Yöntem makalesi

HiBiT CRISPR Hücre Hatları Kullanılarak Hedeflenen Protein Bozunma Bileşiklerinin Yüksek Verimli Hücresel Profillemesi

DOI:

10.3791/61787

⸱

9 Kasım 2020

 ,  ,  , 
1Promega Corporation

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bir hedef proteine kaynaşmış antikor içermeyen endojen protein algılama etiketini eksprese etmek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanan canlı hücrelerdeki protein bozunma kinetiğinin kantitatif ışıldayan tespitini açıklar. Kantitatif bozunma parametrelerini, hızı, Dmax, DC 50 veDmax 50'yi hesaplamak ve elde etmek için ayrıntılı talimatlar dahil edilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler yapıştırıcılar veya kimeraları hedefleyen proteoliz dahil olmak üzere hedeflenen protein bozunma bileşikleri, küçük moleküllü ilaç keşfinde heyecan verici yeni bir terapötik modalitedir. Bu bileşik sınıfı, hedef proteini ve E3 ligaz makinesi proteinlerini ubikitinasyon ve nihayetinde hedef proteini ubikitin-proteazomal yol (UPP) yoluyla bozunmak için gereken yakınlaştırarak protein yıkımını indükler. Bununla birlikte, hedef protein yıkımının yüksek verimli bir şekilde profillenmesi, bozulmayı sağlamak için gereken hücresel yolların karmaşıklığı göz önüne alındığında oldukça zor olmaya devam etmektedir. Burada, ışıldayan bir protein üretmek için LgBiT proteinine yüksek afinite ile tamamlanan 11 amino asit HiBiT etiketi ile hedef proteinlerin CRISPR / Cas9 endojen etiketlemesinin kullanımına dayanan bir protokol ve tarama stratejisi sunuyoruz. Endojen etiketlere sahip bu CRISPR hedefli hücre hatları, ışıldayan plaka tabanlı bir okuyucu kullanarak ışıldayan sinyali izleyerek gerçek zamanlı, kinetik canlı hücre veya uç nokta litik modlarında bileşik kaynaklı bozulmayı ölçmek için kullanılabilir. Burada, farklı formatlar için önerilen tarama protokollerini ana hatlarıyla belirtiyoruz ve ayrıca hız, Dmax, DC50, Dmax50'nin temel bozunma parametrelerinin hesaplanmasını ve hücre canlılığı tahlilleri ile çoklamayı açıklıyoruz. Bu yaklaşımlar, erken evre bileşiklerin hızlı bir şekilde keşfedilmesini ve önceliklendirilmesini sağlarken, ilgili hücresel arka planlarda hedef proteinlerin endojen ekspresyonunu ve düzenlenmesini sağlayarak kurşun terapötik bileşiklerin verimli bir şekilde optimize edilmesini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedeflenen protein bozunması, kanser tedavisi için immünomodülatör moleküler yapıştırıcı bileşiklerinin (örneğin, IMiD) terapötik başarısı ve Chimera bileşiklerini hedefleyen Proteoliz 1,2,3,4,5,6,7,8'in umut verici erken klinik çalışma verileriyle büyük ölçüde desteklenen, küçük moleküllü ilaç keşfinde en hızlı büyüyen alanlardan biri olarak ortaya çıkmıştır. 9,10,11,12. Hedeflenen protein bozunma bileşikleri, E3 ligaz makinesi proteinleri 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ile bir hedef proteini yakınlaştırarak işlev görür . Hedef proteinin E3 ligazına bu bileşik kaynaklı alımı, ubikitin proteazomal yolu (UPP) 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 yoluyla hedef protein ubikitinasyonuna ve bozulmasına yol açar. . Tarihsel olarak, küçük moleküllü ilaç keşif tarama programları, aktiviteyi değerlendirmek ve bileşikleri sıralamak için ilk biyokimyasal testlere güvenmiştir. Bununla birlikte, bu, nihai aktivitesi, proteazom yoluyla bozunma, hücresel olayların bir kaskadına bağlı olan hedeflenen protein bozunumcuları için önemli bir zorluk ortaya koymuştur 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. Başarılı hedef bozunması için gerekli olan protein komplekslerinin çoklu yolları ve karmaşıklığı, ilk bileşiklerin erken taranması ve önceliklendirilmesi için hücresel analiz yaklaşımlarını gerektirmektedir. Şu anda, hücresel ortam bağlamında hedef protein bozulmasını yüksek verimli bir şekilde izlemek için teknolojilerin mevcudiyeti ciddi şekilde eksiktir14. Burada, CRISPR / Cas9 endojen olarak etiketlenmiş HiBiT hedef hücre hatları 18,19,20 kullanılarak gerçek zamanlı kinetik canlı hücre veya son nokta litik bozunma aktivitesi değerlendirmesi için protokoller sunacağız ve 10,11,18,19 degrader bileşikleri ile tedaviden sonra ışıldayan ölçüm yoluyla hedef proteinin kaybını izleyeceğiz.

Terapötik hedeflerin başarılı bir şekilde parçalanmasını sağlamak ve ilaçlanabilir proteomu genişletmek için, plazma zarında veya içinde lokalize olanlar, lizozomlar, mitokondriyal membranlar, sitoplazma ve çekirdek21-57 dahil olmak üzere yıkım için çok çeşitli proteinleri hedefleyebilen çok sayıda yaklaşım ve tipte bozundurucu ortaya çıkmıştır. En kapsamlı olarak incelenen iki ana bileşik sınıfı, moleküler yapıştırıcılar ve simeraları hedefleyen protein 2,4,5,6,7,12,26'dır. Moleküler yapıştırıcılar monovalenttir, bu nedenle tipik olarak daha küçüktür ve yeni bir proteini kolaylaştırır: bir E3 ligaz bileşeni2,12,26'ya bağlandıktan sonra bir hedef protein ile protein etkileşim arayüzü. Bunlar en yaygın olarak Cereblon (CRBN) E3 ligaz bileşeni2,12,26,55,56,57'ye bağlanan bozunuculardır. Son zamanlarda, DCAF1558,59,60 ve DDB1 45'e CDK / Siklin alımı gibi diğer E3 ligaz makinelerini kullanan heyecan verici yeni örnekler, bu bileşik sınıfının genişleme potansiyelini göstermektedir. Buna karşılık, PROTAC'lar daha büyük, iki değerli moleküllerdir, bir hedef bağlama ligandından oluşur, çoğunlukla bir inhibitör, kimyasal bir bağlayıcı aracılığıyla bir E3 ligaz sapına 1,3,4,5,7,13 ile köprülenir. Bu nedenle, bu bileşikler hem E3 ligazına hem de hedef protein 1,3,4,5,7,13'e doğrudan bağlanabilir. Çok sayıda proteinin bu iki değerli moleküller yoluyla parçalandığı gösterilmiştir ve en çok kullanılan E3 ligaz sapları CRBN veya Von Hippel Lindau (VHL) 1,3,4,5,7,13'ü işe alır. Bununla birlikte, proteoliz tasarımını hedefleyen kimeralarda E3 ligaz alımı için mevcut tutamakların sayısı hızla artmakta ve bu bileşik sınıfının yeteneklerini, çeşitli hedef sınıfları bozma ve hücre veya doku tipi özgüllüğünü arttırma potansiyeli ile genişletmektedir 24,48,61,62 . Marjinal afinite ile bile, bir hedef proteini meşgul etmek için minimum gereklilik ile birleştiğinde, bozunma bileşikleri, uyuşturulabilir proteomu genişletmek için umut vaat etmektedir.

