22'yegöre laboratuvarda saflaştırın.
    3. Cas9 mRNA'yı embriyolara enjekte edin, burada daha sonra aktif Cas9 proteinine çevrilecektir. CAS9 mRNA, in vitro transkripsiyon22 kullanılarak laboratuvarda sentezlenebilir veya Sigma gibi satıcılardan satın alınabilir.
      NOT: Çevrilen Cas9 proteini C-terminus üzerinde bir nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) içermelidir ve bu nedenle NLS enjekte edilen Cas9 mRNA'da da bulunmalıdır.
    4. Plazmid bazlı ekspresyon ile Cas9 protein in vivo ekspres. Bu durumda, hedef türlerde iyi karakterize edilmiş embriyonik bir promotör tarafından yönlendirilen plazmid üzerinde Cas9 ifadesinin olması en iyisidir.
      NOT: Bugüne kadar, embriyonik promotörler Culex sivrisineklerinde iyi karakterize olmamıştır ve bu nedenle saflaştırılmış protein veya Cas9 mRNA enjekte etmesi önerilir.
  5. GRNA'ları, Kistler ve ark.22'denuyarlanan Cas9 proteini ile karmaşık halen.
    1. Cas9 proteinini gRNA ile birlikte enjekte ediyorsanız (önerilir), Cas9 proteininin son konsantrasyonlarının 300 ng/μL ve tek bir gRNA'nın son konsantrasyonunun 80 μg/μL olduğundan emin olun.
    2. Buzda 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
  6. GRNA'ların in vitro test ile test edilmesi (örneğin, Guide-it sgRNA Tarama Kiti).
    1. PCR kullanarak her gRNA için kesim bölgesinin etrafındaki parçaları güçlendirin.
    2. PCR ürünlerini doğru boyutta olduklarından emin olmak için bir jel üzerinde çalıştırın. Daha sonra, PCR ürünlerini arındırın ve doğru gen bölgesini hedef aldıklarından emin olmak için sıralayın.
    3. Arta kalan saflaştırılmış PCR ürününün 200 ng'lik kısmını 1 μL Cas9 reaksiyon tamponu, 1 μL BSA, 1,5 μL karmaşık Cas9:gRNA ile karıştırın ve toplam reaksiyon hacmini 15 μL'ye getirin.
    4. Ürünü tekrar bir jel üzerinde çalıştırın. Cas9 proteini PCR ürününü başarıyla keserse, birincil bant daha soluk görünmeli ve ek daha küçük bantlar bulunmalıdır. Orijinal PCR ürününün boyutunun küçültmesine dikkat edin ve istenirse bant yoğunluğundaki azalmayı yaklaşık kesme verimliliğine göre hesaplayın.
  7. Son enjeksiyon karışımının hazırlanması
    1. Hedeflenen PCR ÜRÜNÜNÜ başarıyla kesen her gRNA için, her Cas9 ve gRNA'nın hacimlerini 0,5 mL'lik bir tüpe karıştırın, böylece son hacim Cas9 proteininin 300 ng/μL'si ve her gRNA'nın 80 ng/μL'si kalır.
    2. Karmaşık Cas9 ve gRNA'ları enjeksiyon için gerekli olana kadar -80 °C'de saklayın.

2. İğnelerin çekilmesi ve eğimli olması

NOT: Embriyoların başarılı enjeksiyonları ve hayatta kalması keskin iğneler gerektirir (Şekil 1).

