İki Boyutlu Kromatografi ve Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş 16-plex Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Yüksek Verimli ve Derin Proteom Profili Oluşturma

Zhen Wang; Kanisha Kavdia; Kaushik  Kumar Dey; Vishwajeeth  Reddy Pagala; Kiran Kodali; Danting Liu; Dong  Geun Lee; Huan Sun; Surendhar  Reddy Chepyala; Ji-Hoon Cho; Mingming Niu; Anthony  A. High; Junmin Peng

doi:10.3791/61684

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İki Boyutlu Kromatografi ve Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş 16-plex Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Yüksek Verimli ve Derin Proteom Profili Oluşturma

5.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61684

⸱

18 Ağustos 2020

Zhen Wang^*¹ , Kanisha Kavdia^*² , Kaushik Kumar Dey¹ , Vishwajeeth Reddy Pagala² , Kiran Kodali² , Danting Liu¹ , Dong Geun Lee¹ , Huan Sun¹ , Surendhar Reddy Chepyala¹ , Ji-Hoon Cho² , Mingming Niu¹ , Anthony A. High² , Junmin Peng¹^,²

¹Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, ²Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, biyolojik numunelerin kantitatif proteom profilinin çıkarılmasını sağlayan 16-plex tandem kütle etiketi reaktifleri ile geliştirilen, optimize edilmiş yüksek verimli bir protokol sunulmaktadır. Kapsamlı bazik pH fraksiyonlaması ve yüksek çözünürlüklü LC-MS/MS, oran sıkışmasını azaltır ve derin proteom kapsamı sağlar.

Özet

İzobarik tandem kütle etiketi (TMT) etiketlemesi, yüksek çoğullama kapasitesi ve derin proteom kapsamı nedeniyle proteomikte yaygın olarak kullanılmaktadır. Son zamanlarda, proteomik çalışmaların verimini daha da artıran genişletilmiş bir 16-plex TMT yöntemi tanıtıldı. Bu yazıda, protein numunesi hazırlama, enzimatik sindirim, TMT etiketleme reaksiyonu, iki boyutlu ters fazlı sıvı kromatografisi (LC/LC) fraksiyonlaması, tandem kütle spektrometresi (MS/MS) ve hesaplamalı veri işleme dahil olmak üzere 16 pleks TMT tabanlı derin proteom profili oluşturma için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. 16-plex TMT analizine özgü önemli kalite kontrol adımları ve süreçteki iyileştirmeler vurgulanmaktadır. Bu çoğullanmış işlem, hücreler, dokular ve klinik örnekler gibi çeşitli karmaşık örneklerin profilini çıkarmak için güçlü bir araç sunar. 16 farklı numuneden elde edilen oldukça karmaşık biyolojik numunelerde 10.000'den fazla protein ve fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon ve ubikitinasyon gibi posttranslasyonel modifikasyonlar tek bir deneyde ölçülebilir ve bu da temel ve klinik araştırmalar için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

Kütle spektrometresi teknolojisindeki hızlı gelişmeler, proteomik uygulamalarda yüksek hassasiyet ve derin proteom kapsamı elde edilmesini sağlamıştır ^1,2. Bu gelişmelere rağmen, örnek çoğullama, büyük bir örnek kohortunun analizini yürüten araştırmacılar için darboğaz olmaya devam etmektedir.

Çoğullanmış izobarik etiketleme teknikleri, büyük numune^{gruplarının} ^3,4,5,6 proteom çapında nispi nicelemesi için yaygın olarak kullanılmaktadır.