Protein kaybının hücresel dinamiklerini ve tedavi sonrası potansiyel protein geri kazanımını karakterize etmek, bozunma bileşiği fonksiyonunu ve etkinliğini anlamak için kritik öneme sahiptir. Batı leke antikor tahlilleri veya kütle spektrometrisi ile ilgili hücresel sistemlerdeki endojen protein seviyesi değişikliklerini incelemek mümkün olsa da, bu yaklaşımların yüksek verimli tarama formatlarına adapte edilmesi, sınırlı niceleme kabiliyetine veya birçok zaman noktasında kinetik değişiklikleri ölçme kabiliyetine sahip olması zordur14. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, endojen protein seviyelerindeki değişiklikleri izlemek için, 11 amino asit etiketi HiBiT'in CRISPR / Cas9'u aracılığıyla herhangi bir anahtar bozunma hedefinin 18,19,20 lokusuna genomik yerleştirmeyi kullanan plaka tabanlı bir hücresel ışıldayan sistem geliştirdik. Bu peptit, 18,19,20,63 substratının varlığında parlak lüminesans üretmek için bağlanma ortağı LgBiT'ye yüksek afinite ile tamamlar, böylece bu etiketli endojen proteinleri hücrelerde veya lizatlarda ışıldayan hale getirir 18,19,20,63 . Bir luminometre cihazı ile ölçülen göreceli ışık birimleri (RLU'lar), etiketlenmiş hedef protein seviyeleri 18,19,20,63 ile doğru orantılıdır. Stabilize lusiferaz substratlarının geliştirilmesiyle, 24-48 saatlik zaman dilimleri üzerinde gerçek zamanlı kinetik protein seviyesi ölçümleri mümkündür 18,53,64. Bu, herhangi bir bileşik konsantrasyonunda, ilk bozunma hızının, bozunma maksimumunun (Dmax) kantitatif analizi ve bileşik muameleden sonra geri kazanım18,53 dahil olmak üzere, herhangi bir belirli hedef için tam bir bozunma profilinin belirlenmesine izin verir. Bununla birlikte, bozunma bileşiklerinin büyük kütüphaneleri taranırsa, son nokta analizi, çeşitli ilaç konsantrasyonlarında ve belirlenen zamanlarda 384 kuyucuklu formatta kolayca gerçekleştirilebilir.

Bu makalede sunulan protokoller, hedeflenen protein bozunma bileşikleri için hücresel tarama stratejilerini temsil etmektedir ve her türlü bozundurucu için geçerlidir. Bununla birlikte, HiBiT CRISPR hücre hatlarının bu protokollerle birlikte kullanılması, protein yıkımı ile sınırlı değildir, bunun yerine, bileşiklerin etkisini ve hatta direnç mekanizmalarını incelemek için işlem sonrası modüle edilebilecek herhangi bir endojen hedef protein seviyesini izlemek için genel araçlardır 20,65,66. Bu ışıldayan tabanlı tespit yöntemleri için bir ön koşul, endojen hedef ekspresyonu ve doğal promotör regülasyonu18,19,20'yi korurken, hassas ışıldayan algılamayı mümkün kıldığı için kritik öneme sahip bir CRISPR endojen etiketli HiBiT hedef hücre hattıdır. CRISRP/Cas9'un genomik etiketlerin yerleştirilmesinde, özellikle ölçeklenebilirlik 20'de ve yüksek algılama hassasiyeti ile, CRISPR havuzları veya heterozigot veya homozigot allelik eklemelere sahip klonlar dahil olmak üzere çeşitli formatlarda kullanılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir18,19,20. Endojen etiketleme yerine hücrelerde HiBiT'in eksojen ekspresyonunun veya diğer muhabir füzyonlarının kullanılması mümkündür, ancak protein aşırı ekspresyonu14,18 olan sistemler kullanılarak önemli ölçüde dikkatli olunmalıdır. Bunlar, gerçek bileşik potens ve protein geri kazanım dinamiklerini anlamada eserlere yol açabilir14,18, hedef bozunma sonrası aktive edilen potansiyel transkripsiyonel geri besleme döngüleri dahil. Ek olarak, düşük potansiyele sahip erken evre bileşikler kaçırılabilir ve taramada kendilerini yanlış negatifler olarak gösterebilir. Protein kaybı, bileşiğin neden olduğu toksisite ve hücre ölümünden kaynaklanabileceğinden, burada açıklanan protokoller şiddetle tavsiye edilir, ancak isteğe bağlı hücre canlılığı ışıldayan veya floresan tahlilleri, bozunma protokolü ile eşleştirilmiştir. Protokolün iki ana bölümü vardır: litik son nokta ve canlı hücre kinetik taraması. Bu bölümlerin her birinde, son nokta veya kinetik formatlarda çoklanmış hücre canlılığı ölçümleri için seçenekler dahil edilmiştir. Etiketlenmiş endojen proteinin değişimlerinin izlenmesi, hücrelerde LgBiT ile kompleman gerektirir. Bu nedenle, kinetik tarama bölümü, bunun tanıtımı için geçici veya kararlı ekspresyon yoluyla elde edilebilen ve canlı hücre ışıldayan ölçümlerini gerçekleştirmek için gerekli olan önemli protokollere atıfta bulunur. Burada sunulan tüm yaklaşımlar, bileşiklerin hızlı sıralama sıralamasına ve aktivite değerlendirmesine izin vererek, erken aşama bileşik tarama çabalarına ve kurşun bozundurucuların daha hızlı tanımlanmasına olanak tanır.

Bu protokol, bir HiBiT CRISPR hücre hattı ile birlikte bozunma bileşiklerinin incelenmesi için tasarlanmıştır. Çok sayıda hedef için HiBiT CRISPR eklemelerinin oluşturulmasına yönelik protokoller, yakın tarihli birkaç yayında özetlenmiştir18,19,20.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HiBiT CRISPR ile uç nokta bozunma çalışmaları, isteğe bağlı hücre canlılığı floresan analizi ile litik formattaki proteinleri hedefler