  1. 1 mm dış çaplı borosilikat veya kuvars cam mikrokapsiller kullanın. Çekilmeden önce mikrokapsilleri kimyasal bir duman kaputunda silikonize edin.
    1. Kısacası, 3 mL Sigmacote'yi bir cam kabın içine yerleştirin ve vakum, en az 4 saat boyunca cam mikrokapsilleri içeren ikinci bir kabın içine çekin, silikonlaştırıcı çözeltinin buharlaşıp mikrokapsillerin tüm yüzeylerine yerleşmesini sağlar.
    2. Daha sonra, stopcock vanasını kademeli olarak açarak ve havanın odaya geri dönmesini sağlayarak vakum odasının ortam basıncına eşit olmasına yavaşça izin verin. İğneler daha sonra çekilmeye hazırdır.
    3. Kullanmadan önce her zaman iğne çekme kılavuzunu okuyun.
      NOT: Aşağıdaki talimatlar, cam iğneleri çekmek için bir P-2000 Lazer İğne Çekeceği'nin nasıl kullanılacağını detaylandırmaktadır. Aynı markadaki tüm iğne çektiricilerin farklı ünitelerde tam olarak aynı iğneyi çekecek şekilde kalibre edilmemiş olduğunu belirtmek önemlidir. İyi iğneler almanın anahtarı, belirli bir parametre kümesinden başlamak ve daha sonra bu değerlerin üstünde ve altında olan parametreleri kullanarak iğneleri çekmektir. İğnenin embriyoları ne kadar iyi deldiğini ve enjeksiyon karışımının iğneden ne kadar iyi aktığını değerlendirerek bu parametrelerin her birinde iğneleri test edin. Açılması veya eğimi kolay, embriyoları sorunsuz bir şekilde delen ve enjeksiyon karışımını kolayca sağlayan bir iğne elde edilene kadar parametreleri iyileştirin.
  2. P-2000 lazer iğne çekme kullanarak iğne çekme
    1. Lazer iğne çekmeyi açın ve lazerin ilk çekmeden önce 15 dakika ısınmasını kesin.
    2. Makineyi cam mikrokapiller tüpün türü için programla (İğne çekme makinelerinin tüm çekme makinelerinde aynı iğneyi üretecek şekilde kalibre edilmemiş olduğundan, iğne çekme parametrelerinin bir başlangıç noktası olduğunu unutmayın):
      Kuvars: Isı = 730; Fil = 4; Vel = 40; Del = 122; Pul = 156
    3. İğne çekmeyi programlandıktan sonra, lazerle ısıtılacak bölgeye değil, sadece mikrokapsiller tüpün ucuna dokunmaya özen göstererek bir mikrokapcalini yükleyin ve yerine kelepçeleyin.
    4. Mikrokapsilleri sıkıştırırktan sonra, parmak çubuklarına başparmak ve işaret parmağı yerleştirin ve ardından yaylı serbest bırakmalara teker teker basarak çekme çubuklarını serbest bırakın.
    5. Çubukları tamamen bir araya getirmek için başparmak ve işaret parmağı sıkın.
    6. Mikrokapsiller tüpün diğer tarafını kelepçesine yerleştirin, böyle şekilde tüpün küçük bir kısmı her iki taraftan da uzanır. Her iki kelepçenin de parmak sıkı olduğundan ve "çekme çubuklarını" sıkıca yerinde tuttuklarından emin olarak kelepçeleri sıkın.
    7. Koruyucu örtünün üzerine çekin.
    8. Çek düğmesine bastıktan sonra lazer, kefenin altında bulunan kırmızı "lazer açık" ışığıyla belirtilen camı ısıtmaya başlayacaktır. Çekme çubukları tamamen ayrıldığında, metalik bir thud eşliğinde çekme tamamlanır.
    9. Kefeni kaldırmadan önce "lazer açık" ışığının yanmadığından emin olun.
    10. Kelepçenin ötesine uzanan mikrokapsiller tüpün küçük ucunun başparmağı ve işaret parmağı ile tutun ve kelepçeyi gevşetin. Daha sonra mikrokapsiller tüpü kelepçeden kaldırın.
    11. Mikrokaps tüpünü çift taraflı bantla kaplı kare bir Petri kabına dikkatlice yerleştirmek için tokmaklar kullanın. İğneyi tutma kutusuna yerleştirirken, iğnenin arka ucunun önce dokunduğundan ve keskin ucun zarar görmemesi için iğnenin hafifçe yerine indirildiğinden emin olun.
  3. PC-10/PC-100 iğne çekerek iğne çekme
    1. PC-10 puller'ı 4 ağırlık kullanarak ayarlayın ve tek adımlı bir çekme için sıcaklığı 50,4 °C'ye ayarlayın.
    2. Üst kıskaç içine bir borosilikat cam mikrokapiller yerleştirin. Daha sonra ağırlıklı alt kelepçeyi pozisyona getirin ve kılcal damarın iki iyi iğne çekecek konumda olduğundan emin olarak mikrokapsillerin alt kısmını sıkıştırın. Bu oldukça uzun bir çekme döngüsüdür, ancak eğim için iyi iğneler üretir.
  4. Eğimli iğneler.
    NOT: Bu ıslak eğim yöntemi, iğnenin bağıl açılış boyutu hakkında gerçek zamanlı geri bildirim sağlar.
