Yöntem makalesi

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

DOI:

10.3791/61783

⸱

22 Ocak 2021

 ,  ,  , 
1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolorektal kanserler heterojenlik ve tümör gelişimi, bakımı ve ilaçlara karşı dirençlerden sorumlu kanser kök hücre (CSC) popülasyonu içeren hiyerarşik bir organizasyon ile karakterizedir. Bu nedenle, CSC özelliklerinin spesifik hedeflemeleri için daha iyi anlaşılması, etkili tedavi için bir ön koşuldur. Bununla birlikte, derinlemesine incelemeler için uygun preklinik modellerin azlığı vardır. In vitro iki boyutlu (2D) kanser hücre hatları tümör biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlasa da fenotipik ve genetik tümör heterojenliğini çoğaltmaz. Buna karşılık, üç boyutlu (3D) modeller fizyolojik kanser karmaşıklığına ve hücre heterojenliğine hitap ediyor ve yeniden üretiyor. Bu çalışmanın amacı, CSC biyolojisini incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D kültür sistemi tasarlamaktı. Mevcut metodoloji, uzun süreli kültür için kullanılabilecek bir model olan Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden homojen boyutta olan 3D küreseller üretmek için koşulların gelişimini ve optimizasyonunu açıklar. Daha da önemlisi, sferoidler içinde, lümen benzeri yapılar etrafında örgütlenen hücreler, diferansiyel hücre çoğalma paternleri ve bir işaret panelini ifade eden CSC'lerin varlığı ile karakterize edildi. Bu sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere hücre heterojenliğini ve CSC biyolojisini incelemek için bu 3D yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolorektal kanser (CRC) dünyada kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir1. CRC'nin gelişimi, onkogenlerin aktivasyonu ve tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu da dahil olmak üzere genetik mutasyonların ve / veya epigenetik değişikliklerin2,3,4'ünilerleyici bir edinimi ve birikmesinin sonucudur. Ayrıca, genetik olmayan faktörler (örneğin, mikroçevrim) onkojenik dönüşüme katkıda bulunabilir ve teşvik edebilir ve böylece CRC'lerin evrimine katılabilir5. Daha da önemlisi, CRC'ler, normal bir kolon mahzeninde epitelin organizasyonunu anımsatan hiyerarşik bir yapı oluşturan bazı farklılaşma özelliklerini gösteren farklı KSS'ler ve dökme tümör hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre popülasyonlarından oluşur6,7.

CSC'lerin tümör görünümü8, bakımı ve büyümesi, metastatik kapasitesi ve konvansiyonel tedavilere karşı direnci6,7'densorumlu olduğu düşünülmektedir. Tümörlerde, CSC'ler de dahil olmak üzere kanser hücreleri, belirgin mutasyonel ve epigenetik profilleri, morfolojik ve fenotipik farklılıkları, gen ekspresyasyonu, metabolizma, çoğalma oranları ve metastatik potansiyel açısından yüksek düzeyde heterojenlik ve karmaşıklık gösterir9. Bu nedenle, kanser biyolojisini, tümörün ilerlemesini ve tedaviye karşı direncin kazanılmasını ve etkili tedavilere çevrildiğini daha iyi anlamak için, bu kanser heterojenliğini ve hiyerarşisini yakalayan insan preklinik modelleri önemlidir10,11.

In vitro 2D kanser hücre hatları uzun süredir kullanılmaktadır ve tümör gelişimi ve terapötik moleküllerin etkinliğinin altında yer alan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır. Bununla birlikte, orijinal tümörlerde bulunan fenotipik ve genetik heterojenliğin eksikliği ile ilgili sınırlamaları artık yaygın olarak tanınmaktadır12. Ayrıca, besinler, oksijen, pH gradyanları ve tümör mikroçevrimi çoğaltılmamıştır, mikroçevrim özellikle CSC11,12dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin bakımı için önemlidir. Bu ana dezavantajların üstesinden gelmek için, kanserlerin karmaşıklığını ve heterojenliğini deneysel olarak ele almak ve çoğaltmak için birkaç 3D model geliştirilmiştir. Aslında, bu modeller vivo12 , 13,14'tegözlemlenenlere benzer şekilde tümör hücresel heterojenliği, hücre-hücre etkileşimlerini ve mekansal mimariyi rekapitulate eder. Taze tümörlerden kurulan primer tümör organoidleri ve hücre hattı kaynaklı küreseloidler büyük ölçüde 15,16'dır.