  1. Memeli yapışkan veya süspansiyon hücre hattının hazırlanması ve kaplanması
    1. Pasaj ve hücre büyümesi için kullanılan uygun hücre ortamında seyreltme ile hücre yoğunluğunu 2,22 x 105/mL'ye ayarlayın.
    2. Hücreleri, deney ve kontrol koşulu başına en az 3 kuyucuklu plakalara dağıtın. Hücre süspansiyonunun kuyusu başına 90 μL (20.000 hücre) 96 delikli beyaz plakalara dağıtın. 384 delikli format için, hücre süspansiyonunun kuyusu başına 36 μL (8.000 hücre) 384 delikli beyaz plakalara dağıtın.
  2. Bileşiklerin hazırlanması ve eklenmesi
    1. Seri olarak seyreltilmiş PROTAC veya degrader test bileşiği plakalarını% 100 DMSO'da 1.000x nihai konsantrasyonda hazırlayın. Daha sonra hücre kültürü ortamında 10x nihai konsantrasyona seyreltin. Bileşiksiz DMSO kontrolü olarak kullanılmak üzere ortama eşit hacimde DMSO ekleyin.
    2. 96 kuyucuklu format için 90 μL hücreye 10 μL 10x bileşik ve kontrol solüsyonları ekleyin. 384 kuyucuklu format için 36 μL hücreye 4 μL 10x bileşik ve kontrol solüsyonu ekleyin.
    3. Plakaları bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de istenen süre boyunca veya büyümeleri için en uygun koşullarda inkübe edin.
      NOT: Bu bir uç nokta testi olduğundan, birden fazla zaman noktasının test edilmesi, yukarıdaki adım 1.1.2'de açıklandığı gibi, her zaman noktası için ayrı bozunma plakalarının hazırlanmasını gerektirecektir. Bileşik aracılı bozunmayı tespit etmek için kuluçka süreleri oldukça değişkendir ve muhtemelen bileşik konsantrasyonuna da bağlıdır. Önerilen başlangıç zaman noktaları 6 saat ve 24 saat olacaktır.
    4. İsteğe bağlı hücre canlılığı ölçümü olmadan uç nokta ışıldayan algılamasını ölçüyorsanız, doğrudan aşağıdaki adım 1.3'e geçin. Hücre canlılığı ölçümü ile çoklama yapıyorsanız, aşağıdaki bir sonraki bölüm 1.4'e geçin.
  3. Hücrelerin litik ölçümü
    1. HiBiT litik ölçümlerinden hemen önce, litik tamponun her 1 mL'si başına 20 μL litik substrat ve 10 μL LgBiT proteini ekleyerek 2x litik algılama reaktifi hazırlayın. Pipetleme hatasını hesaba katmak için ekstra hacim de dahil olmak üzere test edilecek kuyu sayısı için yeterli sayıda 2x algılama reaktifi hazırlayın (yani, kuyu sayısı +% 10).
    2. Hücrelere hazırlanmış litik tespit reaktifi ekleyin. 96 kuyucuklu format için, 100 μL hücre içeren her bir kuyucuğa 100 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. 384 kuyucuklu format için, 40 μL hücre içeren her bir kuyucuğa 40 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. Plakayı bir mikro plakalı vorteks karıştırıcı üzerinde 350 rpm'de 10-20 dakika boyunca karıştırın.
    3. 96 veya 384 kuyucuklu bir plakadaki lüminesansı okuyabilen bir luminometre üzerinde lüminesansı ölçün.
  4. İsteğe bağlı hücre canlılığı çoklaması
    NOT: Bu adım, piyasada satılan bir CellTiter-Fluor (CTF) kiti kullanılarak gerçekleştirilir (bkz.
    1. İstenilen son nokta ölçümünden 30-40 dakika önce, tahlil Tamponunun 2 mL'sine 10 μL substrat ekleyerek 6x hücre canlılığı algılama reaktif çözeltisi hazırlayın. Pipetleme hatası için ekstra hacim de dahil olmak üzere test edilecek her kuyu için yeterli 6x reaktif hazırlayın (yani, kuyu sayısı +% 10).
    2. Hazırlanan reaktifi kuyucuklara ekleyin. 96 delikli format için, zaten 100 μL hacim içeren her bir kuyucuğa 20 μL 6x reaktif ekleyin. 384 kuyucuklu format için, 40 μL hücre içeren her bir kuyucuğa 8 μL 6x reaktif ekleyin. Bir mikroplaka vorteks karıştırıcısında kısaca karıştırın, ardından plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin.
    3. İstenilen ölçüm bitiş noktasında (yani, 6 veya 24 saat işlem sonrası, adım 1.2.3), floresanı (380-400nmEx / 505nmEm) 96 veya 384 kuyu formatında okuyabilen bir cihazda floresan ölçün.
    4. 1 mL litik tampon başına 20 μL litik substrat ve 10 μL LgBiT proteini ekleyerek 2x litik tespit reaktifi hazırlayın. Pipetleme hatasını hesaba katmak için ekstra hacim de dahil olmak üzere, test edilecek kuyu sayısı için yeterli sayıda 2x algılama reaktifi hazırlayın (örneğin, kuyu sayısı + ).
    5. Hazırlanan litik tespit reaktifini kuyucuklara ekleyin. 96 kuyucuklu format için, zaten 120 μL hacim içeren her bir kuyucuğa 120 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. 384 kuyucuklu format için, zaten 48 μL hacim içeren her bir kuyucuğa 48 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. Plakayı bir mikroplaka vorteks karıştırıcısında 10-20 dakika karıştırın.
    6. 96 veya 384 kuyu plakalarındaki lüminesansı okuyabilen bir luminometre üzerinde lüminesansı ölçün.
  5. Bozunma ve hücre canlılığının ölçülmesi
    1. Ölçülen zaman noktasında DMSO kontrolünden gelen göreceli ışık birimlerinin (RLU) ortalaması. Bu değeri, aynı anda test edilen diğer tüm tedavileri normalleştirerek fraksiyonel bozulmayı hesaplamak için hedefin temel protein seviyesi olarak kullanın. Örneğin, 6 saatte DMSO kontrol kuyuları için ortalama RLU 10.000 ve 6 saatte belirli bir bileşik işlem için RLU 5.000 ise, fraksiyonel bozulma 5.000 ÷ 10.000 = 0.5 olarak hesaplanacaktır (Denklem 1).
      Denklem 1: PROTAC veri analizi için fraksiyonel RLU denklemi; Bağıl lüminesans hesaplama diyagramı.
    2. Fraksiyonel RLU'dan yüzde bozulmasını belirleyin:
      Denklem 2: Biyokimyasal analizde fraksiyonel RLU kullanarak yüzde bozulmayı hesaplama denklemi.
    3. Bileşiklerin aktivitesini sıralamak için belirli zaman noktalarında fraksiyonel RLU veya % bozunmayı çizin.
    4. İsteğe bağlı olarak, tüm tedavilerden elde edilen değerleri DMSO kontrolüyle karşılaştırarak hücre canlılığı testi ölçümü için göreceli floresan birimi (RFU) verilerini analiz edin. DMSO kontrolüne göre herhangi bir tedavi için RFU'da önemli bir düşüş gözlenirse, bozulma verileri, hücre canlılığındaki kayıplara göre protein seviyesindeki değişiklikleri belirlemek için hücre canlılığı testi verilerine ek olarak normalleştirilebilir.

2. HiBiT CRISPR hedef proteinlerinin gerçek zamanlı kinetik bozunması ve isteğe bağlı hücre canlılığı lüminesans testi

NOT: Kinetik tarama ve bozunma yapabilme yeteneği, hücrede daha önce 18,19,63 olarak tanımlanan LgBiT protein ko-ekspresyonunu gerektirir. Bu, bir LgBiT vektörünün geçici transfeksiyonu, BacMam LgBiT kullanımı veya bir LgBiT kararlı hücre hattına HiBiT CRISPR yerleştirme işlemi gerçekleştirilerek elde edilebilir.