    1. Aşındırıcı plakayı ve iğne bevelerinin tutma halkasını monte edin. Aşındırıcı plakanın gri tarafının üst ve alt tutma halkası arasında yukarı doğru yönlendirildiğinden emin olun. Her vidanın eşit şekilde sıkılmasını sağlamak için vidadan vidaya değiştirerek tutma halkası üzerindeki vidaları sıkın. Aşındırıcı plaka ve istinat halkaları bundan sonra taşlama tertibatı olarak anılacaktır.
    2. Optik düz yüzeye 13 damla (~ 520 μL) kaide yağı yerleştirin ve ardından taşlama tertibatını plakanın üzerine yerleştirin. Montajı bir diseksiyon mikroskobun altına yerleştirin ve ardından beveler'i açın. Sutter'ın önerisine kıyasla biraz ekstra yağ kullanılır, çünkü bu ıslak eğim yöntemiyle birlikte kullanıldığında aşındırıcı plakanın daha uzun süre dönmesini sağlar.
    3. Taşlama yüzeyine % 1 Photo-Flo çözeltisi ekleyin ve fitili Photo-Flo çözeltisine daldıracak şekilde pozisyona getirin.
    4. Ana kaynakta yayına açın. Daha sonra tutucuya çekilmiş bir borosilikat iğne yerleştirin ve istinat halkasını sıkın. Regülatörde havayı açın ve basınç 26 PSI'a ulaşana kadar artırın.
    5. Yandan izlerken, neredeyse Photo-Flo sıvı yüzeye dokunana kadar kaba ayar düğmesini kullanarak iğneyi dirayeti kılayın.
    6. İğneyi görüş alanında bulmak için mikroskobu ayarlayın. En düşük büyütmeden başlayın ve büyütmeyi artırın. Foto-Flo sıvısının yüzeyine dokunana kadar kaba ayar düğmesini kullanarak iğnenin konumunu dikkatlice ayarlayın.
    7. Kaba ayar düğmesini kullanarak ve mikroskop altında bakmaya devam ederek, iğneyi aşındırıcı yüzeye yakın olana kadar küt küt küt atın, ancak dokunmayın.
    8. İnce ayar düğmesini kullanarak, iğneyi dikkatlice ve yavaşça küt küt, iğneye ve beveler'in aşındırıcı yüzeyinde bıraktığı gölgeye çok dikkat edin. İğne ve gölgesi aşındırıcı yüzeye dokunmak üzere gibi göründüğünde, iğneyi daha yavaş ve dikkatli bir şekilde indirmeye devam edin.
    9. İğneyi aşındırıcı yüzeye indirerek "eğimli" hale getirmek ve sonra yükseltmek arasında geçiş yapın. İğneyi kaldırmadan önce, ince ayar düğmesindeki mikrometre üzerindeki ayarı hızlı bir şekilde not edin, böylece iğne aynı konuma veya gerekirse biraz daha düşük bir konuma indirilebilir. İğneyi Photo-Flo sıvı tabakasının altında tutmayı unutmayın. İğne aşındırıcı yüzeyin üzerine çıkarıldıktan sonra, kabarcıkları kontrol etmek için beveler'in dönüşünü hızla durdurun ve yeniden başlatın. İğne yeterince eğimliyse, hava kabarcıkları iğneden dışarı ve Photo-Flo'ya akmalıdır. Plaka durdurulmazsa, iğne açıklığı çok büyük olana kadar kabarcıklar muhtemelen görünmez hale gelecektir.
    10. İğne aşındırıcı yüzeyin üzerine çıktığında ve beveler durduğunda kabarcıklar görünmüyorsa, eğim prosedürünü tekrarlayın, iğneyi ince ayar düğmesinde bulunan mikrometrede biraz daha düşük bir konuma indirin, iğneyi kaldırın, beveler plakasını durdurun ve hava kabarcıklarını kontrol edin. Küçük ama sabit bir kabarcık akışı görünene kadar tekrarlayın.
    11. Hava kabarcıkları mevcut olduğunda, aşındırıcı plakayı durdurarak ve hava basıncını düşürerek, kabarcık oluşumunun durduğu PSI'ı belirterek göreceli açılış boyutunu kontrol edin, çünkü bu eğimli iğnelerin açıklığının boyutunun göreceli bir göstergesidir. Havanın iğne ucundan kaçmayı durdurduğu basınç ne kadar düşükse, iğne açıklığı o kadar büyüktür. 18-20 PSI'da kabarcıkların iğneden kaçmayı bıraktığı noktaya kadar eğimli iğneler, iğnenin nispeten küçük bir açıklığa sahip olduğunu ve mikroenjections için kullanıldığında bir embriyoya en az zarar vermelidir.
    12. İğne açıklığı kontrol ettikten sonra, sıvının iğneye girmesini önlemek için hava basıncını 26 PSI'a çıkarın. Ardından kaba ayar düğmesini kullanarak iğneyi Foto-Flo tabakasından yukarı ve dışarı kaldırın. İğneden hava aktığı sürece Photo-Flo'nun iğneye girmediğini ve bu nedenle iğnenin içinin kirlenmeye karşı korunduğunu belirtmek önemlidir.
    13. İğne Photo-Flo'dan çıktıktan sonra, havayı kapatın ve iğneyi iğne tutucudan çıkarın.
    14. Tokmaklar kullanarak, yeni eğimli iğneyi yerinde tutmak için çift taraflı bant veya modelleme kili olan bir Petri kabına yerleştirin. 10-20 eğimli iğne üretilene kadar işlemi tekrarlayın.

