Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Tümörigenez, hücrelerin düşmanca koşullar altında büyüme, hayatta kalma ve yayılmaya izin veren yetenekler edindiği çok aşamalı bir süreçtir. Farklı testler belirlemek ve kanserli hücrelerin bu işaretleri ölçmek için aramak; ancak, genellikle hücresel dönüşümün tek bir yönü üzerinde odaklanmak ve, aslında, birden fazla test onların uygun karakterizasyonu için gereklidir. Bu çalışmanın amacı, araştırmacılara hücresel dönüşümü geniş bir perspektiften değerlendirmek için bir dizi araç sağlamak ve böylece sağlam sonuçlar elde etmeyi mümkün kılmaktır.
Sürekli proliferatif sinyal aktivasyonu tümöral dokuların en önemli özelliğidir ve zaman içinde elde edilen popülasyon sayısı nın hesaplanmasıyla in vitro koşullarda kolayca izlenebilir. Ayrıca, 3D kültürlerde hücrelerin büyüme çevreleyen hücreler ile etkileşimsağlar, in vivo oluşur ne benzer. Bu, hücresel agregasyonun değerlendirilmesini ve farklı hücresel belirteçlerin immünororesan etiketlemesi ile birlikte tümöral dönüşümün bir diğer ilgili özelliği hakkında bilgi edinmesini sağlar: uygun organizasyonun kaybı. Dönüştürülmüş hücrelerin bir diğer dikkat çekici özelliği diğer hücrelere bağlanmadan ve hücre dışı matris, hangi ankraj tsay ile değerlendirilebilir olmadan büyümek için kapasiteleridir.
Hücre büyüme hızını değerlendirmek, 3Boyutlu kültürlerde hücre soyundan belirteçlerin immünororesan etiketlemesini gerçekleştirmek ve yumuşak agarlarda ankrajdan bağımsız hücre büyümesini test etmek için ayrıntılı deneysel prosedürler sağlanmaktadır. Bu metodolojiler meme kanserinde alaka nedeniyle Meme Primer Epitel Hücreleri (BPEC) için optimize edilsin; ancak, bazı ayarlamalardan sonra diğer hücre türlerine yordamlar uygulanabilir.
Giriş
Neoplazm gelişimi için birden fazla ardışık olay gereklidir. 2011 yılında Hanahan ve Weinberg dönüştürülmüş hücrelerin büyümesini, hayatta kalmalarını ve yayılmasını sağlayan 10 yeteneği tanımladı: sözde "Kanser Damgaları"1. Burada açıklanan metodoloji, tümör hücrelerinin ayırt edici özelliklerinden bazılarına odaklanarak in vitro hücresel dönüşümü değerlendirmek için üç farklı araç derlemektedir. Bu teknikler hücre çoğalma oranını, 3Boyutlu kültüredildiğinde hücrelerin davranışlarını ve ankraj bağımsızlığı olan koloniler oluşturma kapasitelerini değerlendirir.
Hücre modelleri in in vitro hipotezi test etmek için çok önemlidir. Farklı yaklaşımlar kanser çalışması için hücresel dönüşüm deneysel modeller oluşturmak için geliştirilmiştir2,3,4. Meme kanseri dünya çapında kadınlar arasında en sık görülen kanser olduğundan ve kadınlar arasında kanser ölümlerinin yaklaşık% 15 sorumludur5, meme epitel hücrelerinin uygun hücresel modeller sağlayan daha fazla araştırma için son derece önemlidir. Bu makalede, biz meme primer epitel hücreleri deneysel bir model kullanarak hücresel dönüşümü değerlendirmek için üç teknik potansiyelini resimli var (BPEPs) dönüşüm başlangıçta İnce ve meslektaşları tarafından açıklanan 20076 ve daha sonra bizimlaboratuvardauygulanan 7 . Bu deneysel model üç hedefli genin (SV40 Large T ve küçük t antijenleri burada Ttag, hTERTve HRASolarak anılacaktır) olmayan bpecs genomuna sıralı değişiklik dayanmaktadır. Ayrıca, BPEP'ler türev için kullanılan yöntem, meme bezi fizyolojik özelliklerinin bazılarını koruyan heterojen bir hücre kültürü ile sonuçlanan, luminal veya miyoepitelyal belirteçleri ile meme epitel hücrelerinin bakım yanadır.