  1. Yapışkan hücre hatlarının kaplanması.
    1. Aspirasyonla hücre şişesinden ortamı çıkarın, hücreleri DPBS ile yıkayın,% 0.05 tripsin-EDTA ile hücreleri ayırın ve hücrelerin şişe tabanından ayrışmasına izin verin. Süspansiyon hücresi hatları için bölüm 2.2'ye geçin.
    2. Serum içeren hücre kültürü ortamını kullanarak tripsini nötralize edin, hücreleri toplamak ve yeniden askıya almak için karıştırın ve hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın.
    3. Hücreleri 5 dakika boyunca 125 x g'de döndürün. Hücre kültürü ortamını atın ve eşit hacimde taze hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın.
    4. Deney ve kontrol koşulu başına en az üçlü kuyucuklara sahip tahlil plakalarına plaka hücreleri. Hücre yoğunluğunu tahmin etmek için 96 kuyucuklu format sayımı için, yoğunluğu tahlil ortamında 2 x 105 hücre / mL'ye ayarlayın ve 96 delikli bir plakada kuyucuk başına 100 μL (20.000 hücre) dağıtın. Hücre yoğunluğunu tahmin etmek üzere 384 kuyucuklu format sayımı için, tahlil ortamında yoğunluğu 4,44 x 105 hücre/mL'ye ayarlayın ve kuyucuk başına 18 μL (8.000 hücre) dağıtın.
    5. Plakaları 37 °C'de, gece boyunca% 5 CO2'de veya büyümeleri için en uygun koşullarda inkübe edin.
  2. Süspansiyon hücrelerinin kaplanması
    1. FBS ve 1x Endurazin (stok reaktifinin 1:100 seyreltilmesi) ile desteklenmiş CO 2'den bağımsız ortamda hücre yoğunluğunu2,22 x 105 hücre/mL'ye ayarlayın.
    2. Plaka hücreleri, deney ve kontrol koşulu başına en az 3 kuyucuklu tahlil plakalarına dönüştürür. 96 kuyucuklu format için kuyu başına 90 μL (20.000 hücre) dağıtın. 384 kuyucuklu format için kuyu başına 36 μL (8.000 hücre) dağıtın.
      NOT: Arka plana (S:B) düşük sinyalli (S:B) lüminesansı olan süspansiyon hücre hatları için, örneğin klonlar yerine CRISPR havuzlarıyla çalışırken, kaplanan hücre sayısını, 96 kuyucuklu formatta 100.000 hücreye/kuyuya veya 384 kuyucuklu biçimde 40.000 hücreye/kuyuya kadar artırarak lüminesansı artırmak mümkündür.
  3. LgBiT'yi eksprese eden HiBiT CRISPR hücrelerini kullanarak kinetik bozunma testleri
    1. 2.2.'deki kaplama adımına dahil edilen Endurazin içeren süspansiyon hücreleri için, doğrudan adım 2.3.3'e geçin. Yapışkan hücre hatları için Nano-Glo Endurazin çözeltisi hazırlayın. 96 kuyucuklu format için, stok reaktifi 1:100'ü% 10 FBS ile desteklenmiş CO2'den bağımsız ortama seyrelterek 1x Endurazine çözeltisi hazırlayın. 384 kuyucuklu format için, stok reaktifi 1:50'yi% 10 FBS ile desteklenmiş CO 2'den bağımsız ortama seyrelterek2x Endurazine çözeltisi hazırlayın.
    2. Endurazin çözeltisini yapışkan hücrelerin her bir kuyucuğuna ekleyin. 96 delikli format için aspirasyon ortamı ve 90 μL 1x Endurazin çözeltisi ekleyin. 384 kuyucuklu format için, 18 μL hücreye 18 μL 2x Endurazin çözeltisi ekleyin. Bozunma testi, 384 delikli formatta 50:50 kültür ortamı ve CO2 bağımsız ortam karışımında gerçekleştirildiği için ortamı aspire etmeyin.
    3. Lüminesansın dengelenmesini sağlamak için bir inkübatörde 2,5 saat boyunca Endurazin içeren süspansiyonu veya yapışkan hücre plakalarını 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    4. CO2'den bağımsız ortamda 10x konsantrasyonda test PROTAC titrasyonu hazırlayın ve 96 delikli plakanın her bir haznesine 10 μL veya 384 delikli plaka için 4 μL ekleyin. Etkinliği bilinmeyen bileşikler için, başlangıç noktası olarak en yüksek noktada 1-10 μM'lik bir son konsantrasyon önerilir.
    5. 0-48 saat arasında bir süre boyunca 37 ° C'ye önceden dengelenmiş luminometrede kinetik lüminesans ölçümlerini toplayın. Ölçümün zaman artışları her deney için özelleştirilebilir, ancak önerilen bir ilk deney, 24 saat boyunca her 5-15 dakikada bir veya istenen miktarda lüminesans ölçümleri olacaktır.
  4. Son kinetik ölçümden sonra opsiyonel hücre canlılığı aynı kuyucuklu multipleks analizi
    NOT: Bu tahlil, piyasada satılan bir CellTiter-Glo (CTG) kiti ile gerçekleştirilir (bkz.
    1. CTG reaktifini oda sıcaklığına dengeleyin.
    2. Kinetik analizin son zaman noktasında bozunma ölçümünü takiben, plakanın kuyucuğu başına 100 μL (96 delikli plaka) veya 40 μL (384 kuyucuklu plaka) ilave edin ve 5 dakika boyunca 500-700 rpm'de (96 delikli plaka) bir plaka çalkalayıcıda veya bir mikroplaka vorteks karıştırıcısında (384 delikli plaka) karıştırın.
    3. Hücre lizisine ve HiBiT sinyalinin söndürülmesine izin vermek için plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Üreticinin tavsiyesine uyarak bir luminometredeki toplam parlaklığı ölçün.
  5. Kinetik bozunma profillerinin nicelleştirilmesi
    1. Toplanan kinetik lüminesans ölçümlerini kullanarak, zaman içinde serbest furimazin konsantrasyonundaki değişiklikleri hesaba katmak için her bir PROTAC konsantrasyonu için ham RLU'ları her zaman noktasında replika ortalaması DMSO koşuluna normalleştirin. Denklem 1'i kullanarak Kesirli RLU'yu hesaplayın.
      Denklem 1: PROTAC veri analizi için fraksiyonel RLU denklemi; Bağıl lüminesans hesaplama diyagramı.
    2. Bozunma eğrilerinden, Denklem 2'yi kullanarak tek bileşenli üstel bozunma modelini, her eğrinin ilk bozunma kısmına, verilerin bir platoya ulaştığı noktaya kadar sığdırın.
      NOT: Bozulma gözlenmeden önce kısa bir gecikme olabileceğinden, ilk birkaç veri noktasını sığdırmanın dışında tutmak yararlı olabilir.
      Denklem 2: Üstel bozunma formülü, y=(y₀-Plato)e^(-λt)+Plato, matematiksel diyagram.
    3. Denklem 2'den, bozulma hızı sabitini temsil eden ƛ parametresini ve kalan en düşük protein miktarını temsil eden Plato parametresini belirleyin.
    4. Parçalanan proteinin maksimum fraksiyonel miktarı olan ve 1-Plato olarak hesaplanan Dmax'ı hesaplayın.
    5. Zamandan bağımsız bir bozunma potens eğrisi belirlemek için her bir PROTAC konsantrasyonu için Dmax'ı çizin.
    6. Bileşiklerin etkinliğini analiz etmek için 2.3.5'teki arsa için Dmax50 değerini belirleyin.
      NOT: Belirli bir zaman noktasında bir DC50 belirlemek için, seçilen zamanda her konsantrasyon için hesaplanan yüzde bozunmasını çizin. Bu, DC 50 t=4 h veya DC50 t=12 h olarak belirtilebilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek konsantrasyonlu sonlanım noktası litik bozunma analizini göstermek için, birkaç CDK hedef proteini; CDK2, CDK4, CDK7 ve CDK10, HEK293 hücrelerinde C-terminuslarında HiBiT ile endojen olarak etiketlendi ve pan-kinaz Sereblon bazlı PROTAC, TL12-18654'ün 1 μM konsantrasyonu ile muamele edildi (Şekil 1A). CDK proteininin seviyesi farklı zaman noktalarında ölçüldü ve DMSO kontrolüne göre fraksiyonel RLU belirlendi (Şekil 1A). Her CDK proteini, bileşik tedaviye ve çeşitli zaman noktalarına yanıt olarak farklı derecelerde bozulma göstermiştir (Şekil 1A). CDK proteinlerinin protein kaybı açısından birbirleriyle doğrudan nasıl karşılaştırıldığını anlamak için, Şekil 1A'daki fraksiyonel RLU'lar toplam % bozunma olarak hesaplanmış ve Şekil 1B'deki her zaman noktası için çizilmiştir. Bu, erken zaman noktalarında, 2 veya 4 saatte bile, CDK aile üyelerinin bazılarının zaman içinde yukarı doğru eğilim göstermeye devam eden yüksek düzeyde bozulma gösterdiğini göstermektedir (Şekil 1B).