3. Sivrisineklerin ebeveyn neslini kanla beslemek

  1. Cx. pipiens sivrisineklerinin arka larvaları, sivrisineklerin kışlayan uykularına veya diapause'larına girmemelerini sağlamak için 25-27 ° C'de belirsiz uzun gün koşulları altında (>13 saat ışık / gün).
  2. Yetişkinlerin ortaya çıkışından yedi ila on gün sonra, ısıtma ünitelerini güç kaynağına takarak Hemotek Membran besleme sistemini hazırlayın. Ünitenin üstündeki ayar vidasını kullanarak her ünitenin sıcaklığını 37 °C (insan iç vücut sıcaklığı) veya 41 °C (tavuk iç vücut sıcaklığı) olarak ayarlayın. Elektrikli termometre kullanılarak doğru sıcaklığa ulaşıldığından emin olun.
  3. Kan unu rezervuarını beslenme için hazırlayın.
    1. Her kan besleme silindiri için bir kare parafilm kesin ve parafilm'i çıplak ayaklara sürün. Bu, sivrisinekler için çekici kokular sağlar.
    2. Parafilm'i mümkün olduğunca ince bir şekilde uzatın ve kenarları yemek rezervuarı etrafında sıkıca sarın. İstenirse, kauçuk bir O-halka ile yerinde sabitleyin.
    3. 15 mL taze veya çözülmüş bütün, sodyum sitratla işlenmiş tavuk kanına yaklaşık 200 μL 0,1 M ATP çözeltisi ekleyin. ATP kan beslemeyi uyarmaya yardımcı olur ve sodyum sitrat kanın pıhtılaşmasını önler.
    4. Rezervuarı, parafilm tarafı aşağı bakacak şekilde tutun ve rezervuarı doldurmak için dikkatlice tek kullanımlık bir pipet kullanın. Her rezervuar ~ 3 mL kan tutar. Dolum portlarını plastik fişlerle kapatın.
    5. Yemek rezervuarlarını ısıtma ünitelerine vidaleyin ve sivrisinek kafesinin üzerine parafilm tarafı aşağı bakacak ve sivrisinekler ağdan beslenebilecek şekilde yerleştirin.
  4. Alacakaranlığı simüle etmek için kafesleri siyah çöp torbalarıyla örtün ve artan CO2 konsantrasyonu kan beslemeyi uyardığı için her kafese kuvvetlice üfleyin.
  5. Kan beslemeyi en üst düzeye çıkarmak için besleyiciyi kafeste 2-8 saat tutun. Periyodik olarak kontrol edin ve kan unu alan kadınların oranını not edin (kırmızı ve şişmiş karınları ile belirgindir).