Meme bezinde, süt üretiminden sorumlu olan luminal meme epitel hücreleri lümenin yakınında bulunurken, miyoepitelyal hücreler luminal hücrelerin etrafına atılır ve sütü nisine meme ucuna götüren kasılma hareketlerine dikkat eder. Bu hücre soyu arasında uygun organizasyonun kaybedilmesi, 3D hücre kültürlerinde farklı soy belirteçlerinin immünororesan saptanması sonrasında in vitro olarak değerlendirilebilen tümöral transformasyon8'in bir özelliğidir. Tümörhücrelerinin bir diğer önemli özelliği diğer hücrelere bağlanmadan ve hücre dışı matriks1'ebağlanmadan büyüme kapasiteleridir. Sağlıklı hücreler süspansiyon içinde büyümeye zorlandığında, anoikis \u2012 gibi mekanizmalar hücre dışı matris \u2012 ayrılmasına yanıt olarak indüklenen hücre ölümü türü9aktive edilir . Hücre ölümü kaçırma kanserin ayırt edici özelliklerinden biridir ve böylece, dönüştürülmüş hücreler anoikis inaktive ve çapa bağımsız bir şekilde hayatta yeteneğine sahiptir. Bu kapasite, yumuşak agar kullanılarak ankrajdan bağımsız bir teşp ile in vitro olarak değerlendirilebilir. Ayrıca, tümöral dokuların doğal bir özelliği, sadece süspansiyon tahlillerinde değil, aynı zamanda tek katmanlı yapışık kültürlerin büyüme hızını izleyerek, zaman içinde hücre sayısının artışını ölçerek in vitro koşullarda kolayca izlenebilen sürekli proliferatif sinyalizasyon kapasitesidir.
Tümörijenik potansiyeli test etmek için en iyi model murine modellerinde tümör hücrelerinin aşılanması ve yerinde tümör gelişiminin değerlendirilmesi olmasına rağmen, deneysel işlemlerde kullanılan hayvan sayısını mümkün olduğunca en aza indirmek önemlidir. Bu nedenle, in vitro dönüşümü değerlendirmek için uygun testlere sahip olmak en önemli önceliktir. Burada, hücresel dönüşüm modelleri ile çalışan laboratuvarların çoğunda kolayca uygulanabilen kısmen ve tamamen dönüştürülmüş meme epitel hücrelerinin tümörijenik potansiyelini değerlendirmek için bir dizi araç salıyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki deneylerde kullanılan insan örnekleri clínica Pilar Sant Jordi 'de (Barselona) standart prosedür onayı altında yapılan mammoplastilerden elde edilmiştir. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini'nde gerçekleştirilir.
1. İnsan meme epitel hücrelerinin in vitro kültür ve büyüme eğrisi arsa birikimi
-
Meme primer epitel hücrelerinin in vitro kültürü (BPEP): hücre geçişi
NOT: BPEC türetme ve hücre kültürü için Ince ve ark., 20076tarafından açıklanan talimatları izleyin.- Orta hazırlık.
- Ek WIT bazal P veya T takviyeleri ile tanımlanan orta, üretici tarafından sağlanan, birincil veya dönüştürülmüş BPECs kültürlü olup olmadığına bağlı olarak.
- Takviye WIT ortamına, birincil veya dönüştürülmüş BPEC'ler için 25 ng/mL için 100 ng/mL'lik son konsantrasyona kolera toksini ekleyin.