Kinetik bozunma analizini göstermek için, BET ailesi üyesi proteinlerin her biri; BRD2, BRD3 ve BRD4, LgBiT proteini18'i kararlı bir şekilde eksprese eden HEK293 hücrelerindeki N-terminuslarında HiBiT ile endojen olarak etiketlendi. Bunlar daha sonra pan-BET PROTAC'ların üç farklı konsantrasyonu ile muamele edildi; Sereblon tabanlı dBET650 (Şekil 2A) ve VHL tabanlı ARV-77141 (Şekil 2B). Kinetik ölçümler 24 saatlik bir süre boyunca toplandı ve her konsantrasyondaki profillerden, BET aile üyesi yanıtındaki farklılıklar kolayca görülebilir. BRD2'nin bozunma sonrası bileşik tedavisinin daha hızlı bir geri kazanım yanıtı başlatma yeteneği (Şekil 2A, B) daha önce diğer pan-BET PROTAC'larla gözlemlenmiştir ve muhtemelen bozunma sürecine rekabetçi bir transkripsiyonel geri bildirim yanıtından kaynaklanmaktadır18.

Hem sonlanım noktası hem de kinetik analiz, tam bileşik doz yanıtı tedavileri ile yapılabilir. Şekil 3'te gösterilenler, dört farklı moleküler yapıştırıcı bileşiği 2,26,55,57 ile LgBiT proteinini kararlı bir şekilde eksprese eden Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat hücrelerinin tedavisinin kinetik doz yanıtı bozunma profilleridir; lenalidomid (Şekil 3A), iberdomid (CC-220) (Şekil 3B), talidomid (Şekil 3C) ve pomalidomid (Şekil 3D). Bu bozunucular, bileşikler arasında ve konsantrasyon serileri arasında bozunma tepkisinde önemli farklılıklar göstermektedir (Şekil 3).

Şekil 3'teki bileşiklerin bozunma ve sıralama sırasını nicel olarak değerlendirmek için, doz yanıt profilleri, bozunma hızı (Şekil 4A), Dmax (Şekil 4B) ve Dmax50 değerleri (Şekil 4B) dahil olmak üzere anahtar bozunma parametrelerini hesaplamak için kullanılmıştır. Bu analizler, iberdomid (CC-220) ve pomalidomidin çok benzer hızlı başlangıç bozunma oranlarına sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 4A), ancak iberdomid (CC-220) daha önce ortogonal çalışmalarda görüldüğü gibi en yüksek potansiyele sahiptir55,57 (Şekil 4B). Iberdomid bu kadar yüksek bir potens sergilediğinden ve test edilen tüm konsantrasyonlar% 50'den fazla bozulma gösterdiğinden, Iberdomid için elde edilen Dmax50 değeri, verilerin doğru bir şekilde uymasındaki sınırlamaya dayanan bir tahmini temsil eder. Şekil 3C, D ve Şekil 4B'deki grafiklerden, ne lenalidomid ne de talidomid, Ikaros / IKZF1 hedefini test edilen en yüksek konsantrasyonlarda tamamlanmasına indirgemez. Talidomid ile gözlenen çok az bozulma nedeniyle, bozunma izleri üstel bir bozunma modeline tam olarak uyamadı, bu nedenle bu tedavi için bozulma oranı ölçülmedi. En güçlü bozundurucu için, iberdomid (CC-220)55,57 (Şekil 4B). Hücre canlılığı multipleks testleri, test edilen konsantrasyonlar için hücre canlılığında herhangi bir kayıp göstermemiştir (Şekil 4C).

CDK bozunma kinetiği, fraksiyonel RLU'ya karşı zaman grafiği ve % bozulma çubuk grafiği, HiBiT testi.
Şekil 1: Pan-kinaz PROTAC ile CDK sonlanım noktası bozulması ve toksisitesi, TL12-18654. (A) CRISPR/Cas9 aracılığıyla C-terminus üzerinde HiBiT ile kaynaştırılan ve 2 saat, 4 saat, 8 saat ve 24 saat tedavide 1 μM TL12-186 PROTAC54 ile bozunma açısından değerlendirilen endojen CDK hedef proteinlerinin panelini seçin. Değerler, her zaman noktasında ölçülen bir DMSO kontrolüne göre Fraksiyonel RLU olarak temsil edilir. Hata çubukları, 3 teknik çoğaltmanın ortalamasının SD'sini temsil eder. (B) CDK hedef proteinlerinin panelinin yüzde bozunması, (A) dan hesaplanarak 2, 4, 8 ve 24 saatlik zaman noktalarında gözlemlenen her bir aile üyesinin bozulma miktarını temsil eder. Hata çubukları, 3 teknik çoğaltmanın ortalamasının SD'sini temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