4. Yetişkin sivrisineklerde yumurtlamayı teşvik etmek

  1. Kan beslemeden dört ila beş gün sonra, sivrisinek yumurtlaması için 50 mL konik bir tüp hazırlayın.
    1. Konik tüpün altına yakın bir ~20 mm delik oluşturun.
    2. Deliği iki kare (35 mm2)diş barajı kauçuğunla, biri yatay yarıklı, diğeri dikey yarıklı olarak kapatın. Diş barajının karelerini konik tüpe bağlamak için bant kullanın.
    3. 35 mm x 10 mm Petri kabına 4,25 cm'lik bir filtre kağıdı yerleştirin ve filtre kağıdını 750 μL damıtılmış su ile ıslatın.
    4. Konik tüpü filtre kağıdına ters çevirin ve güvenli olduğundan emin olmak için birkaç kez ileri geri bükün.
  2. Cx. pipiens'in ~10 dişisini kafeslerinden dikkatlice çıkarmak ve hazırlanan konik tüpe aktarmak için bir ağız aspiratörü kullanın.
  3. Yumurtlamayı uyardığı için sivrisineklere karanlık sağlamak için konik tüpün üzerine opak bir silindir yerleştirin ve 20-25 dakika bekleyin.

5. Mikro manipüle edici taze döşenmiş Culex yumurtaları

  1. Sivrisinek embriyolarını mikroenjeksiyon için takmak için slaydı hazırlayın.
    1. Bir kapak camı genişliğine bir parça çift taraflı bant takın.
    2. Çift taraflı bantlara, kapak camının kısa ucuna paralel olacak ve kapak camının ucundan yaklaşık 5 mm olacak şekilde ince bir şeffaf tıbbi pansuman şeridi (örneğin, Tegaderm, 2-3 mm genişliğinde) takın.
    3. Fazla çift taraflı bandı keskin bir jiletle çıkarın ve kapak camının her ucundan 2-3 mm tıbbi pansuman ve çift taraflı bant çıkarın. Bu, yumurtalar kapak camına monte edildikten sonra bir yağ tabakasının slaytta kalmasını sağlar.
    4. Bir balmumu kalemi kullanarak, çift taraflı bant ve tıbbi pansuman şeridinin etrafına bir "D" şekli çizin. Bu, enjeksiyondan sonra suyu yumurtaların etrafında tutmak için bir bariyer görevi görecektir.
  2. Slayt hazırlandıktan ve 20-25 dakika geçtikten sonra, opak tüpü çıkarın ve sivrisineklerin yumurta atıp bırakmadığını belirleyin.
    1. Değilse, 5-10 dakika daha örtün.
    2. Sivrisinekler yumurta bıraktıysa, konik tüpü dikkatlice ama hızlı bir şekilde kaldırın ve bir kapakla örtün. Sivrisinekleri ayrı bir kafese yerleştirin ve yumurtaların toplandığı zamanı bir hesap tablosuna kaydedin. Daha sonra yumurta sallarını içeren filtre kağıdına 50-100 μL DI suyu ekleyin.
  3. Bir diseksiyon mikroskobu altında yumurtaları hizalar.
    1. Bir filtre kağıdı parçasını (hızlı akış hızına sahip kaba filtre kağıdından kesilmiş 10 mm x 30 mm dikdörtgenler) 24 mm x 40 mm kapak camının altına yerleştirin, böyle şekilde kapak camı filtre kağıdının sol tarafının% 50-60'ını kaplar.
    2. Filtre kağıdını 50 μL DI su ile ıslatın. Su, kapak camının altına yavaşça yayılacak ve mikro yönetim sırasında filtre kağıdını ve yumurtaları ıslak tutmak için bir rezervuar oluşturacaktır. Doğru miktarda su uygulandığında kapak camı ile filtre kağıdı arasında bir menisküs oluşacaktır.
    3. Yumurtaları ince bir boya fırçası kullanarak yumurta sallarından ayırın ve embriyonun dar, arka ucu kapak camına (solda) dokunacak ve daha geniş, ön ucu sağda olacak şekilde konumlandırın.
    4. Yumurtaları 20 dakika hizalayın, renklerinin süt beyazından çok açık griye değişimini dikkatlice gözlemleyin. Yeterli miktarda su olduğundan emin olmak için su filmini kapak camının altında rutin olarak inceleyin. Yumurtalar kuruyor gibi görünüyorsa, filtre kağıdına az miktarda DI suyu (20-30 μL) ekleyin.
    5. 20 dakika sonra kalan tüm yumurtaları atın.
  4. Yumurtaları mikroenjeksiyon kaydırasına aktarın.
    1. Doymuş filtre kağıdının yanından suyu fitillamak için küçük (10 mm x 30 mm) kaba filtre kağıdı kullanın ve fitilleme filtre kağıdını asalarla çıkarın. Yumurtalı filtre kağıdının mümkün olduğunca kuru olduğundan emin olmak için 2-3 kez tekrarlayın.
    2. Filtre kağıdının taze, kuru bir dikdörtgenini yerleştirin ve bir çift asa ile yerinde tutun. Kapak camını hizalanmış yumurtalardan uzağa dikkatlice çekin.
    3. Hizalanmış yumurtaları içeren küçük filtre kağıdını bozmadan sahnedeki fazla suyu kurutun. Islak filtre kağıdını yumurtalarla birkaç kez daha kurutmaya devam edin, yumurtaları enjeksiyon kaydırağından aktarmadan önce mümkün olduğunca kuru olduğundan emin olmak için filtre kağıdının küçük dikdörtgenlerine başparmak ve/ veya asalarla bastırın.
    4. Yabanatı kullanarak, tıbbi pansuman şeridinden geriye doğru geri giden kağıdı montaj kaydıraktan çıkarın.
    5. Montaj kaydırağını bir başparmak ve orta parmakla ve açıkta kalan tıbbi pansumanı aşağı bakacak şekilde tutun ve hizalanmış yumurta çizgisine 45° açıyla 60° açıyla kıtın. Slaytı, yumurtaların daha geniş, ön ucunun (solda) tıbbi pansumanın ucundan hafifçe sarkacak şekilde konumlandırın, çünkü bu, Culex larvalarının monte edilmiş yumurtalardan başarılı bir şekilde yumurtadan çıkma yeteneğini arttırır.
    6. Hizalanmış tüm yumurtaların tıbbi pansumana sıkıca tutturulmasını sağlamak için kapak camını başparmak ve orta parmak arasında tutmaya devam ederken işaret parmağını kapak camının altına bastırın.
    7. Kapak camını hemen yumurtalar yukarı bakacak şekilde ters çevirin ve yumurtalara ince bir yağ Halokarbon yağı tabakası (2-3 damla; ~20 μL) uygulayın. Bu, yumurtaların mikroenjeksiyon sırasında kurumasını önler. Tıbbi pansumana bağlı olmayan veya yağ tarafından kaplanmayan yumurtaları çıkarın.
    8. Cam kapağı, monte edilmiş yumurtaların mikroenjeksiyon için taşınması için büyük bir kare ıslak filtre kağıdı ile kare bir Petri kabının içine bakacak şekilde yerleştirin.

