Yöntem makalesi

İki Boyutlu Kromatografi ve Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş 16-plex Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Yüksek Verimli ve Derin Proteom Profili Oluşturma

DOI:

10.3791/61684

⸱

18 Ağustos 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, biyolojik numunelerin kantitatif proteom profilinin çıkarılmasını sağlayan 16-plex tandem kütle etiketi reaktifleri ile geliştirilen, optimize edilmiş yüksek verimli bir protokol sunulmaktadır. Kapsamlı bazik pH fraksiyonlaması ve yüksek çözünürlüklü LC-MS/MS, oran sıkışmasını azaltır ve derin proteom kapsamı sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İzobarik tandem kütle etiketi (TMT) etiketlemesi, yüksek çoğullama kapasitesi ve derin proteom kapsamı nedeniyle proteomikte yaygın olarak kullanılmaktadır. Son zamanlarda, proteomik çalışmaların verimini daha da artıran genişletilmiş bir 16-plex TMT yöntemi tanıtıldı. Bu yazıda, protein numunesi hazırlama, enzimatik sindirim, TMT etiketleme reaksiyonu, iki boyutlu ters fazlı sıvı kromatografisi (LC/LC) fraksiyonlaması, tandem kütle spektrometresi (MS/MS) ve hesaplamalı veri işleme dahil olmak üzere 16 pleks TMT tabanlı derin proteom profili oluşturma için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. 16-plex TMT analizine özgü önemli kalite kontrol adımları ve süreçteki iyileştirmeler vurgulanmaktadır. Bu çoğullanmış işlem, hücreler, dokular ve klinik örnekler gibi çeşitli karmaşık örneklerin profilini çıkarmak için güçlü bir araç sunar. 16 farklı numuneden elde edilen oldukça karmaşık biyolojik numunelerde 10.000'den fazla protein ve fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon ve ubikitinasyon gibi posttranslasyonel modifikasyonlar tek bir deneyde ölçülebilir ve bu da temel ve klinik araştırmalar için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi teknolojisindeki hızlı gelişmeler, proteomik uygulamalarda yüksek hassasiyet ve derin proteom kapsamı elde edilmesini sağlamıştır 1,2. Bu gelişmelere rağmen, örnek çoğullama, büyük bir örnek kohortunun analizini yürüten araştırmacılar için darboğaz olmaya devam etmektedir.

Çoğullanmış izobarik etiketleme teknikleri, büyük numunegruplarının 3,4,5,6 proteom çapında nispi nicelemesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Tandem kütle etiketleri (TMT) tabanlı nicelik, yüksek çoğullama kapasitesi 7,8 nedeniyle popüler bir seçimdir. TMT reaktifleri başlangıçta aynı anda 6 numuneye kadar nicelik tayini yapabilen 6 katlı bir kit olarak piyasaya sürüldü9. Bu teknoloji, 10-11 numuneyi10,11 ölçmek için daha da genişletildi. Yakın zamanda geliştirilen 16-plex TMTpro (bundan sonra TMT16 olarak anılacaktır) reaktifleri, çoğullama kapasitesini tek bir deneyde16 örneğe daha da artırmıştır 12,13. TMT16 reaktifleri, prolin bazlı bir raportör grubu kullanırken, 11-plex TMT, dimetilpiperidin türevi bir raportör grubu uygular. Hem TMT11 hem de TMT16 aynı amin reaktif grubunu kullanır, ancak TMT16'nın kütle denge grubu TMT11'inkinden daha büyüktür ve raportör iyonlarındaki 8 kararlı C13 ve N15 izotopunun kombinasyonunun 16 raportör elde etmesini sağlar (Şekil 1).

Çoğullama yeteneğindeki artış, istatistiksel zorlukların üstesinden gelmek için yeterli tekrarlara sahip deneyler tasarlamak için bir platform sağlar14. Ayrıca, 16-plex TMT'deki ek kanallar, kanal başına toplam başlangıç materyali miktarını azaltmaya yardımcı olur, bu da ortaya çıkan tek hücreli proteomiklerin15 geliştirilmesine yardımcı olabilir. Yüksek çoğullama kapasitesi, tipik olarak yüksek miktarda başlangıç materyaligerektiren translasyon sonrası modifikasyonların niceliklendirilmesinde de değerli olacaktır 16,17.

TMT teknolojisini kullanan proteomik iş akışları 18,19,20 kolaylaştırıldı ve numune hazırlama, sıvı kromatografi ayırma, kütle spektrometrik veri toplama ve hesaplamalı analiz açısından son on yılda önemli ölçüde gelişti 21,22,23,24,25,26. Önceki makalemiz, 10-plex TMT platformu27'ye derinlemesine bir genel bakış sunmaktadır. Burada açıklanan protokol, protein ekstraksiyonu ve sindirimi, TMT16 etiketlemesi, numune havuzu ve tuzdan arındırma, bazik pH ve asidik pH ters faz (RP) LC, yüksek çözünürlüklü MS ve veri işleme dahil olmak üzere TMT16 için ayrıntılı, optimize edilmiş bir yöntem sunar (Şekil 2). Protokol ayrıca, kantitatif bir proteomik deneyini başarıyla tamamlamak için dahil edilen temel kalite kontrol adımlarını da vurgulamaktadır. Bu protokol, biyolojik yolları, hücresel süreçleri ve hastalığın ilerlemesini incelemek için yüksek tekrarlanabilirliğe sahip 10.000'den fazla proteini tanımlamak ve ölçmek için rutin olarak kullanılabilir 20,28,29,30.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma için insan dokuları, Banner Sun Sağlık Araştırma Enstitüsü'ndeki Beyin ve Vücut Bağışı Programı'ndan alınan onaylarla elde edildi.