BET ailesi bozulma profilleri; doz-yanıt grafiği; HiBiT-BRD2/BRD3/BRD4; Bileşik karşılaştırma.
Şekil 2: BET ailesi üyelerinin kinetik bozunma seçiciliğinin BET bozucuları, dBET650 ve ARV-77141 ile profillenmesi. Endojen BET ailesi üyelerinin, BRD2, BRD3 ve BRD4'ün kinetik bozunma profilleri, 1 nM (sol), 10 nM (orta) veya 100 nM (sağ) dBET650 (A) veya ARV-77141 (B) PROTAC'ların tek konsantrasyonlarının tedavisi ile CRISPR / Cas9 aracılığıyla N-terminus üzerinde HiBiT ile etiketlenmiştir. Değerler, her kinetik zaman noktasında bir DMSO kontrolünden hesaplanan Fraksiyonel RLU olarak temsil edilir. Hata çubukları, 4 teknik çoğaltmanın ortalamasının SD'sini temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ikaros IKZF1-HiBiT doz yanıt tablosu; Lenalidomid, İberdomid, Talidomid, Pomalidod.
Şekil 3: Moleküler tutkal paneli 2,26,55,57 ile Ikaros/IKZF1-HiBiT'nin canlı hücre kinetik bozunma doz yanıtı profilleri. LgBiT proteinini kararlı bir şekilde eksprese eden Jurkat hücreleri, Ikaros / IKZF1'in C-terminusunu HiBiT peptidi ile etiketlemek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanmıştır. Hücreler, dört farklı moleküler tutkal bileşiği 2,26,55,57'nin DMSO'sunu içeren 8 noktalı bir doz yanıtı konsantrasyon serisi ile tedavi edildi: (A) lenalidomid, (B) iberdomid (CC-220), (C) talidomid veya (D) pomalidomid. Lüminesans her 5 dakikada bir toplam 19.5 saat ölçüldü. (A-D)'den gelen göreceli ışık birimi (RLU) verileri, Adım 2.4.1'de açıklandığı gibi kesirli RLU'ya dönüştürüldü ve zamanın bir fonksiyonu olarak grafiklendirildi. Hata çubukları, 3 teknik kopyanın SD'sini temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ikaros bozunma oranları ve hücre canlılığı çalışması: konsantrasyon-yanıt grafikleri, karşılaştırmalı ilaç etkinliği.
Şekil 4: Ikaros/IKZF1-HiBiT için bozunma hızının ve Dmax50'nin hesaplanması ve hücre sağlığı tahlillerinin çoklanması. Kantitatif bozunma parametrelerini hesaplamak için Şekil 3'teki kinetik bozunma verileri kullanılmıştır. (A) Bozunma oranları ve (B) bozunma maksimum değerleri (Dmax), belirtilen moleküler tutkal bileşikleri2,26,55,57 için her ilaç konsantrasyonunda grafiklendirilir. (B) Her bileşik için Dmax50 değerleri, bir hedef için sıra bozunma bileşiklerini sıralamak için kullanılabilecek, kısıtlı Hill eğimi 1 olan bir doz-yanıt modeli kullanılarak hesaplanmıştır. (C) Şekil 3B'den iberdomid (CC-220)55,57 bozunma dozu yanıtı ile hücre canlılığı testleri, kinetik bozunma ölçümlerinin tamamlanmasının ardından son nokta ölçümü olarak gerçekleştirilmiştir. Hata çubukları, 3 teknik kopyanın SD'sini temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ekstrem bileşik aktivitesini sonlanım noktası litik formatında veya canlı hücre kinetik modunda taramak için iki yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşımlar aynı ışıldayan ölçüm prensiplerine dayanır, ancak farklı ayrıntı ve anlayış seviyeleri sağlar. Her iki yaklaşımın seçimi de muhtemelen tarama hedeflerine ve bileşik kütüphanenin boyutuna bağlı olacaktır. Büyük bileşik tarama güverteleri veya birincil eleklerin tespit edilebilir herhangi bir bozulmayı gözlemlemesi için, uç nokta litik tarama, batı lekesi veya kütle spektrometresi gibi diğer uç nokta yaklaşımlarının pratik olmadığı veya uyarlanmasının zor olabileceği hassas ve verimli yüksek verimli uyumluluk sunar14. Bu ekranlar için bir başlangıç noktası, sınırlı sayıda konsantrasyon ve zaman noktası ile gerçekleştirilebilir. Test etmek için önerilen başlangıç konsantrasyonları, düşük potansiyele, zayıf geçirgenliğe sahip veya bazı durumlarda yüksek etkili bileşiklere sahip ilk bozundurucuları hesaba katmak için 100 nM-10 μM aralığındadır. Ayrıca, 4-6 saatte erken başlangıçlı bozunmayı ve 18-24 saatte gizli veya sürekli bozulmayı sağlamak için en az iki farklı zaman noktasının test edilmesi önerilir. Yüksek bozunma potansiyeli ve hedef üzerinde mekanizma sergileyen bileşikler 4-6 saatlik bir zaman diliminde kolayca gözlenirken, sadece daha sonraki zaman noktalarında gözlenen bozulma veya görünür protein kaybı çeşitli mekanizmalardan kaynaklanabilir. Hücre canlılığının hem erken hem de geç zaman noktalarında izlenmesi şiddetle tavsiye edilir, böylece protein kaybı hücre ölümüne bağlı kayıptan ayrılabilir. Herhangi bir ışıldayan veya floresan tahliline benzer şekilde, kütüphanelerdeki bileşiklerin sinyale müdahale etme veya inhibe etme potansiyeli vardır, bu nedenle, ilgisiz füzyonlar veya protein seviyesini izlemeye alternatif yaklaşımlar kullanan kurşun bileşikleri ile ortogonal takip deneyleri, bu tahlillerde RLU kaybının doğrudan hedef protein bozulması ile ilişkili olduğunu değerlendirmek için önemli olacaktır.

Uzun süreler boyunca canlı hücre kinetik formatında tarama yeteneği, arka plana yapılan tahlil sinyaline (S: B) büyük ölçüde dayanır. S: B'ye katkıda bulunan faktörler, hedef proteinin kendisinin ekspresyon seviyesini, birkaç büyüklük sırasını kapsayabilen ekspresyon seviyesini, peptid yerleştirilmesi için seçilen hücre hattındaki LgBiT ekspresyonunun verimliliğini, ve çeşitli yerel komplekslerinde tamamlama için etiketli hedefin kullanılabilirliği. Kinetik moddaki bozulmayı Endurazin veya Vivazine ile başarılı bir şekilde ölçmek için 15'lik bir S: B'den oluşan genel bir kesme gereksinimi belirledik. S: B, Endurazin veya Vivazine canlı hücre substratlarının varlığında tek başına LgBiT'yi eksprese eden düzenlenmemiş ebeveyn hücrelerine göre LgBiT'yi birlikte eksprese eden HiBiT düzenlenmiş hücrelerin taban çizgisi sinyalinin ölçülmesiyle belirlenir. Vivazine daha yüksek bir ışıldayan sinyal üretecek, ancak Endurazine'den daha hızlı bozunacak ve sinyal alımını 24 saat veya daha kısa bir süre ile sınırlayabilir. Ayrıca, S: B, CRISPR havuzlarının mı yoksa klonların mı kullanıldığına da büyük ölçüde bağımlı olabilir. CRISPR / Cas9 mühendisliği için daha uygun ve yüksek verimliliğe sahip hücre hatlarındaki hedefler için, düzenlenmiş hücrelerin heterojen bir CRISPR havuz popülasyonu, kinetik analiz için yeterli S: B'ye sahip olabilir. CRISPR aracılığıyla daha az verimli genomik entegrasyonun düşük S: B'li havuzlarla sonuçlandığı daha zor hücre hatlarındaki hedefler için, düzenlenmiş popülasyonları zenginleştirmek ve kinetik analiz için yeterince yüksek bir S: B elde etmek için CRISPR klonlarını izole etmek gerekebilir. Bu senaryolardan herhangi biri için, S: B, Endurazin veya Vivazine substratları ile 15'ten küçükse, son nokta litik taraması önerilir.