6. Culex embriyolarının enjektei

  1. Enjeksiyon iğnelerini enjeksiyon karışımı ile geri doldurma
    1. Seçilen enjeksiyon iğnesinin arka ucuna kolayca sığacak ve iğne dolgusunun ucu ile enjeksiyon iğnesi arasında biraz boşluk olacak bir iğne dolgusu veya jel yükleme ucu seçin.
    2. İğneyi geri doldurmak için iğne dolgusunu kullanarak enjeksiyon iğnesine tek ve küçük bir damla enjeksiyon karışımını (~0,5-1 μL) dikkatlice yerleştirin. Enjeksiyon karışımının damlasını enjeksiyon iğnesinin konik olmaya başladığı yerin yakınına yerleştirin.
  2. Enjeksiyon iğnesini mikro enjektöre takın.
  3. Embriyoları içeren slaydı mikroskop aşamasına yerleştirin.
  4. İğneyi açma
    NOT: Eğimli iğneler kullanıyorsanız, bu gerekli değildir.
    1. ~30 PSI'lık bir başlangıç enjeksiyon basıncı kullanın ve uygun miktarda enjeksiyon karışımı sağlamak için gerektiği gibi ayarlayın.
    2. Diseksiyon mikroskobu altında, iğneyi embriyonun üzerine yerleştirin ve iğneyi embriyonun üzerine indirmek için mikromanipülatörü dikkatlice kullanın. İğne embriyoya zar zor dokunduğunda, embriyoyu iğnenin uzun eksenine dik olarak hızla hareket ettinin.
    3. İğnenin başarıyla açılıp açılmadığını belirlemek için enjeksiyon tetiğine basın ve iğneden herhangi bir kabarcık/enjeksiyon karışımı kaçıp kaçmadığını görün. Değilse, iğne açılana ve tetiğe basıldığında enjeksiyon karışımı kaçana kadar embriyoyu iğneye doğru hareket ettirmeyi tekrarlayın.
  5. Embriyoların enjektei
    1. İlk embriyoyu mikroskoptaki görüş odağında hizaya yerleştirin ve odakta olduğundan emin olun.
    2. İğneyi ilk yumurtanın üzerine, ayrıca mikroskoptaki görüş alanının merkezine yerleştirin.
    3. Mikroskoptaki büyütmeyi kademeli olarak artırın, iğneyi ilk embriyonun hemen üzerinde, ortalanmış ve odaklanmış tutmak için dikkatlice küt küt küt küt attırın. Mikroskop en yüksek büyütmeye ulaşana ve hem embriyo hem de iğne odakta olana kadar devam edin.
    4. Sahnedeki embriyoyu dikkatlice sola doğru hareket ettirin ve iğneyi hafifçe küstür, böylece iğne ve embriyo artık aynı görüş düzlemindedir.
    5. Embriyoyu hareket ettirmek için mikroskop aşamasını kullanarak, embriyoyu iğnenin ucuna dikkatlice ve nazikçe dokunun. Embriyonun dar, arka ucu hafifçe sapmalıdır. İğnenin yüksekliği çok yüksek veya çok düşükse ayarlayın.
    6. Mikroskop aşamasını kullanarak, embriyonun arka ucunu iğneye hareket ettinin ve sivrisinek yumurtasının chorion'una nüfuz eden iğneyi gözlemleyin. İğne, Culex embriyolarındaki kutup hücrelerinin yaklaşık konumundaki zara nüfuz etmelidir. Bu gerçekleştiğinde, enjeksiyon tetiğini 1-3 kez çekerek enjeksiyon karışımını embriyoya çekin. Embriyoplazmada küçük bir açıklık tespit edilebilecek kadar az miktarda enjeksiyon karışımı sunun.
    7. Aşamayı kullanarak embriyoyu iğnenin sağına, uzağına ve ucuna hareket ettinin. Enjeksiyon iyi giderse, embriyodan çok az veya hiç sıvı sızmamalıdır.
    8. Çizgideki bir sonraki embriyonun iğnenin önüne yerleştirilmesi için aşamayı aşağı hareket ettinin. Sonra tekrar, aşamayı sola doğru hareket ettirerek embriyoyu enjeksiyon iğnesine yerleştirin ve enjeksiyon tetiğini çekin.
    9. Enjeksiyon karışımı çıkmıyor gibi görünüyorsa ve/veya iğne çıkarıldıktan sonra embriyodan çok miktarda sıvı kaçarsa enjeksiyon iğnesini değiştirin ve tekrar başlayın.
    10. Enjekte edilmemiş veya hasar görmüş yumurtaları yok edin.
  6. Enjeksiyon sonrası embriyolara bakmak
    1. Slayttaki tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, halocarbon yağını bir fışkırtma şişesi ile ters ozmos suyu uygulayarak yıkayın, böylece su akışı enjekte edilen embriyoların üzerindeki cam örtünün üstüne yönlendirilir ve suyun kapaklardan aşağı ve embriyoların üzerine akmasını sağlayarak yağı durulayın. Su akışını doğrudan embriyolara yönlendirmemeye dikkat edin, çünkü bu onları tıbbi pansumana zarar verebilir veya ayırabilir. Bu işlem Halocarbon yağının çoğunu, ancak tümünü değil, çoğunu kaldırır.
    2. Slaydı 150 μL DI su ile örtün.
    3. Enjekte edilen embriyoları içeren slaydı kare bir Petri kabının içindeki ıslak filtre kağıdına yerleştirin.
    4. Enjekte edilen embriyoları içeren Petri kabını uzun gün fotoperiyod (>13 saat ışık/gün) ile 25-27 °C, %70-80 RH olarak ayarlanmış bir çevre odasına yerleştirin.