1. Dokudan protein ekstraksiyonu ve kalite kontrol

NOT: Numune toplamanın proteom üzerindeki etkisini azaltmak için, mümkünse düşük sıcaklıkta minimum sürede numune toplamak çok önemlidir31. Bu, tipik olarak kararsız oldukları için posttranslasyon modifikasyonlarını analiz ederken özellikle önemlidir, örneğin, bazı fosforilasyon olaylarının yalnızca birkaç saniyelik yarı ömrüvardır 32,33.

  1. Doku örneklerini eksize edin ve tartın
    1. Analitik terazi kullanarak 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün darasını alın ve tüpü kuru buz üzerinde önceden soğutun.
    2. Tanımlanmış bir bölgeden donmuş bir dokuyu (örneğin, insan beyin dokusu, ~ 10 mg) küçük parçalara kesin ve doku parçalarını hemen önceden soğutulmuş tüpe aktarın.
      NOT: Numune heterojenliğini azaltmak için, 16 numunenin tümü için homojen boyutlar ve anatomik bölgeler kullanmak önemlidir. Dokudan elde edilen protein miktarı tipik olarak doku ağırlığının %5-10'u kadardır.
    3. Tüpü doku ile birlikte tartın ve tüpü hemen kuru buzun üzerine koyun. Kalan 15 numuneyi de aynı prosedürü kullanarak işleyin. Numuneleri diseksiyondan hemen sonra kuru buzda saklayın ve ˗80 °C'de saklayın.
  2. Lyse doku örnekleri
    1. Deney günü taze lizis tamponu (50 mM HEPES pH 8.5, 8 M üre ve% 0.5 sodyum deoksikolat) hazırlayın. Proteinlerin fosforilasyon durumunu korumak için fosfataz inhibitörleri lizis tamponuna eklenmelidir.
      NOT: Lizis tamponunu kullanmadan önce oda sıcaklığına koyun, çünkü 8 M üre buz üzerinde çökelir, bu da numune lizisi sırasında eksik protein denatürasyonuna neden olabilir ve protein sindirim verimliliğini azaltabilir.
    2. Her numuneye lizis tamponu (5 ila 10 μg / μL'lik bir nihai protein konsantrasyonu elde etmek için 10 mg doku başına 100 μL lizis tamponu ekleyin) ve cam boncuklar (lizat hacminin ~% 20'si, 0.5 mm çap) ekleyin.
    3. Dokuyu 4 ° C'de 30 saniye boyunca 8 hız ayarı ile bir karıştırıcıda parçalayın, 5 saniye dinlendirin, numuneler homojenize olana kadar tekrarlayın (~ 5 döngü).
  3. Lizatların alikotlarını hazırlayın.
    1. Her numune için en az iki alikot hazırlayın. Protein konsantrasyonunun analizi ve protein kalitesinin değerlendirilmesi için küçük bir alikot (~ 10 μL) kullanılır (örneğin, pozitif kontrol proteinlerinin batı blot doğrulaması). Proteom analizi için daha büyük bir alikot (~ 50 μL) kullanılır.
    2. Alikotları hemen kuru buz üzerinde dondurun ve daha fazla kullanılana kadar -80 ° C'de saklayın.
  4. Protein konsantrasyonunu ölçün
    NOT: Protein konsantrasyonu, BCA testi veya kısa SDS jel boyama yöntemi34 (Şekil 3A) ile ölçülebilir. Doku lizatındaki protein indirgeyici olmayan bileşenler BCA testindeki ölçümü etkileyebileceğinden, kullanıcılar kısa SDS jel boyama yöntemi ile protein konsantrasyonunu doğrulayabilir. Kısa SDS jel boyama yöntemi burada sunulmuştur.
    1. 16 aliquoted numuneyi 10 kat seyreltin ve BSA standardını hazırlayın (örneğin, 0,15, 0,5, 1,5 ve 3 μg'lık BSA titrasyonları).
    2. Numuneleri ve BSA standardını, tüm proteinler jelin içine yaklaşık 3 mm göç edene kadar bir istifleme jeli ile %10'luk bir SDS-PAGE jel (26 oyuklu) üzerinde çalıştırın.
    3. Jeli Coomassie mavisi ile 1 saat boyayın ve boş bölgedeki arka plan netleşene kadar jeli lekeden arındırın.
    4. ImageJ ile Coomassie lekeli protein bantlarının yoğunluklarını ölçmek için jeli tarayın ve ölçümlere göre bir BSA standart eğrisi oluşturun.
    5. Standart eğri ile mutlak protein konsantrasyonunu hesaplayın.
      NOT: Bu deneydeki her numune için nihai protein konsantrasyonu ~5-10 μg/μL idi. TMT16 bazlı proteomik analiz için numune başına 50 μg protein (tüm proteom analizi için toplam 0.8 mg protein) yeterlidir.
  5. Numune kalite kontrolü
    NOT: Bu kalite kontrol adımı, TMT analizini gerçekleştirmeden önce düşük kaliteli numuneleri belirlemek için kritik öneme sahiptir. Bilinen protein değişikliğine sahip numuneler için, değişikliğin western blotlama ile doğrulanması önerilir. Protein modellerini incelemek ve yüksek derecede bozunmaya sahip numuneleri dışlamak için standart SDS-PAGE analizi de önerilir (Şekil 3B).
    1. Küçük alikottan her numuneden ~ 10 μg alın ve numuneleri bromofenol mavisi boya jelin dibine ulaşana kadar gradyan bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırın.
    2. Jeli Coomassie mavisi ile boyayın ve jeli lekeden arındırın. Yüksek derecede bozulmuş protein örneklerini çıkarmak için protein kalitesini inceleyin.
      NOT: Bozulmuş numuneler, yüksek moleküler ağırlıklı bölgede çok az protein bandına ve düşük moleküler ağırlıklı bölgede yoğunlaştırılmış bantlara sahip olan numuneler olarak tanımlanabilir (Şekil 3B).