Kantitatif parametrelerle bir bozunma profilinin belirlenmesi de dahil olmak üzere bileşiklerin daha iyi anlaşılması ve karakterizasyonu için, canlı hücrelerde gerçek zamanlı kinetik analiz önerilen tarama yaklaşımıdır14,18. Yukarıda tartışılan son nokta analizi gibi, ilk kinetik tarama, yüksek verimli bir şekilde 100nM-10μM aralığında sınırlı sayıda konsantrasyonla yapılabilir. 384 kuyucuklu formatta, 100'den fazla bileşik, tek bir plaka üzerinde bir konsantrasyonda üçlü olarak kolayca taranabilir. Ortaya çıkan bozunma profilleri sadece gözlemlenen bozulmanın kapsamı hakkında değil, aynı zamanda bozulma oranı, bozulma süresi ve protein 14,18'in potansiyel geri kazanımı konusunda da rehberlik sağlayacaktır (Şekil 2 ve Şekil 3). Bozunma profilinin şekilleri de değerli bilgiler verir. Spesifik ve güçlü bozunucular genellikle hedef proteinin birkaç saat içinde bir platoya hızlı bir şekilde kaybolduğunu gösterir18,53, oysa transkripsiyonel geri besleme veya bileşik toksisite gibi diğer mekanizmalar tipik olarak proteinin zamanla daha doğrusal kaybına neden olur. Bu detaylar ve nüanslar, uç nokta litik analizi ile kaçırılır ve 24-48 saat boyunca gerçek zamanlı analizle, yeni veya bilinmeyen bileşik kümeleri içinde gerçek Dmax'ı yakalama zamanını tahmin etmek zorunda kalmazsınız.

Gerçek zamanlı kinetik, bileşik etkinliğini, bileşik konsantrasyonunun ilk bozunma oranını nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için etkili doz yanıtı taramasına izin verir ve bileşikleri birden fazla parametreye göre sıralama olanakları sunar. Klasik bozunma potansiyeli ölçümleri, görünür bozunma maksimumuna dayanan belirli bir zamanda DC50 hesaplamalarını içerir. Buna karşılık, potensi değerlendirmek için kinetik yaklaşımımız,18. zamanda ne zaman meydana geldiğine bakılmaksızın her konsantrasyonda gerçek bozulma maksimumunu içerir. Kinetik bozunma potansiyelinin bu ölçümüne Dmax5018 diyoruz. Bu şekilde analiz, daha düşük konsantrasyonlarda bozulmayı daha yavaş başlatabilen ve bu nedenle Dmax'larına ulaşmak için işlem sonrası daha uzun zaman alabilen bileşikleri açıklar. Bileşikleri hem bozunma hızına hem de Dmax'a göre sıralamak özellikle bilgilendirici olabilir. En güçlü bozundurucular için bu, yavaş ama güçlü bozucuları hem hızlı hem de güçlü olanlardan daha da farklılaştıracaktır. Birlikte, HiBiT CRISPR hücre hatlarını kullanan hem litik hem de canlı hücre kinetik taraması, hedeflenen protein bozunumunun, bileşik fonksiyonunun daha kapsamlı bir resmini veren ve anahtar bozunma parametrelerinin iyileştirilmesi yoluyla ilk aktivite değerlendirmesinden aşağı akış kimyasal optimizasyonuna kadar tarama sürecini sağlayan güçlü yaklaşımlardır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Promega Corporation, HiBiT ve NanoLuc teknolojilerinin ve uygulamalarının patentlerinin atanmasıyla ticari sahibidir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.M.R, S.D.M, M.U. ve D.L.D, Promega Corporation'ın tüm çalışanlarıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CellTiter-Glo 2.0 reaktifiPromegaG9241Hücre Canlılığı ışıldayan deneyi
CellTiter-Fluor Hücre Canlılığı TestiPromegaG6080Hücre Canlılığı floresan testi
CO2 bağımsız ortamThermoFisher18045-088Hücre kültürü
DMSOSigma AldrichD2650Bileşik seyreltme ve kontrol için
DPBSGibco14190Hücre kültürü
Fetal Sığır SerumuSeradigm89510-194Hücre kültürü
HEK293 LgBiT kararlı hücre hattıPromegaN2672Lüminesans oluşturmak için HiBiT ile tamamlama için
HiBiT CRISPR memeli hücre hattıPromegahttps://www.promega.com/crispr-tpd
Higromisin B çözeltisiGibco10-687-010Hücre kültürü
LgBiT BacMamPromegaCS1956C01Lüminesans oluşturmak için HiBiT ile tamamlama için
LgBiT İfade VektörüPromegaN2681Lüminesans oluşturmak için HiBiT ile tamamlama için
Luminometre Plaka OkuyucuLüminesans ve floresan ölçebilen luminomenter (ör. GloMax Discover System, Promega GM3000)
NanoGlo Endurazin canlı hücre substratıPromegaN2570Kinetik HiBiT reaktifi
NanoGlo Vivazine canlı hücre substratıPromegaN2580Kinetik HiBiT reaktifi
NanoGlo HiBiT Litik Tespit sistemiPromegaN3030Enpoint litik HiBiT reaktifi
Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı, fenol kırmızısı içermez (ThermoFisher)ThermoFisher11058-021Hücre kültürü
Doku kültürü plakaları, beyaz, 96 oyuklu plakaCostar3917Hücre kültürü
Doku kültürü plakaları, beyaz, 384 oyuklu plakaCorning3570Hücre kültürü
Tripsin/EDTAGibco25300Hücre kültürü