Küreseller, hücreleri hücre agregalarında oluşmaya ve büyümeye zorlamak için iskelesiz veya iskele tabanlı bir şekilde kültürlenebilir. İskelesiz yöntemler, yapışmayan koşullar altında hücrelerin kültürüne (örneğin, asma-bırakma yöntemi veya ultra düşük bağlanma plakaları) dayandırılırken, iskele bazlı modeller kültür hücrelerine doğal, sentetik veya hibrit biyomalzemelere dayanır12,13,14. İskele bazlı sferoidler, son küresel oluşum kullanılan (biyo)malzemenin doğasına ve bileşimine bağlı olacağından farklı dezavantajlar sunar. Şimdiye kadar mevcut olan iskelesiz küresel yöntemler substratın doğasına dayanmasa da, yapı ve boyut olarak değişen küreseller üretirler17,18.

Bu çalışma, CSC biyolojisini incelemek için Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden oluşan homojen boyutta olan sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D kültür sistemi tasarlamayı amaçladı. Caco2 hücreleri, zaman içinde farklılaşma kapasiteleri nedeniyle özellikle ilgi çekicidir19,20, güçlü bir şekilde kök benzeri bir potansiyel önermektedir. Buna göre, küresellerin uzun süreli kültürü, kemoterapiye farklı yanıtlarla farklı CSC popülasyonlarının varlığını ortaya koydu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm reaktiflerin ve malzemelerin ayrıntıları Malzeme Tablosundalistelenmiştir.