2. Çözelti içi protein sindirimi, peptit indirgeme ve alkilasyon, sindirim verimliliği testi ve peptit tuzdan arındırma

  1. Lys-C ve tripsin ile protein sindirimi
    1. Her numunenin büyük alikotundan ~ 50 μg protein alın ve 50 μL'ye lizis tamponu ekleyin.
    2. %10'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için %100 asetonitril (ACN) ekleyin.
    3. Lys-C sindirimini, 100:1 (a/a) protein:Lys-C oranında Lys-C ekleyerek ve oda sıcaklığında 3 saat inkübe ederek gerçekleştirin.
    4. Numuneler, 2 M üre ile 50 mM HEPES (pH 8.5) nihai konsantrasyonunu içerecek şekilde seyreltilir.
    5. Her numuneye 50: 1 (a / a) protein: tripsin oranında tripsin ekleyin ve sindirimi oda sıcaklığında 3 saat veya gece boyunca gerçekleştirin.
  2. Peptit indirgeme ve alkilasyon
    1. Taze hazırlanmış ditiotreitol (1 M DTT) çözeltisini son 1 mM konsantrasyona ekleyin ve disülfid bağlarını azaltmak için oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    2. Sistein kalıntılarını alkillemek için karanlıkta 30 dakika boyunca son 10 mM konsantrasyona taze hazırlanmış iyodoasetamid (1 M IAA) çözeltisi ekleyin.
    3. Son 30 mM konsantrasyona 1M DTT ekleyerek reaksiyona girmemiş IAA'yı söndürün ve oda sıcaklığında 30 dakika daha inkübe edin.
  3. Sindirim verimliliğini inceleyin
    1. Her numuneden ~1 μg alın ve üreticinin protokolüne göre C18 reçine kaplı pipet uçları kullanarak tuzdan arındırın.
    2. Her örneği kısa bir gradyan LC-MS/MS çalıştırması ile analiz edin (5. adımda daha fazla ayrıntıya bakın).
    3. MS ham verileri için bir veritabanı araması yapın (6. adımda daha fazla ayrıntıya bakın). En az bir tripsin miscleavage bölgesi ile tanımlanan peptitlerin yüzdesini hesaplayın. Yüzde genellikle %15'in altındadır.
    4. Yüzde %15'ten büyükse, sindirimi tekrarlamak için numunelere ilave tripsin ekleyin.
    5. Sindirimden sonra, %0,5'e (h/h) TFA ekleyerek numuneleri asitleştirin. PH'ın 3'ten düşük olduğundan emin olmak için pH'ı bir pH şeridi ile kontrol edin.
  4. Peptit tuzdan arındırma
    1. Asitleştirilmiş peptitleri 10 dakika boyunca 21.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanları yeni bir tüpe aktarın.
    2. C18 tuzdan arındırma kolonlarını (~25 μL reçine) 250 μL %100 metanol ile 500 x g'da 30 saniye santrifüjleyerek iki kez yıkayın.
      NOT: Tuzdan arındırma işlemi sırasında peptit kaybını azaltmak için, girdi miktarına uygun bağlama kapasitesine sahip tuzdan arındırma kolonlarını seçin.
    3. Kolonları 250 μL elüsyon tamponu (%60 ACN, %0.1 TFA) kullanarak 500 x g'da 30 saniye santrifüjleyerek iki kez yıkayın.
    4. Kolonları 250 μL dengeleme ve yıkama tamponu (%0.1 TFA) ile 30 saniye boyunca 500 x g'da santrifüjleyerek iki kez dengeleyin.
    5. Numuneleri önceden dengelenmiş sütunlara yükleyin. Numunelerin 6 dakika boyunca 100 x g'da döndürerek sütunlara bağlanmasına izin verin. Tüm çözümün sütundan geçtiğinden emin olun.
    6. Kolonları 250 μL dengeleme ile üç kez yıkayın ve 30 saniye boyunca 500 x g'da santrifüjleyerek tamponu yıkayın.
    7. Her sütuna 125 μL elüsyon tamponu ekleyerek ve 3 dakika boyunca 100 x g'da döndürerek peptitleri elute edin. Sütunun herhangi bir artık çözelti içermediğini kontrol edin.
    8. Ayrıştırılmış peptitleri bir vakum yoğunlaştırıcıda kurutun ve gelecekteki TMT etiketlemesi için peptitleri -80 ° C'de saklayın.