7. Enjekte edilen embriyoların (F0)yetişkinliğe yetiştirilmeleri ve haçların kurulması

  1. Enjekte edilen embriyoların slaytlarını günlük olarak inceleyin, enjeksiyondan 1,5 gün sonra 1st instar larvasının ortaya çıkmasını bekleyin.
  2. 1st instar larva sayısını sayın ve 100-200 larvayı 450 mL DI su ve 50 mg öğütülmüş balık yemi içeren ayakkabı kutusu büyüklüğünde bir Tupperware kabına yerleştirin. Şu anda, enjekte edilen sivrisineklerle geçmek için kullanılacak vahşi tip veya enjekte edilmemiş larvalar içeren 1-5 kat daha fazla kap oluşturun.
  3. Larvaları günlük olarak besleyin, larva yaşamının 6. gününde 300-500mg'a ulaşana kadar her gün aldıkları yiyecek miktarını biraz artırın.
  4. Pupalar ortaya çıktıktan sonra, bir pupayı% 50-75'i DI su dolu 2 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirmek için bir transfer pipeti kullanın. Tüm pupalar için tekrarlayın, hem embriyo olarak enjekte edilen pupalar hem de bozulmamış, vahşi tip pupalar. Kapakları hafifçe aralık olacak şekilde dikkatlice bastırın, sivrisineklerin kaçmasını önleyin, ancak yine de az miktarda gaz değişimine izin verin.
  5. Yetişkin sivrisinekler mikrosantrifüj tüplerinin içinde ortaya çıktıktan sonra, enjekte edilen dişi sivrisinekleri bakir vahşi tip erkek sivrisinekler içeren bir kafese bırakın ve enjekte edilen her dişi için en az 1 vahşi tip erkek oranı elde edin. Benzer şekilde, enjekte edilen erkek sivrisinekleri bakir vahşi tip dişiler içeren bir kafese bırakın ve enjekte edilen her erkek için yaklaşık 5-10 bakire vahşi tip dişi oranı elde edin. Her erkek sivrisinek birden fazla kez çiftleşebileceğinden, vahşi tip dişilerin enjekte edilen erkeklere daha yüksek bir oranı önerilir. Bu nedenle, enjekte edilen erkeklerle çiftleşebilen daha yüksek sayıda vahşi tip dişiye sahip olmak, üretilebilen F1 soyunun sayısını arttırır.

8. F1 sivrisineklerinin elde ve yetiştirilen ve mutasyonlara karşı taranır

  1. Yetişkin ortaya çıktıktan yedi ila on gün sonra, yukarıda açıklandığı gibi her kafesteki dişilere bir kan unu sunun (adım 3).
  2. Kanla besledikten dört gün sonra, her kafese yumurtlama suyu yerleştirin. Her yumurta salı, tek bir dişi sivrisinek soyunu temsil eder ve bu nedenle yumurtlamadan kısa bir süre sonra kendi plastik, ayakkabı kutusu büyüklüğünde yetiştirme kabına yerleştirilmelidir. Her kabı benzersiz bir tanımlayıcı ile etiketleyin ve ayrıca larvaların, erkek veya dişi ebeveyne enjekte edilip edilmediği, tavanın kurulduğu tarih, yetiştirme koşulları ve deneycinin baş harfleri gibi ilgi geni için F1 nesline ait olduğunu belirtin.
  3. Larva tavalarını günlük olarak izleyin. Larvalar tavalarda yumurtadan çıkar çıkmaz, 50 mg öğütülmüş balık yemi sağlayın. Yukarıda açıklandığı gibi 6 gün boyunca yiyecekleri günlük olarak artırın (adım 7.3).
  4. Bireysel pupaları 1-1,5 mL DI su içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, her tüpü etiketlayın ve kapakları kırın.
  5. Yetişkin sivrisinekler ortaya çıktıktan sonra, 2 mL mikrosantrifüj tüpünü dikkatlice açın, bir işaret parmağıyla örtün ve diğer elinizle, mikrosantrifüj tüpünün üstüne 3 dram cam şişe yerleştirin. Sivrisineğin doğal içgüdüsü yukarı ve cam şişeye uçmak olmalıdır. Bu olduğunda, cam şişenin açılmasının üzerine bir parmak kaydırın ve hızlı bir şekilde ters çevirin, şişenin üstüne% 10 sakkaroz çözeltisi ile hafifçe ıslatılmış küçük bir pamuk topu yerleştirin. Bu, sivrisinin kaçmasını önler ve gerekli bir yiyecek ve su kaynağı sağlar.
  6. Hem pupal exuvia içeren tüpü hem de ortaya çıktığı larva tavasını, sivrisinek cinsiyetini ve bu birey için benzersiz tanımlayıcıyı belirtmek için yetişkin sivrisinek içeren cam şişeyi etiketleyin. Örneğin: II.C.M32, burada "II" erkek ebeveynin enjekte edildiğini temsil eder, "C" bireyin kaynaklandığı tava / yumurta salını temsil eder ve "M32", bu larva yetiştirme kabından çıkan32 nd erkek olduğunu belirler.
  7. Yetişkin sivrisinekleri kendi cam şişelerine çevre odasına geri yerleştirin ve pamuklarına günlük% 10 sakkaroz çözeltisinin küçük bir miktarını (~ 20 μL) ekleyin. Sivrisinekler sakkaroz çözeltisine sıkışacağından ve öleceğinden pamuğu fazla beslememeye veya doyurmadığınızdan emin olun.
  8. İstenilen mutasyon için sivrisineklerin taranır
    1. Üreticinin talimatlarına göre Phire Direct PCR Kitini kullanarak larvaların her bir yumurta salından / tavasından 5-10 pupal eksuviadan ve kontrol görevi görecek 1-2 vahşi tip bireyden genomik DNA çıkarın.
      NOT: Her saldan yavrular muhtemelen tam kardeş olduğundan, her tavadan 5-10 larva taranır, mutasyonun yavrulara geçirilip geçirilmediğini belirleyecektir. Bir tavadan taranan larvaların hiçbiri istenen mutasyona sahip değilse, ek yetişkinleri taramayın. Bazı larvalar mutasyona sahipse, o tavadaki her birey taranmalıdır.
    2. Daha önce tasarlanmış PCR astarlarını (adım 1.2) kullanarak, hem vahşi tip hem de F1 soyundaki Phire PCR kitini kullanarak mutasyonunuzun öngörülen yerinin etrafındaki parçayı güçlendirin ve görünür eklemeler veya silmeler (indels) olup olmadığını belirlemek için PCR parçalarını% 3-4 agarose jel üzerinde çalıştırın.
      NOT: İstenilen mutasyona sahip olan bireyler heterozipöz olacaktır ve bir vahşi tip ve bir tane de istenen pozisyonda biraz daha kısa veya daha uzun olmak üzere 2 bant göstermelidir. Bunları ayırt etmek için, vahşi tip bireylerin bantlarının konumunu ve kalınlığını F1 soyundaki bantlardakilerle karşılaştırın. İdeal olarak 2 ayrı bant görünür olacaktır, ancak indel çok küçükse, bant daha geniş ve / veya bulanık görünebilir.
    3. PCR ürününü, şüpheli indelleri içeren bandı (önerilen) veya jel içine yüklenmemiş kalan PCR ürününü saflaştırarak saflaştırın. İstenen mutasyonun mevcut olup olmadığını belirlemek için saflaştırılmış PCR'yi sıralamaya gönderin.