1. Küresel oluşum

  1. Küresel kültür ortamı
    1. 4 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) içeren bazal ortam hazırlayın.
    2. Adım 1.1.1'den itibaren bazal ortamda fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisidin (Pen/Strep) içeren DMEM komple ortamını hazırlayın.
    3. Adım 1.1.1'den itibaren bazal ortamda %2,5 bodrum membran matrisi, FBS ve %1 Pen/Strep içeren DMEM/bodrum membran matrisi ortamı hazırlayın.
  2. Sferoid oluşumu için plakaların hazırlanması
    1. Oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 20 dakika sıcak bazal ve DMEM/bodrum membran matris ortamı.
    2. Her kuyuya 500μL yapışma önleyici durulama çözeltisi ekleyerek küresel oluşuma adanmış 24 kuyulu bir plakanın kuyularını ön işlemden geçirdirin.
      NOT: Bu plakalarda her kuyu 1.200 mikrowell'den oluşur.
    3. Plakayı 1.200 × g'da plakalar için adaptörlü sallanan bir kova rotorunda 5 dakika boyunca santrifüj edin.
      NOT: Sadece bir plaka kullanılıyorsa, ağırlığı dengelemek için su dolu ek bir standart plaka hazırlayın.
    4. Her kuyuyu 2 mL ılık bazal ortamla durulayın ve ortamı kuyulardan epire edin.
    5. Kabarcıkların mikrowelllerden tamamen çıkarıldığından emin olmak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin. Kabarcıklar sıkışmış kalırsa, kabarcıkları ortadan kaldırmak için 5 dakika boyunca 1.200 × g'da tekrar santrifüjleyin.
    6. Durulama adımları 1.2.4-1.2.5'i yineleyin.
    7. Her kuyuya 1 mL ılık DMEM/bodrum membran matrisi ortamı ekleyin.
  3. Küresellerin üretimi
    1. Caco2 hücrelerini% 5 CO 2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C'de% 10 FBS ve% 1 Pen / Strep ile desteklenmiş DMEM ortamında bir2D monolayerde büyütün (bundan böyle% 37 ° C / 5 CO2olarak adlandırılır).
      NOT: Kullanılacak maksimum hücre geçişi sayısı 80'dir.
    2. Konfluensisin % 80'ine ulaşıldığında, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) 1x (10 cm'lik bir yemek için 5 mL) ile yıkayın, tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ekleyin (10 cm'lik bir yemek için 2 mL) ekleyin ve 37 °C/% 5 CO2'de2-5 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Mikroskop altında hücre müfrezesini kontrol edin ve 10 cm'lik çanak başına 4 mL DMEM tam orta ekleyerek tripsin nötralize edin.
    4. Toplam hücre sayısını belirlemek için hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
    5. Hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca 1.200 × g'da santrifüj. Süpernatantı atın ve peletin uygun bir DMEM/bodrum membran matris ortamı hacminde yeniden kullanılabilir.
    6. Mikrowell başına istenen hücre sayısını elde etmek için kuyu başına gereken hücre sayısını belirlemek için Tablo 1'e bakın. Alternatif olarak, her kuyunun 1.200 mikrowell içerdiğini göz önünde bulundurarak, 24 kuyu plakası için aşağıdaki formülü kullanarak hücre sayısını hesaplayın
      Kuyu başına gerekli hücre sayısı = Mikrowell başına istenen hücre sayısı × 1.200
    7. 1 mL'lik son hacimde istenen hücre sayısını elde etmek için her kuyuya gerekli hücre süspansiyonu hacmini ekleyin.
    8. Kuyu başına 2 mL'lik son hacme ulaşmak için her kuyuya 1 mL DMEM/bodrum membran matris ortamı ekleyin (ayrıca bkz. adım 1.2.7).
      NOT: Mikro kabarcıklara kabarcık sokmamaya dikkat edin.
    9. Mikrowelllerdeki hücreleri yakalamak için plakayı 5 dakika boyunca 1.200 g'da × hemen santrifüj edin. Gerekirse, santrifüjü suyla dolu standart bir plaka ile dengelayın.
    10. Hücrelerin mikrowelller arasında eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin.
    11. Plakayı rahatsız etmeden 48 saat boyunca 7 °C/5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: Orijinal protokole göre21Birçok hücre hattı 24 saat içinde küreseller oluşturabilse de, bazıları daha uzun bir kuluçka süresi gerektirir. Bu protokolde küresel oluşum için 48 saat yeterlidir.
  4. Mikrowelllerden küresellerin toplanması