3. Peptitlerin TMT16 etiketlemesi, etiketleme verimliliği testi, numune havuzu ve etiketli peptit tuzdan arındırma

  1. Peptitlerin TMT16 etiketlenmesi
    1. Her tuzdan arındırılmış peptit örneğini 50 μL 50 mM HEPES (pH 8.5) içinde birkaç kez girdaplama veya ultrasonik çözme ve ardından pH'ı doğrulamak için bir pH şeridi kullanarak yeniden süspanse edin.
      NOT: Etiketlemeden önce tamamen kurutulmazsa numune asidik olabilir ve bu da etiketleme verimliliğini olumsuz etkiler. PH'ın 7 ile 8 arasında olduğundan emin olun.
    2. TMT etiketleme verimliliği testi için negatif kontroller olarak her numuneden ~ 1 μg etiketlenmemiş peptit alın.
    3. TMT16 reaktiflerini susuz ACN'de çözün. Reaktifleri 1.5:1 (a/a) TMT:protein oranında ekleyerek ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ederek etiketleme reaksiyonunu gerçekleştirin.
      NOT: TMT16 için kullanılan TMT:protein oranı, TMT11 için kullanılan orandan %50 daha yüksektir. Bu küçük tutarsızlık, TMT16'nın moleküler kütlesinin TMT11 reaktiflerininkinden daha büyük (1,2 kat) olmasından kaynaklanıyor olabilir. Protein miktarı, tuzdan arındırma sırasındaki kayıp dikkate alınmadan numunelerden tahmin edilir.
  2. Etiketleme verimliliği testi
    1. Etiketleme verimliliği testi için her numuneden ~ 1 μg etiketli peptit alın. Kalan numuneleri reaksiyonu söndürmeden -80 °C'ye koyun.
    2. TMT16 etiketli ve etiketsiz numunelerin her birini üreticinin protokolüne göre C18 reçine kaplı pipet uçları ile ~1 μg tuzdan arındırın.
    3. Örnekleri LC-MS/MS ile analiz edin (gradyanın 10 dakika olması dışında bölüm 5'e bakın).
    4. Etiketlenmemiş ve etiketlenmiş numuneler arasındaki etiketlenmemiş peptitlerin MS1 yoğunluk azaltımını analiz ederek etiketleme verimliliğini tahmin edin. Tüm peptitlerin etiketlendiğinden emin olmak için etiketleme verimliliğini doğrulamak için 6 ila 10 farklı peptit seçin.  Tam etiketleme için, etiketlenmemiş peptitler gözlenmez.
      NOT: Aşağı yönde doğru protein tanımlaması ve miktar tayini için tüm numunelerin tam olarak etiketlenmesini sağlamak önemlidir.
    5. Etiketleme tamamlanmadıysa, kalan peptitleri etiketlemek için ek TMT reaktifleri ekleyin ve su vermeden önce etiketleme verimliliğini tekrar kontrol edin. Numune tamamen etiketlendikten sonra, son %0.5'lik konsantrasyona hidroksilamin ekleyerek reaksiyonu oda sıcaklığında söndürün ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  3. Numune havuzu ve tuzdan arındırma
    1. Bir karışım yapmak için her TMT etiketli numunenin yarısını bir araya getirin.
    2. Karışımdan 1 μg alın ve C18 reçine kaplı pipet uçlarıyla tuzdan arındırın, ardından kısa bir gradyan (~ 30 dakika) kullanarak LC-MS/MS ile analiz edin.
    3. Her bir TMT16 raportör iyonunun ortalama yoğunluğunu kullanarak ve 16 kanal arasındaki tutarsızlıkları karşılaştırarak bağıl konsantrasyonu hesaplayın. Her kanalın eşit şekilde karıştırılmasını sağlamak için, TMT etiketli numunelerin geri kalanını hesaplanan ortalama yoğunluğa göre karışıma ekleyin. Tüm numuneler eşit şekilde karışana kadar ayarlamayı tekrarlayın. Örnek havuzlama sürecini gösteren temsili veriler Tablo 1'de gösterilmektedir.
      NOT: Pipetleme hataları, konsantrasyonların doğruluğunu ve protein miktarını etkileyebileceğinden, havuzlama miktarının doğru şekilde sağlanması önemlidir. 16 numune arasındaki yoğunluk farklılıkları %5'ten az olmalıdır.
  4. Etiketli peptit tuzdan arındırma
    NOT: TMT16 etiketleme reaksiyonundaki arka plan türevleri (örneğin, hidroksilamin söndürme reaksiyonundan TMTpro-NHOH ve TMT hidroksilasyonundan TMTpro-OH) hidrofobik olduğundan, türevleri etkili bir şekilde çıkarmak için TMT16 etiketli numuneler için kapsamlı bir yıkama koşulu kullanılır. Normal yıkama tamponuna %5 ACN ilavesi (%0,1 TFA) ve 10x yatak hacminde yıkama tamponu kullanılır.
    1. pH < 3'e %10 TFA ekleyerek havuzlanan numuneyi asitleştirin.
    2. Havuzlanmış numuneyi 21.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe koyun.
    3. ACN'yi çıkarmak için numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.
    4. 50 mg sorbent sütunu içeren bir katı faz ekstraksiyon kartuşunu, sütunu 2 mL %100 metanol ve ardından 2 mL elüsyon tamponu (%60 ACN artı %0.1 TFA) ve son olarak 2 mL yıkama tamponu (%0.1 TFA) ile yıkayarak ön koşullandırın.
    5. Örneği sütuna yükleyin. Peptit bağlanmasının tam kapsamını sağlamak için akış hızını ~ 100 μL / dk'ya ayarlayın. Akışı kaydedin.
    6. Kolonu 1 mL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
    7. 1 mL elüsyon tamponu ile elute peptitler.
    8. Ayrıştırılmış peptitleri bir vakum yoğunlaştırıcıda kurutun ve daha fazla fraksiyonlama için peptitleri -80 ° C'de saklayın.