9. F2 ve F3 sivrisineklerinin elde ve yetiştirilen ve mutasyonlara karşı taranır

  1. Pupal exuvia'sını bireysel cam şişelerinden ve karşı cinsin vahşi tip, enjekte edilmemiş sivrisineklerini içeren bir kafese tarayarak istenen mutasyonun bulunduğu tüm F1 yetişkin sivrisineklerini serbest bırakın. Bu ikinci nesil için backcrossing enjeksiyon ve akraba evliliği tüm zararlı etkilerini kaldırmalıdır.
  2. Kan, mutant F1 sivrisineklerinin kafeslerini ve daha önce açıklandığı gibi vahşi tip meslektaşlarını besler. Dört ila beş gün sonra, elde eden F2 yumurta sallarını toplayın.
  3. F2 larvalarını yukarıda açıklandığı gibi etiketleyin ve arkalayın, her yumurta salını ayrı, etiketli bir kaba yerleştirin. Yavrulama üzerine, tekrar bireysel pupaları bireysel 2 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve her yetişkini ortaya çıktıktan sonra sakkarozla ıslatılmış pamukla kaplanmış ayrı cam şişelere aktarın. Daha sonra her F2'nin pupal eksuviasını daha önce açıklandığı gibi istenen mutasyonu (adım 8.5-8.8) tarayın.
    NOT: Burada istenen mutasyona sahip tüm bireyler heterozipöz olacaktır ve bu nedenle PCR ürünü ideal olarak% 3-4 agarose jel üzerinde çalıştırıldığında 2 ayrı bant üretmelidir.
  4. Mutant F2 larvaları belirlendikten sonra, mutasyona sahip tüm erkek ve dişileri çiftleşmek için aynı kafese yerleştirin. Kan yemini yetişkin ortaya çıktıktan 7-10 gün sonra ve 4-5 gün sonra F3 yumurta sallarını toplayın.
  5. Her F3 yumurta salını ayrı bir larva yetiştirme kabına yerleştirin ve yukarıda açıklandığı gibi etiketleyin ve besleyin.
  6. F3 pupaları ayrı ayrı 2 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırın. Yetişkinler ortaya çıktıktan sonra, onları% 10 sakkarozla ıslatılmış pamukla kaplanmış bireysel cam şişelere aktarın. Daha önce açıklandığı gibi pupal exuvia'sını tarayın. Bu kez, her tavadaki yavruların yaklaşık% 25'i boş mutasyon için homozigöz olmalıdır. Bu bireyleri tek bir kafese yerleştirin ve yeni oluşturulan mutant sivrisinek hattını oluşturmak ve sürdürmek için kullanın.
    NOT: Düşük sayıda homozigöz sivrisinek varsa, F4 kuşağında ek homozigous-null sivrisinekler oluşturmak için heterozipöz F3 erkek ve dişiler birbirleriyle geçilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokolü kullanarak, Cx. pipiensembriyolarını başarıyla enjekte edebildik ve enjekte edilen embriyolar arasında yüksek bir hayatta kalma oranı gözlemledik (~% 55, Şekil 1). Daha önceki denemeler daha düşük bir hayatta kalma yüzdesine sahipti, muhtemelen yumurta folikülünün ön kısmı tıbbi pansuman şeridine tutturuldu, sivrisinek larvalarının korondan kaçmasını ve suya başarılı bir şekilde yüzmesini önledi. Ön ucun tıbbi pansuman şeridinin ötesine uzanmasını sağlamak larva ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Culex sivrisineklerinin genomuna belirli mutasyonları sokmak için yöntemler sunar ve diğer sivrisineklerin genomlarını düzenlemek için de kullanılabilir. Protokol, sadece enjeksiyon malzemelerinin nasıl hazırlanacağına dair özel ayrıntılar değil, aynı zamanda sivrisineklerin yumurta bırakmaya nasıl teşviklanacağı ve bu yumurtaların nasıl hazırlanacağı ve enjektelanacağı hakkında ayrıntılı bir video özeti sağlaması açısından önemlidir. Ayrıca, dişi Cx. pipiens'in biyolojisinden yararlanarak ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RH, böcek genetik modifikasyonunda hizmet veren Böcek Dönüşüm Tesisi için çalışmaktadır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. David O'Brochta'ya ve Böcek Genetik Teknolojileri Koordinasyon Araştırma Ağı'nın tüm üyelerine genetik teknolojilerin uygulanması konusunda bize ve diğerlerine sağladıkları yardım ve eğitim için teşekkür ederiz. Özellikle Channa Aluvihare'ye Culex embriyolarının enjekte edilmesine ve yumurtadan çıkmasına izin vermek için mikro yönetim protokolünü optimize ettiği için teşekkür ediyoruz. Ayrıca, Meuti laboratuvarında çalışan lisans öğrencileri Devante Simmons ve Joseph Urso'ya transgenik sivrisineklerin bakım ve taramalarına yardımcı olmaları için ve ITF'den Zora Elmkami'ye sivrisineklerin enjeksiyon için yetiştirilmelerine ve hazırlanmasına yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, MEM'e sağlanan OSU'daki Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü'nden disiplinler arası tohumlar hibesi ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yapay Membran BesleyiciHemotekSP5W1-3Şirket yeri: Blackburn, İngiltere
ATPInvitrogen18330019Şirket yeri: Carlsbad, CA, ABD
Borosilikat cam mirokapiller tüpler, 1 mm dış çapDünya Hassas Aletler1B100-6Şirket Yeri: Sarasota, FL, ABD
BV10 İğne BevelerSutter InstrumentsBV-10-BŞirket Yeri: Nobato, CA, ABD
Whatman Dairesel filtre kağıdı (12,5 cm)Sigma AldrichWHA1001125Şirket Yeri: St. Louis, MO, ABD
Konik tüp (50 mL)Thermo Fisher Scientific339652Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD
Hızlı akış hızına sahip Fisherbrand kurs filtre kağıdıThermo Fisher Scientific09-800Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD
Kapak camı (24 x 40 mm)Thermo Fisher Scientific50-311-20Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD
Diş barajıHenry Schein Inc1010171Şirket Yeri: Melville, NY ABD
Scotch çift taraflı bantThermo Fisher ScientificNC0879005Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD
FemtoJet 4i mikroenjektörEppendorf5252000021Şirket Konumu: Hamburg, Almanya
Cam şişe (2 dram)Thermo Fisher Scientific033401CŞirket Yeri: Waltham, MA, ABD
Halokarbon yağıSigma AldrichH8898-50MLŞirket Yeri: St. Louis, MO, ABD
P-2000 Lazer İğne ÇektirmeSutter InstrumentsP-2000/GŞirket Yeri: Nobato, CA, ABD
ParafilmThermo Fisher Scientific50-998-944Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD
PC-100 Ağırlıklı İğne ÇektirmeNarishigePC-100Bu, üretimi durdurulan önceki PC-10 modeliyle uyumludur. Şirket Yeri: Amityville, NY, ABD
Phire Doğrudan PCR KitiThermo Fisher ScientificF140WHŞirket Yeri: Waltham, MA, ABD
Kodak Photo-Flo (%1)Thermo Fisher Scientific50-268-05Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD
Kuvars cam mirokapiller tüpler, 1 mm dış çapKılcal Boru Malzemeleri LimitedQGCT 1.0Şirket Yeri: Cornwall, İngiltere
Rehberlik ve ticaret; sgRNA Tarama KitiTakara, Bio USA632639Bu kit, gRNA'ların DNA dizilerini in vitro olarak kesip kesmediğini belirlemenizi sağlar. Şirket Yeri: Mountain View, CA, ABD
Sigmacote SigmaAldrichSL2-100MLŞirket Yeri: St. Louis, MO, ABD
Küçük petri kapları (35X10 mm)Thermo Fisher Scientific50-190-0273Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD
Sodyum sitrat tavukkanı Lampire biyolojikleri7201406Şirket Yeri: Everett, PA, ABD
Fisherbrand Kare petri kabı (10 cm x 10 cm)Thermo Fisher ScientificFB0875711AŞirket Yeri: Waltham, MA, ABD
TegadermHenry Schein Inc.7771180Şirket Yeri: Melville, NY ABD
Tropikal balık yemiTetraminN/A
Whatman filtre kağıdıThermo Fisher Scientific09-927-826Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD
Whatman filtre kağıdı, 4.25 cmSigma Aldrich1001-042Şirket Yeri: St. Louis, MO, ABD

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
  2. Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
  3. Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
  4. Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
  5. Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
  6. Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
  7. Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
  8. Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
  9. Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
  10. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
  11. Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
  12. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  13. Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
  14. Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652(2016).
  15. Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
  16. Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
  17. Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
  18. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  19. Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
  20. Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
  21. Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
  22. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  23. Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
  24. Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  25. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  26. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  27. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Embriyo MikroenjeksiyonuGen NakavtSivrisinek Embriyosu Haz rlamaEnjeksiyon nesi Tekni iGerm hatt Mutasyon TaramasKuzey Ev Sivrisine iCas9 gRNA KompleksiEmbriyo Sa kal m Oran

İlgili makaleler