    1. Basal ve DMEM/bodrum membran matris ortamını RT'de yaklaşık 20 dakika ısıtın.
    2. Serolojik bir pipet kullanarak, kültür ortamının yarısını (1 mL) her kuyudan çıkarın.
    3. Küreselleri mikrowelllerden çıkarmak için ortamı kuyunun yüzeyine geri ekleyin.
      NOT: Küresellere dokunmayın veya üçe kütüre etmeyin.
    4. Küreselleri toplamak için 15 mL konik tüpün üstüne 37 μm ters çevrilebilir bir süzgeç (veya 40 μm standart süzgeç) yerleştirin.
      NOT: 40 μm standart süzgeç kullanıyorsanız, baş aşağı yerleştirin.
    5. Yerinden sferoidleri hafifçe epire edin (adım 1.4.3'ten itibaren) ve küresel süspansiyonu süzgeçten geçirin.
      NOT: Küreseller filtrede kalacaktır; tek hücreler ortamla birlikte akacaktır.
    6. Serolojik bir pipet kullanarak, kalan küreselleri yerinden çıkarmak ve süzgeçte geri kazanmak için kuyunun tüm yüzeyine 1 mL sıcak bazal ortam dağıtın.
    7. Bu yıkama adımı 1.4.6'yı iki kez tekrarlayın.
    8. Tüm küresellerin mikrowelllerden çıkarıldığından emin olmak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin. Gerekirse yıkamayı tekrarlayın (adım 1.4.6-1.4.7).
    9. Süzgeci ters çevirin ve yeni bir 15 mL konik boruya yerleştirin. Süzgeci DMEM/bodrum membran matris ortamı ile yıkayarak küreselleri toplayın.
      NOT: Toplanan küreseller aşağı akış uygulamaları ve analizleri için hazırdır.
  5. Uzun süreli küresel kültür
    1. Bazal ortamda % 1,5 agarose çözeltisi hazırlayın ve otomatik olarak kaplayarak sterilize edin (standart döngü).
    2. Agarose çözeltisi sıcak ve hala sıvı olsa da, Tablo 2'deaçıklandığı gibi standart kültür tabaklarının veya yemeklerinin kuyularını kaplayın.
      NOT: Kabın/tabağın fırında ısıtması kaplama adımını kolaylaştıracaktır. Kaplamalı yemekler/tabaklar RT'de steril bir ortamda 10 güne kadar bırakılabilir ve ışıktan korunabilir.
    3. Hasat edilen küreselleri (adım 1.4.9'dan itibaren) agarose kaplı plakalara tohumlayın ve plakanın büyüklüğüne bağlı olarak son hacme ulaşmak için DMEM / bodrum membran matrisi ortamı ekleyin.
      NOT: Küresel agregaları önlemek için, bunları 22küresel/cm2 optimum yoğunlukta tohumlayın. Kaplamanın mükemmel bir şekilde düz olmadığını ve plakanın merkezinde hafif bir konsavite oluşturarak kenara doğru yükseldiğini gözlemleyin. Küresellerin sayısı çok yüksekse, birbirlerine yapışmaları daha olasıdır.
    4. Plakayı belirli analizler için küresellerin geri kazanımı kadar % 37 °C/5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
  6. Kemoterapötik ilaçlarla sferoidlerin tedavisi
    1. 1.5.4 adımından plaka sferoidleri ve 2 gün boyunca yetiştirin. 3. günden (D3) başlayarak, onları FOLFIRI (5-Florourasil, 50 μg / mL) ile tedavi edin; Irinotecan, 100 μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL) veya FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 μg/mL); Oksaliplatin, 10 μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL) kemoterapötik rejim kombinasyonları rutin olarak22 , 23,24,25CRC hastalarını tedavi etmek veya (kontrol) tedavi edilmeyen (NT) durumda tutmak için kullanılır.
    2. 3 günlük tedaviden sonra, ucu kesilmiş bir pipet (1.000 μL uç) kullanarak, her durumun en az üç kopya ile temsil edilmesini sağlayarak küreselleri toplayın. Onları 3 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüj edin ve ardından süpernatantı çıkarın.
    3. Histolojik analiz için peletleri %2 paraformaldehitte (PFA) sabitlemek (bkz. bölüm 3) veya RNA ekstraksiyonu için peletleri kullanın (bkz. bölüm 4).
    4. Hücre ölümünü analiz etmek için, DMEM / bodrum membran matriks ortamındaki siyah kültür kuyu plakalarındaki 1.6.1 adımındaki küresel sferoidleri canlı hücrelere nüfuz etmeyen, ancak ölü hücrelerin tehlikeye atılmış zarlarına nüfuz eden bir nükleik asit lekesi (1:5000 seyreltme) ile 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın26. Mikro plaka okuyucu ile floresan birikimini ölçün.