4. Çevrimdışı bazik pH LC ön fraksiyonasyonu

  1. Fraksiyonlama sistemi hazırlığı
    1. Mikrolitre akışlı yüksek performanslı LC sistemi için tampon A (10 mM amonyum format, pH 8.0) ve tampon B'yi (10 mM amonyum format, %90 ACN, pH 8.0) hazırlayın.
    2. Fraksiyonlama için mikrolitre akışlı yüksek performanslı LC sisteminde köprülü etilen hibrit parçacıkları (3,5 μm partikül boyutu, 4,6 mm × 25 cm) içeren bir HPLC sütunu kurun.
    3. 100 μL'lik bir numune döngüsü takın ve döngüyü sırayla 300 μL metanol, su ve tampon A ile yıkayın.
    4. Sütunu yıkamak için 100 μL 1:1:1:1 oranında izopropanol: metanol: asetonitril: su kullanın. Ardından, sütunu A tamponunun% 95'inde 0,5 saat boyunca daha da dengeleyin.
  2. Numune hazırlama
    1. Havuzlanmış ve tuzdan arındırılmış TMT16 numunesini 70 μL tampon A'da çözün. Numune pH'ının ~ 8.0 olduğunu onaylayın. Hala asidik ise, %28 amonyum hidroksit (NH4OH) kullanarak pH'ı 8.0'a ayarlayın.
      NOT: Numune kaybını önlemek için numune hacmi, döngü hacminin %70'inden az olmalıdır.
    2. Çökeltileri gidermek için numuneyi 21.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  3. Fraksiyonlama ve birleştirme
    NOT: Gerçek numune ayrıştırmasından önce, LC sisteminin iyi durumda olduğundan emin olmak için bir pilot deney şiddetle tavsiye edilir. Bu, gerçek numunenizin küçük bir miktarıyla (~% 5) veya TMT etiketli olmayan bir peptit karışımı ile gerçekleştirilebilir.
    1. Numuneyi enjekte edin ve aşağıdaki gradyanla fraksiyonlayın: 10 dakika boyunca %5 tampon B, 2 dakika boyunca %5-15 tampon B, 148 dakika boyunca %15-45 tampon B ve 5 dakika boyunca %45-95 tampon B. 0,4 mL/dk'lık bir akış hızı kullanın.
    2. Kesir toplayıcıyı her 1 dakikada bir kesirleri toplayacak ve 160 kesri 4 döngüde 40 kesire birleştirecek şekilde ayarlayın.
      NOT: Birleştirme, aynı zaman iç kısımlarından ayrıştırılan erken, orta ve geç LC fraksiyonlarının birleştirilmiş bir fraksiyonda birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Birleştirilmiş fraksiyonlar, LC'nin birinci boyutunda çok az örtüşmeye sahiptir, bu nedenle ikinci boyut LC'de elüsyon penceresinin verimli kullanımını arttırır. Ek olarak, birkaç birleştirme turu yoluyla, peptitler tüm birleştirilmiş fraksiyonlar boyunca eşit olarak dağıtılabilir. Bu yaklaşımın, bireysel fraksiyonlarınanalizine kıyasla proteom kapsamını arttırdığı gösterilmiştir 35,36.
    3. Tüm birleştirilmiş fraksiyonları bir vakum yoğunlaştırıcıda kurutun ve daha fazla LC-MS/MS analizi için kurutulmuş numuneleri -80 °C'de saklayın.

5. Asidik pH RPLC-MS/MS analizi

  1. Asidik pH RPLC-MS/MS sistem hazırlığı
    1. 10-15 cm uzunluğunda 1,9 μm C18 reçine içeren boş bir sütunu (15 μm uç deliği ile 75 μm ID) paketleyin.
    2. Karşı basıncı azaltmak için bir kelebek portföy ısıtıcısı kullanarak sütunu 65 °C'de ısıtın.
    3. Sütunu %95 tampon B (%3 dimetil sülfoksit, %0.2 formik asit ve %67 ACN) ile iyice yıkayın. Ardından, sütunu %95 tampon A (%3 dimetil sülfoksit ve %0.2 formik asit) içinde tamamen dengeleyin.
    4. Deneysel numuneleri analiz etmeden önce 100 ng sıçan beyni peptitleri veya BSA peptitleri çalıştırarak LC-MS/MS sisteminin performansını kontrol edin.
  2. Birleştirilmiş fraksiyonların LC-MS/MS analizi
    1. Kurutulmuş peptitleri bazik pH fraksiyonlarından% 5 FA'da sulandırın ve 5 dakika boyunca 21.000 × g'da santrifüjleyin. Her numunenin süpernatantını bir HPLC flakon ekine aktarın.
    2. Her fraksiyonun ~ 1 μg peptitlerini kolona yükleyin. Peptitler, 60 dakikalık bir %18-45 tampon B gradyanı ile 0.25 μL/dk akış hızında ayrıştırılır.
      NOT: Yüksek kimlik numaraları elde etmek için, bir kesir çalıştırın ve ilk çalıştırmaya göre kalan kesirler için gradyanı ayarlayın. En iyi gradyan, tüm gradyan boyunca eşit olarak dağılmış peptitlere sahip olmalıdır (Şekil 4A).
    3. TMT16 etiketli numunelerin analizi için kütle spektrometresini aşağıdaki parametrelerle çalıştırın: MS1 taramaları (tam MS tarama aralığı: 450-1600 m/z; Orbitrap çözünürlüğü: 60.000; otomatik kazanç kontrol hedefi: 1 x 106; maksimum iyon süresi: 50 ms) ve 20 veriye bağlı MS2 taraması (Orbitrap çözünürlüğü: 60.000; AGC hedefi: 1 x 105; maksimum iyon süresi: 110 ms; HCD normalleştirilmiş çarpışma enerjisi:% 32; izolasyon penceresi: 1,0 m/z; İzolasyon ofseti: 0,2 m/z; Dinamik dışlama: 10 sn).
      NOT: Burada kullanılan parametreler tek bir kütle spektrometresi türünde optimize edilmiştir (Malzeme Tablosuna bakınız). Farklı MS cihazları için kullanıcılar, yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için cihaz parametrelerine ince ayar yapmalıdır. Optimum enerji, cihazlar arasında ve TMT11 ile TMT16 arasında değişebileceğinden, bir ayar normalleştirilmiş HCD çarpışma enerjisini izlemektir.