DİkKAT: Kolera toksini yutulursa ölümcüldür. Kişisel koruyucu ekipman kullanın. Çevreye salınmasından kaçının.
- Hücre kültürü bakımı ve geçişi.
NOT: Aşağıdaki adımlar için hücrelerin bir T25 şişesinde büyüdüğünü unutmayın. Bununla birlikte, hacimler yüzey alanı açısından orantılılığı koruyan diğer hücre kültürü biçimlerine uyarlanabilir.
- Orta hazırlık.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
BpECs üç genetik elementin tanıtımı ile hücresel dönüşüm deneysel bir model onkojenik dönüşümtemsilisonuçlar üretmek için seçildi 6,7 (Şekil 3). Dönüştürülmeyen BPEC'ler(N),İnce vemeslektaşları tarafından açıklandığı gibi hastalıksız meme dokusundan 6 ve burada belirtilen protokolü takip ederek kültürlü olarak elde edilmiştir. STASIS üstesinden geldikten sonra (stres veya anormal siny...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede açıklanan deneysel protokoller in vitro kültür hücrelerinin onkojenik dönüşümünü değerlendirmek için yararlı araçlar sağlar. Her teknik dönüşüm sürecinin belirli yönlerini değerlendirir ve bu nedenle tek bir analizden sonuç çıkarken özel dikkat edilmelidir. Büyüme eğrileri birikme başka amaçlar için hücreleri biriktirme zaman zaten mevcut bilgi gerektiren bir yaklaşımdır. Bu, bu tekniği diğer hücre çoğalma tahlillerine göre daha ucuz ve daha kolay uygulanmasını sağlar. Ancak, geçerli sonuçlar elde etmek için,...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
AG laboratuvarı İspanya Nükleer Güvenlik Konseyi tarafından finanse edilmektedir. T.A. ve A.G. Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503) tarafından tanınan bir araştırma grubunun üyeleridir. MT Bilimsel Vakfı Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR] tarafından finanse edilen bir sözleşme tutar. G.F. sözleşmesi Cellex Vakfı'nın hibesi ile finanse edilmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 ml Serolojik Pipetler | Labclinics | PLC91001 | |
| 1,5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | MTT uzun süreli saklama için koyu eppendorflar tercih edilir |
| 10 & mu; l Filtresiz pipet uçları | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml cam şişe | Kapaklı, otoklavlanabilir | ||
| 1000 & l Filtreli Pipet uçları | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 & mu; l Filtresiz pipet uçları | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Konik tüpler | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serolojik Pipetler | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 & mu; l Filtreli pipet uçları | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serolojik Pipetler | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Konik Tüpler | VWR | 525-0304 | |
| Aseton | PanReac AppliChem | 211007 | İmmünofloresan etiketlemeden önce 3D yapı fiksasyonu için kullanılır |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Ankraj testi için kullanılır |
| Anti-Claudin 4 antikoru | Abcam | 15104, RRID: AB_301650 | Çalışma seyreltmesi 1:100, konakçı: tavşan |
| Anti-Sitokeratin 14 [RCK107] antikoru | Abcam | 9220, RRID: AB_307087 | Çalışma seyreltme 1:100, ev sahibi: fare |
| Anti-fare Siyanin Cy3 antikoru | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Çalışma seyreltmesi 1:500, ev sahibi: keçi |
| Anti-tavşan Alexa Fluor 488 antikoru | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Çalışma seyreltmesi 1:500, ev sahibi: keçi |
| Otoklav | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Hücre kültürü 24 oyuklu Plate | Labclinics | PLC30024 | Matrigel'de 3B kültürler için kullanılır. Düz Tabanlı |
| Hücre kültürü 6 kuyulu Plaka | Laboratuvarları | PLC30006 | Ankraj tahlili için kullanılır |