2. Küresel büyümeyi izleme

  1. Ters bir mikroskop kullanarak, kültürde günler boyunca farklı koşullar altında tutulan küresellerin temsili görüntülerini elde edin.
  2. Uygun yazılımı kullanarak her bir küreselin üç farklı temsili çapını ölçerek görüntüleri analiz edin.
  3. Tahmini küre hacmini elde etmek için aşağıdaki formülü kullanın.
    figure-protocol-1

    NOT: d1, d2 ve d3 terimleri, küreselin üç çapıdır.

3. İmmünoresans (IF) ve histolojik lekelenme

  1. Fiksasyon ve parafin gömme
    1. Sferoidleri, 1.6.2 adımında açıklandığı gibi ucu kesilmiş bir pipet kullanarak seçilen zaman noktalarında toplayın ve %2 PFA'da RT'de 30 dakika boyunca sabitlayın.
      NOT: Alternatif olarak, numuneleri bu adımda 4 °C'de bir sonraki kullanıma kadar saklayın.
    2. Parafin gömme için, küreselleri PBS 1x ile 3x yıkayın ve% 70 etanolde yeniden ıslatın. Parafin inklüzyumu ve kesitinden sonra histolojik analiz için hematoksilin & eozin (H&E) boyama yapın.
  2. Parafin bölümlerinin immünoblabeling
    NOT: Dolaylı immünostaining için 5-μm kalınlığında bölümler kullanın.
    1. Balmumunu eritmek ve deparaffinizasyonu iyileştirmek için 2 saat boyunca 60 °C'de kaydırakları kuluçkaya yatırın.
    2. Slaytları metilsiklopohexane'de 3 dakika boyunca iki kez yıkayın.
    3. Slaytları 1:1 metilsiklopohexane:100% etanolde 3 dakika yıkayın.
    4. Slaytları iki kez% 100 etanolde 3 dakika boyunca yıkayın.
      NOT: Kimyasal bir başlıkta 3.2.2 ile 3.2.4.
    5. Slaytları% 90 etanolde 3 dakika yıkayın.
    6. Slaytları% 75 etanolde 3 dakika yıkayın.
    7. Slaytları% 50 etanolde 3 dakika yıkayın.
    8. Slaytları musluk suyunun altında yıkayın.
    9. Slaytları damıtılmış suda 5 dakika boyunca yeniden sulandırın.
    10. 700 mL 0,01 M sitrat tamponu, pH 6,0 hazırlayın ve uygun bir kaba ekleyin (genişlik: 11,5 cm, uzunluk: 17 cm, yükseklik: 7 cm); slaytları içine batırın. Kabı mikrodalga fırında 700 W'ta 9-10 dakika ısıtın ve kaynama başladığında, gücü 400-450 W'a düşürin.
    11. Slaytların arabellekte yaklaşık 30-40 dakika boyunca RT'ye soğumasını bekleyin.
    12. Slaytları PBS'de iki kez 5 dakika yıkayın.
    13. Bölümlere uygulanan sıvılar için bir bariyer oluşturmak için bölümlerin etrafına bir işaret kalemi ile bir daire çizin.
    14. Her bölümü RT'de en az 30 dakika boyunca 50 μL blokaj tamponu ( normal keçi serumu, %1 sığır serumu albümin (BSA) ve %0,02 Triton X-100 ile kuluçkaya yatırın.
    15. Bloklama tamponunu çıkarın ve kuluçka tamponunda seyreltilmiş 50 μL primer antikor ekleyin (PBS'de% 1 normal keçi serumu, % 0.1 BSA ve% 0.02 Triton X-100). RT'de 2 saat veya 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
    16. Birincil antikorları çıkarın ve slaytları PBS'de 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
    17. Slaytları, KULUÇKA tamponunda seyreltilmiş 50 μL floresan ikincil antikorlarla RT'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    18. İkincil antikorları çıkarın ve slaytları PBS'de 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
    19. Her bölüme 4′, 6-diamidino-2-fenylindole ile 50 μL montaj ortamı ekleyin ve bölümün üzerine bir cam kapaklı yerleştirin.