6. Veri işleme

NOT: Veri analizi, hibrit bir veritabanı arama motoru (desen ve etiket tabanlı), tanımlanan peptitlerin/proteinlerin yanlış keşif oranını (FDR) kontrol eden filtreleme yazılımı ve TMT veri kümeleri için niceleme yazılımı içeren bir JUMP yazılım paketi37,38,39 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bir kullanıcının durumuna bağlı olarak, veri analizi diğer ticari veya ücretsiz olarak kullanılabilen programlar kullanılarak yapılabilir.

  1. Veritabanı araması
    1. MS cihazından .raw dosyalarını .mzXML dosyalarına dönüştürün ve tanımlanan proteinlerin FDR'sini hesaplamak için UniProt insan protein dizilerinden (veya başka bir uygun türe özgü veritabanından) oluşturulan yedekli olmayan bir hedef tuzak veritabanına40 karşı MS2 spektrumlarını arayın.
      NOT: Swiss-Prot ve TrEMBL veritabanlarından protein dizilerini birleştirerek yedekli olmayan veritabanını oluşturun. Proteaz parçalanmış proteinler, tek nükleotid polimorfizmlerine sahip proteinler ve yaygın kirleticiler dahil olmak üzere bu referans veritabanlarında bulunmayan özelleştirilmiş protein dizileri de eklenebilir.
    2. Aşağıdaki parametreleri kullanarak arama yapın. Öncü için kütle toleransı: 10 ppm; ürün iyonları için kütle toleransı: 15 ppm; maksimum kaçırılan bölünmeler: 2; Maksimum Değişiklik Siteleri: 3; statik modifikasyonlar: Lys kalıntıları üzerindeki TMT16 etiketleri için 304.20715 Da ve Cys kalıntıları üzerindeki karbamidometilasyon için N terminali, 57.02146 Da; dinamik modifikasyon: Met'te oksidasyon için 15.99492 Da.
  2. Arama sonuçlarını filtreleme
    1. Elde edilen peptit spektrum eşleşmelerini (PSM'ler) peptit uzunluğuna (>6 amino asit), öncü iyonun kütle doğruluğuna ve JUMP tabanlı eşleştirme puanlarına (Jscore ve ΔJn) göre filtreleyin. Peptitler daha sonra peptit uzunluğuna, triptik uçlara, modifikasyonlara, kaçırılan bölünme bölgelerine ve şarj durumuna göre gruplandırılır.
    2. Protein (tam proteom analizi) veya peptit (fosfoproteom analizi) seviyesinde %1'in altında bir FDR elde etmek için verileri eşleşen puanlarla daha fazla filtreleyin.
      NOT: Filtreleme adımlarında pozitif kontrol peptitleri/proteinleri eksikse, bu peptitlerin/proteinlerin kurtarılabilmesi için FDR makul bir seviyeye yükseltilebilir.
    3. Bir protein ailesinin birden fazla üyesi tarafından paylaşılan peptitler için, eşleşen üyeleri tek bir grupta kümeleyin.
      NOT: Cimrilik kuralı ile grup, en fazla sayıda paylaşılan peptit ve benzersiz peptitlerle eşleşen diğer proteinlere sahip homolog protein ile temsil edilir.
  3. Protein miktar tayini
    1. Eşleşen tüm PSM'lerdeki TMT raportör iyon yoğunluklarını özetlemek için yerleşik bir istatistiksel yazılım paketi programı kullanarak proteinleri ölçün.
    2. Kabul edilen her PSM'den TMT raportör iyon yoğunluklarını çıkarın ve her bir etiketleme reaktifinin izotopik dağılımına göre ham yoğunlukları düzeltin (örneğin, TMT16-126 sırasıyla 126, 127C ve 128C m/z iyonlarının %92,6, %7,2 ve %0,2'sini üretir) ve kullanıcı tanımlı eşikler temelinde düşük yoğunluklu ve/veya çok gürültülü PSM'leri filtreleyin. Yükleme yanlılığını düzeltmek için numunelerin kırpılmış ortalama (veya medyan) yoğunluklarını kullanarak nicelik verilerini normalleştirin.
    3. Tanımlanan her protein için, eşleşen PSM'lerin numuneleri arasındaki ortalama merkezli yoğunlukları (yani nispi yoğunlukları) hesaplayın ve numune bazında ortalama alarak PSM'lerin nispi yoğunluklarını özetleyin. En bol eşleşen üç PSM'nin genel ortalama yoğunluğunu çarparak göreceli sinyalleri mutlak sinyallere dönüştürün.
    4. Y1 iyon yoğunluğunun raportör iyon yoğunluğu ile ilişkili olduğunu varsayan daha önce bildirilen bir y1 iyon düzeltme yaklaşımı37 kullanılarak doğru niceleme girişimi. Temiz taramalardan y1 ve raportör iyon yoğunlukları arasındaki doğrusal ilişkiyi tahmin ederek, gürültülü taramalarda kontamine y1 iyon yoğunluğundan kaynaklanan girişim seviyesi türetilir ve düzeltilir.
      NOT: TMT etiketli triptik peptitler için, K-TMT ve R kalıntıları, bir MS2 spektrumunda iki temsili y1 iyonudur (sırasıyla 376.27574 Da ve 175.11895 Da). Yalnızca bir y1 iyonu tespit edilirse ve tanımlanan peptit ile tutarlıysa, MS2'nin temiz bir tarama olduğu kabul edilir. Her iki y1 iyonu da algılanırsa, MS2 gürültülü bir tarama olarak kabul edilir.
    5. Daha fazla analiz için protein kantitasyon değerlerini bir elektronik tabloya aktarın. Örneklerin dağılımını keşfetmek için PCA veya kümeleme analizi gibi denetimsiz veri analizi yöntemlerini kullanın. Diferansiyel olarak ifade edilen proteinleri tanımlamak için, t-testi ve varyans analizi (ANOVA) gibi istatistiksel yöntemler kullanın.