| Hücre inkübatörü (37 >m; C ve %5 CO2) | |||
| Hücre Süzgeçleri | Fisherbrand | 11587522 | Ağ boyutu: 40 μ m |
| CellSense yazılımı | Olympus | Görüntü almak için kullanılır | |
| Vibrio cholerae'den Kolera | |||
| Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Konfokal ters çevrilmiş Mikroskop | Leica | TCS SP5 | |
| Kapak camları | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, kalınlık 0,13 - 0,17 mm |
| DAPI | 2- (4-amidinofenil) -1H -indol-6-karboksamidin | ||
| Fetal Sığır Serumu | Biowest | S1810 | Tripsin etkisini etkisiz hale getirmek için kullanılır |
| Fiji yazılımı (ImageJ) | Ulusal Sağlık Enstitüleri | RRID:SCR_002285 | Ücretsiz indirme, lisans gerekmez |
| Cam Pastör Pipetleri | |||
| Cam slaytlar | Fisherbrand | 11844782 | |
| Keçi Serumu | Biowest | S2000 | 3D yapıların immünofloresanı için kullanılır |
| Isıya Dayanıklı Eldivenler | Otoklavdan sonra agar manipülasyonu için kullanılır | ||
| Isıtıcı banyosu (37 >m; C) | Hücre subkültür Isıtıcı banyosundan önce çözeltileri temperlemek için kullanılır | ||
| (42 >m; C) | Agarı sıcak tutmak için kullanılır | ||
| Isıtma plakası | Matrigel dehidrasyonu için kullanılır | ||
| Nemli oda | İmmünofloresan sırasında antikorların inkübasyonu için kullanılır | ||
| Matrigel manipülasyonu sırasında kullanılan | buz | ||
| Buz | |||
| Ters Optik Mikroskop | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | -20 º'de mağaza; C ve kullanım sırasında soğuk tutun. Bazal membran matrisi olarak adlandırılır |
| Metanol | PanReac AppliChem | 131091 | İmmünofloresan etiketlemeden önce 3D yapı fiksasyonu için kullanılır |
| Mikropipet | p1000, p200 ve p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Nüfusun iki katına çıkmasını hesaplamak ve büyüme hızı denklemi |
| MilliQ suyunu | elde etmek için kullanılırUltra saf su olarak adlandırılır | ||
| Oje | Montajdan sonra numuneleri kapatmak için kullanılır | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | İnkübasyon sırasında antikor çözeltisini örtmek için kullanılır |
| PBS pH 7.4 (kalsiyum ve magnezyum olmadan) | Gibco | 10010-056 | Steril. Hücre alt kültürü |
| PBS tabletleri | Sigma-Aldrich | P4417 | MiliQ suda seyreltin. Sterilite gerekmez. İmmünofloresan için kullanılır |
| Pipet Yardımı | |||
| Primaria T25 şişeleri | Corning | 353808 | BPEC kültürü için kullanılır |
| Asa Otomatik Hücre Sayacı | Millipore | PHCC20060 | Alternatif olarak, bir hemositometre kullanın |
| Makas | Pipet uçlarını ve parafilmi kesmek için kullanılır | ||
| Steril filtreler 0.22 & mu; m | Millipore | SLGP033RS | MTT çözeltisini filtrelemek için kullanılır |
| Tiazolil Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | -20 ° C'de saklayın; C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 3D yapıların immünofloresansı için kullanılır |
| Tripsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | 3X çözelti elde etmek için PBS'de seyreltin |
| Vectashield Antifade Montaj Ortamı | Vektör Laboratuvarları | H-1000 | |
| WIT-P-NC Kültür Ortamı | Stemgent | 00-0051 | Birincil BPEC kültürü |
| WIT-T için kullanılır Kültür Ortamı | Stemgent | 00-0047 | Dönüştürülmüş BPEC kültürü için kullanılır |
Kaynaklar
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
- Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).
- Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
- Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), San Diego, California. 256-268 (2003).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112(2015).
- Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