4. RNA ekstraksiyonu, ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve nicel RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Her nokta en az üç çoğaltma ile temsil edilen farklı zaman noktalarında küreselleri toplayın. Onları 3 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüj edin ve ardından süpernatantı çıkarın.
    NOT: Peletler doğrudan RNA ekstraksiyonu için kullanılabilir veya bir sonraki kullanıma kadar -20 °C'de saklanabilir.
  2. Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir RNA izolasyon kiti kullanarak toplam RNA'yı izole edin.
  3. Her RNA örneğinin 500 ng'lik kısmını, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit ile tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters çevirin.
  4. Ters transkripsiyondan sonra, farklı eksonlarda bulunan astarlarla bir temizlik genini güçlendirmek için 1 μL cDNA üzerinde PCR analizi yapın.
    NOT: Bu adım, RNA preparatlarında herhangi bir genomik DNA kontaminasyonunun olmadığının doğrulanmasını sağlar. Bu protokol için peptidylprolyl isomerase B(PPIB) primerleri kullanılmıştır.
  5. İlgi genlerine özgü astarlar kullanarak 4 μL daha önce seyreltilmiş cDNA (RNNA içermeyen çift damıtılmış suda 1:10) üzerinde qPCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Her örnekte, ΔΔCt yöntemini ve bir temizlik gen seviyelerine karşı normalleştirilmiş değerleri kullanarak belirli mRNA ekspresyonunun ölçülmesini ölçün.
    NOT: Bu protokol için β-actin(ACTB) seçildi. Bu protokolde kullanılan astarlar Tablo 3'te listelenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sferoidlerin boyutunda homojenlik eksikliği şu anda mevcut olan 3D küresel kültür sistemlerinin ana dezavantajlarından biri olduğundan13, bu çalışmanın amacı homojen sferoidler elde etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaktı. İlk olarak, ideal çalışma koşullarını belirlemek için, özel plakalar kullanılarak mikrowell / küresel başına 50 ila 2.000 hücre arasında değişen farklı sayıda Caco2 hücresi test edilmiştir (Tablo 1). Asl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro 3D modeller, mikroçevrim ve hücre heterojenliği de dahil olmak üzere tipik tümöral özelliklerin yeniden kapsüllenmesinde daha güvenilir göründükleri için 2D kanser hücre kültürlerinin ana deneysel dezavantajlarının üstesinden gelmektedir. Yaygın olarak kullanılan 3D küresel modeller iskelesizdir (düşük ek koşullarında kültürlenir) veya iskele bazlıdır (kültür hücrelerine biyomalzemeler kullanılarak). Bu yöntemler, kullanılan iskelenin doğasına bağlı oldukları veya yapı ve boyut olarak değişken olan küresellere y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görüntüleme ve Anipath recherche histoloji platformlarını (CRCL, CLB) kabul ediyoruz. FOLFOX ve FOLFIRI'nin nazik hediyesi için Centre Léon Bérard (CLB) Hastanesi eczanesine borçluyuz. Ayrıca brigitte manship'e makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) ve Inca (PLBIO19-289) tarafından desteklendi. MVG ve LC FRM'den, CF ise ARC vakfından ve Centre Léon Bérard'dan destek aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
37 ve mikro; m Ters Çevrilebilir Süzgeç, Büyük KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ2725050 mL konik tüplerle kullanılmak üzere
5-MerkezEczanesinden Florourasil Hediyesi Leon Berard (CLB)- stok çözeltisi, 5 mg / 100 mL; nihai konsantrasyon, 50 & g/mL
Agaroz SigmaA9539
Aggrewell 400 24 oyuklu plakalarKÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ34411Küresel oluşumu ve büyümesi için kuyu başına 1.200 mikro kuyu
Anti Kaspaz3 - TavşanHücresi Sinyali9661seyreltme 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - SıçaneBioscience/Thermo Fisher14-9896-82seyreltme 1:500
Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu x 100 mLKÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ07010
Anti-CD133 (13A4) - SıçanInvitrogen14-133-82seyreltme 1:100
Anti-CD44 -TavşanAbcamab157107seyreltme 1:2000
Anti-PCNA - FareDakoM0879seyreltme 1:1000
Anti-β-katenin - FareSanta Cruz Biyoteknolojisc-7963seyreltme 1:50
Siyah çok kuyulu plakalarThermo Fisher Scientific237108
Sitrik Asit MonohidratSigmaC1909
CLARIOstar aparatı BMG Labtechmikroplaka okuyucu
için bariyerler oluşturmak üzere slaytlardaki daireleri işaretlemek içinDako kalem
Eşek anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202seyreltme 1:1000
Eşek anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037seyreltme 1:1000
Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21206seyreltme 1:1000
Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10042seyreltme 1:1000
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) Glutamax (L-alanil-L-glutamin dipeptit)Gibco10569010
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco16000044
DAPIInterchimFP-DT094B
Keçi anti-sıçan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077seyreltme 1:1000
ImageJ yazılımıSferoid görüntü analizi
Irinotecan ve nbsp;Eczaneden HediyeCLB-stokçözeltisi, 20 mg / mL; nihai konsantrasyon, 100 & mikro; g/mL
iScript ters transkriptaz Bio-Rad1708891
; g/mL
Matrigel Bodrum Membran Matrisi Corning354234Bazal membran matrisi
Nucleospin RNA XS KitiMacherey-Nagel740902 .250
Eczaneden OksaliplatinHediyesi CLB-stokçözeltisi, 100 mg / 20 mL;nihai konsantrasyon, 10 &mikro; g/mL
Penisilin-streptomisinGibco15140130
Fosfat Tampon Salin (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX- GreenThermo Fisher ScientificS7020nükleik asit boyası; seyreltme 1:5000
Tripsin-EDTA (0.05 %)Gibco
Zeiss-Axiovert mikroskobusferoidlerin görüntülerini elde etmek için ters mikroskop
Sıvılar kalem işaretleyici kalem Leucovorin Eczaneden Hediye CLB stok çözeltisi, 50 mg / mL; nihai konsantrasyon, 25 & mikro25300062

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
  3. Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130(2013).
  4. Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
  5. Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
  6. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  7. Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
  8. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  9. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  10. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654(2019).
  11. Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156(2020).
  12. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  13. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  14. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  16. Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  17. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  18. Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
  19. Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
  20. Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
  21. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
  22. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  23. Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
  24. Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
  25. Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
  26. Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12(2014).
  27. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  28. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  29. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689(2013).
  30. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  31. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  32. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
  33. Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
  34. van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66(2019).
  35. Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
  36. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  37. Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
  38. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  39. Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518(2016).
  40. Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
  41. Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103(2019).
  42. Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
  43. Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B Sferoid K lt rCaco2 H creleriSferoid Olu umuKanser K k H cre Mark rleriKemoterapi Yan tL men Olu umuH cre Proliferasyon Kal plarBazal Membran MatrisiHomojen Sferoid Boyutu

İlgili makaleler