7. MS veri doğrulaması

NOT: Zaman alıcı biyolojik deneyler yapmadan önce, MS verilerinin kalitesini değerlendirmek için en az bir doğrulama yöntemi kullanın.

  1. Peptit dizisini ve TMT raportör iyon yoğunluklarını doğrulamak için ilgilenilen proteinlerin MS / MS spektrumlarını manuel olarak inceleyin.
  2. Protein seviyelerindeki değişiklikleri doğrulamak için antikor bazlı yaklaşımlar (örneğin, western blotting veya immünohistokimya analizi) kullanın. Doğal peptitlerin varlığını doğrulamak için, dahili standartlar olarak sentetik peptitler kullanın. Peptitlerin MS / MS spektrumları ve LC-MS / MS sırasında tutma süresi aynı koşullar altında aynı olmalıdır.
  3. Protein değişikliklerini doğrulamak için hedefli bir MS yaklaşımı kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etiketleme reaksiyonu, tuzdan arındırma ve LC-MS koşulları dahil olmak üzere yeni geliştirilen TMT16 protokolü sistematik olarak optimize edilmiştir41. Ayrıca, aynı insan AD örneklerini analiz etmek için 11-plex ve 16-plex yöntemlerini kullanarak doğrudan karşılaştırdık41. TMT16 için temel parametrelerin optimizasyonundan sonra, hem TMT11 hem de TMT16 yöntemleri, > 10.000 insan proteininde 100.000 peptit > benzer proteom kapsamı, tanımlama ve miktar tayini sağlar.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TMT16 tabanlı derin proteom profillemesi için optimize edilmiş bir protokol, daha önceki yayınlarda başarıyla uygulanmıştır 12,13,41. Bu mevcut protokolle, 16 farklı numuneye kadar 10.000'den fazla benzersiz protein, tek bir deneyde yüksek hassasiyetle rutin olarak ölçülebilir.

Yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için protokol boyunca kritik adımlara dikkat etmek önem...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909 ve U54NS110435) ve ALSAC (Amerikan Lübnanlı Suriye İlişkili Hayır Kurumları) tarafından desteklenmiştir. MS analizi, kısmen NIH Kanser Merkezi Destek Hibesi (P30CA021765) tarafından desteklenen St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi'nin Proteomik ve Metabolomik Merkezi'nde gerçekleştirildi. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 Kriter TGX Prekast Midi Protein JelBiorad5671035
10X TGS (Tris / Glisin / SDS) TamponuBioRad161-0772
4 – %20 Kriter TGX Prekast Midi Protein JelBiorad5671095
%50 HidroksilaminThermo Scientific90115
6 X SDS Numune Yükleme TamponuBoston Bioproducts IncBP-111R
Amonyum Format (NH4COOH)Sigma70221-25G-F
Amonyum Hidroksit, %28Sigma338818-100ml
Mermi BlenderNext AdvanceBB24-AU
Kelebek Portföy IsıtıcıPhoenix S& TPST-BPH-20
C18 FermuarlıHarvard Aparatı74-4607tuzdan arındırmak için kullanılır
SigmaD5545
DMSOSigma41648
Formik AsitSigma94318
Fraksiyon ToplayıcıGilsonFC203B
Jel Kodu Mavi Leke ReaktifiThermo24592
Cam BoncukSonraki İlerlemeGB05
HEPESSigmaH3375
HPLC Sınıfı AsetonitrilBurdick & JacksonAH015-4
HPLC Sınıfı SuBurdick & JacksonAH365-4
İyodoasetamid (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
Kütle SpektrometresiThermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA Sindirim StandartSuları186002329
MetanolBurdick & JacksonAH230-4
Nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA Protein Test kitiThermo Scientific23225
ReproSil-Pur C18 reçine, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Kendi Kendine Paketleme SütunlarıYeni AmaçPF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mgSularWAT054960Sodyum
DeoksikolatSigma30970
SpeedvacThermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex Etiket Reaktif SetiThermo ScientificA44520
Trifloroasetik Asit (TFA)
400003 Uygulanan BiyosistemlerUltra-mikro Spin Sütunu, C18Harvard cihazı74-7206Üre
SigmaU5378
Xbridge Sütunu C18 sütunuSular186003943Bazik pH LC için kullanılır
Dithiothreitol (DTT) Tripsin Promega V511C

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levy, M. J., Washburn, M. P., Florens, L. Probing the sensitivity of the orbitrap lumos mass spectrometer using a standard reference protein in a complex background. Journal of Proteome Research. 17 (10), 3586-3592 (2018).
  2. Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
  3. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  4. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  5. Moulder, R., Bhosale, S. D., Goodlett, D. R., Lahesmaa, R. Analysis of the plasma proteome using iTRAQ and TMT-based Isobaric labeling. Mass Spectrometry Reviews. 37 (5), 583-606 (2018).
  6. Wang, H., et al. Deep multiomics profiling of brain tumors identifies signaling networks downstream of cancer driver genes. Nature Communications. 10 (1), 3718(2019).
  7. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  8. Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045(2018).
  9. Dayon, L., et al. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Analytical Chemistry. 80 (8), 2921-2931 (2008).
  10. Stepanova, E., Gygi, S. P., Paulo, J. A. Filter-based protein digestion (FPD): A detergent-free and scaffold-based strategy for TMT workflows. Journal of Proteome Research. 17 (3), 1227-1234 (2018).
  11. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical Chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  12. Thompson, A., et al. TMTpro: Design, synthesis, and initial evaluation of a proline-based isobaric 16-plex tandem mass tag reagent set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
  13. Li, J., et al. TMTpro reagents: a set of isobaric labeling mass tags enables simultaneous proteome-wide measurements across 16 samples. Nature Methods. 17 (4), 399-404 (2020).
  14. Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
  15. Labib, M., Kelley, S. O. Single-cell analysis targeting the proteome. Nature Reviews Chemistry. 4 (3), 143-158 (2020).
  16. Ren, R. J., Dammer, E. B., Wang, G., Seyfried, N. T., Levey, A. I. Proteomics of protein post-translational modifications implicated in neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 3 (1), 23(2014).
  17. Pagel, O., Loroch, S., Sickmann, A., Zahedi, R. P. Current strategies and findings in clinically relevant post-translational modification-specific proteomics. Expert Review of Proteomics. 12 (3), 235-253 (2015).
  18. Mertins, P., et al. Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 13 (7), 1632-1661 (2018).
  19. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  20. Bai, B., et al. Deep multilayer brain proteomics identifies molecular networks in Alzheimer's disease progression. Neuron. 105 (6), 975-991 (2020).
  21. Kelstrup, C. D., et al. Rapid and deep proteomes by faster sequencing on a benchtop quadrupole ultra-high-field orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6187-6195 (2014).
  22. Meier, F., et al. Online parallel accumulation - serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (12), (2018).
  23. Schweppe, D. K., et al. Full-featured, real-time database searching platform enables fast and accurate multiplexed quantitative proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2026-2034 (2020).
  24. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. Journal of Proteome Research. 14 (2), 829-838 (2015).
  25. Dey, K. K., et al. Deep undepleted human serum proteome profiling toward biomarker discovery for Alzheimer's disease. Clinical Proteomics. 16, 16(2019).
  26. Bai, B., et al. Deep profiling of proteome and phosphoproteome by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, and mass spectrometry. Methods in Enzymology. 585, 377-395 (2017).
  27. High, A. A., et al. Deep proteome profiling by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, mass spectrometry, and software-assisted quantification. Journal of Visualized Experiments. (129), e56474(2017).
  28. Chick, J. M., et al. Defining the consequences of genetic variation on a proteome-wide scale. Nature. 534 (7608), 500-505 (2016).
  29. Wang, Z., et al. Quantitative phosphoproteomic analysis of the molecular substrates of sleep need. Nature. 558 (7710), 435-439 (2018).
  30. Tan, H., et al. Integrative proteomics and phosphoproteomics profiling reveals dynamic signaling networks and bioenergetics pathways underlying T cell activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  31. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764(2011).
  32. Kleiman, L. B., Maiwald, T., Conzelmann, H., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Rapid phospho-turnover by receptor tyrosine kinases impacts downstream signaling and drug binding. Molecular Cell. 43 (5), 723-737 (2011).
  33. Mertins, P., et al. Ischemia in tumors induces early and sustained phosphorylation changes in stress kinase pathways but does not affect global protein levels. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (7), 1690(2014).
  34. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  35. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  36. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  37. Niu, M., et al. Extensive peptide fractionation and y(1) ion-based interference detection method for enabling accurate quantification by isobaric labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (1), 2956-2963 (2017).
  38. Wang, X., et al. A tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3663(2014).
  39. Li, Y., et al. JUMPg: An integrative proteogenomics pipeline identifying unannotated proteins in human brain and cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (7), 2309-2320 (2016).
  40. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  41. Wang, Z., et al. 27-plex tandem mass tag mass spectrometry for profiling brain proteome in Alzheimer's disease. Analytical Chemistry. 92 (10), 7162-7170 (2020).
  42. Ow, S. Y., et al. iTRAQ underestimation in simple and complex mixtures: "The good, the bad and the ugly". Journal of Proteome Research. 8 (11), 5347-5355 (2009).
  43. Karp, N. A., et al. Addressing accuracy and precision issues in iTRAQ quantitation. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1885-1897 (2010).
  44. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  45. Gygi, J. P., et al. A triple knockout isobaric-labeling quality control platform with an integrated online database search. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1344-1349 (2020).
  46. Savitski, M. M., et al. Measuring and managing ratio compression for accurate iTRAQ/TMT quantification. Journal of Proteome Research. 12 (8), 3586-3598 (2013).
  47. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376(2002).
  48. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513(2014).
  49. Brenes, A., Hukelmann, J., Bensaddek, D., Lamond, A. I. Multibatch TMT reveals false positives, batch effects and missing values. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 1967-1980 (2019).
  50. Yu, J., Peng, J., Chi, H. Systems immunology: Integrating multi-omics data to infer regulatory networks and hidden drivers of immunity. Current Opinion in Systems Biology. 15, 19-29 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

16 plex TMT EtiketlemeProtein rnek Haz rlamaEnzimatik SindirimLC LC FraksiyonlamaTandem K tle SpektrometrisiHesaplamal Veri leme
Video yakında

İlgili makaleler