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burslem, G. M., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras as therapeutics and tools for biological discovery. Cell. 181 (1), 102-114 (2020).
  2. Chamberlain, P. P., Hamann, L. G. Development of targeted protein degradation therapeutics. Nature Chemical Biology. 15 (10), 937-944 (2019).
  3. Churcher, I. Protac-induced protein degradation in drug discovery: Breaking the rules or just making new ones. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 444-452 (2018).
  4. Ciulli, A., Farnaby, W. Protein degradation for drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 1-3 (2019).
  5. Crews, C. M. Inducing protein degradation as a therapeutic strategy. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 403-404 (2018).
  6. Cromm, P. M., Crews, C. M. Targeted protein degradation: from chemical biology to Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1181-1190 (2017).
  7. Deshaies, R. J. Protein degradation: Prime time for PROTACs. Nature Chemical Biology. 11 (9), 634-635 (2015).
  8. Lai, A. C., Crews, C. M. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 101-114 (2017).
  9. Ottis, P., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras: Induced protein degradation as a therapeutic strategy. ACS Chemical Biology. 12 (4), 892-898 (2017).
  10. Wu, T., et al. Targeted protein degradation as a powerful research tool in basic biology and drug target discovery. Nature Structural and Molecular Biology. 27, 605-614 (2020).
  11. Hanan, E. J., et al. Monomeric targeted protein degraders. Journal of Medicinal Chemistry. , (2020).
  12. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  13. Carmony, K. C., Kim, K. B. PROTAC-induced proteolytic targeting. Methods in Molecular Biology. 832, 627-638 (2012).
  14. Daniels, D. L., Riching, K. M., Urh, M. Monitoring and deciphering protein degradation pathways inside cells. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 61-68 (2019).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An emerging targeting technique for protein degradation in drug discovery. Bioessays. 40 (4), 1700247(2018).
  16. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology and Therapy. 174, 138-144 (2017).
  17. Raina, K., Crews, C. M. Targeted protein knockdown using small molecule degraders. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 46-53 (2017).
  18. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  19. Schwinn, M. K., et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
  20. Schwinn, M. K., Steffen, L. S., Zimmerman, K., Wood, K. V., Machleidt, T. A simple and scalable strategy for analysis of endogenous protein dynamics. Science Reports. 10 (1), 8953(2020).
  21. Bensimon, A., et al. Targeted degradation of SLC transporters reveals amenability of multi-pass transmembrane proteins to ligand-induced proteolysis. Cell Chemical Biology. 27 (6), 728-739 (2020).
  22. Bondeson, D. P., et al. Lessons in PROTAC design from selective degradation with a promiscuous warhead. Cell Chemical Biology. 25 (1), 78-87 (2018).
  23. Buckley, D. L., et al. HaloPROTACS: Use of small molecule PROTACs to induce degradation of HaloTag fusion proteins. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1831-1837 (2015).
  24. Bulatov, E., Ciulli, A. Targeting Cullin-RING E3 ubiquitin ligases for drug discovery: structure, assembly and small-molecule modulation. Biochemical Journal. 467 (3), 365-386 (2015).
  25. Burslem, G. M., et al. The advantages of targeted protein degradation over inhibition: An RTK case study. Cell Chemical Biology. 25 (1), 67-77 (2018).
  26. Chamberlain, P. P., et al. Evolution of cereblon-mediated protein degradation as a therapeutic modality. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (12), 1592-1602 (2019).
  27. Crew, A. P., et al. Identification and characterization of Von Hippel-Lindau-recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 583-598 (2018).
  28. DeMars, K. M., Yang, C., Castro-Rivera, C. I., Candelario-Jalil, E. Selective degradation of BET proteins with dBET1, a proteolysis-targeting chimera, potently reduces pro-inflammatory responses in lipopolysaccharide-activated microglia. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (1), 410-415 (2018).
  29. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  30. Farnaby, W., et al. BAF complex vulnerabilities in cancer demonstrated via structure-based PROTAC design. Nature Chemical Biology. 15 (7), 672-680 (2019).
  31. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  32. Gechijian, L. N., et al. Functional TRIM24 degrader via conjugation of ineffectual bromodomain and VHL ligands. Nature Chemical Biology. 14 (4), 405-412 (2018).
  33. Gustafson, J. L., et al. Small-Molecule-Mediated Degradation of the Androgen Receptor through Hydrophobic Tagging. Angewandte Chemie International Edition England. 54 (33), 9659-9662 (2015).
  34. Kerres, N., et al. Chemically induced degradation of the oncogenic transcription factor BCL6. Cell Reports. 20 (12), 2860-2875 (2017).
  35. Lohbeck, J., Miller, A. K. Practical synthesis of a phthalimide-based Cereblon ligand to enable PROTAC development. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 26 (21), 5260-5262 (2016).
  36. Lu, J., et al. Hijacking the E3 ubiquitin ligase cereblon to efficiently target BRD4. Chemical Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  37. Lu, M., et al. Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway. Eurupean Journal of Medicinal Chemistry. 146, 251-259 (2018).
  38. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  39. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14, 706-714 (2018).
  40. Powell, C. E., et al. Chemically induced degradation of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (9), 4249-4255 (2018).
  41. Raina, K., et al. PROTAC-induced BET protein degradation as a therapy for castration-resistant prostate cancer. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (26), 7124-7129 (2016).
  42. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceeding National Academy Science. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  43. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular Cell Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  44. Schiedel, M., et al. Chemically induced degradation of Sirtuin 2 (Sirt2) by a proteolysis targeting chimera (PROTAC) based on sirtuin rearranging ligands (SirReals). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 482-491 (2018).
  45. Slabicki, M., et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K. Nature. , (2020).
  46. Smith, B. E., et al. Differential PROTAC substrate specificity dictated by orientation of recruited E3 ligase. Nature Communications. 10 (1), 131(2019).
  47. Sun, B., et al. BET protein proteolysis targeting chimera (PROTAC) exerts potent lethal activity against mantle cell lymphoma cells. Leukemia. 32 (2), 343-352 (2018).
  48. Tong, B., et al. A Nimbolide-based kinase degrader preferentially degrades oncogenic BCR-ABL. ACS Chemical Biology. 15 (7), 1788-1794 (2020).
  49. Winter, G. E., et al. Drug Development. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  50. Winter, G. E., et al. BET Bromodomain proteins function as master transcription elongation factors independent of CDK9 recruitment. Molecular Cell. 67 (1), 5-18 (2017).
  51. Zengerle, M., Chan, K. H., Ciulli, A. Selective Small Molecule Induced Degradation of the BET Bromodomain Protein BRD4. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1770-1777 (2015).
  52. Zhang, C., et al. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) of anaplastic lymphoma kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  53. Zoppi, V., et al. Iterative design and optimization of initially inactive proteolysis targeting chimeras (PROTACs) identify VZ185 as a potent, fast, and selective von Hippel-Lindau (VHL) based dual degrader probe of BRD9 and BRD7. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (2), 699-726 (2019).
  54. Huang, H. T., et al. A chemoproteomic approach to query the degradable kinome using a multi-kinase degrader. Cell Chemical Biology. 25 (1), 88-99 (2018).
  55. Bjorklund, C. C., et al. Iberdomide (CC-220) is a potent cereblon E3 ligase modulator with antitumor and immunostimulatory activities in lenalidomide- and pomalidomide-resistant multiple myeloma cells with dysregulated CRBN. Leukemia. 34 (4), 1197-1201 (2020).
  56. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  57. Matyskiela, M. E., et al. A cereblon modulator (CC-220) with improved degradation of Ikaros and Aiolos. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 535-542 (2018).
  58. Bussiere, D. E., et al. Structural basis of indisulam-mediated RBM39 recruitment to DCAF15 E3 ligase complex. Nature Chemical Biology. 16 (1), 15-23 (2020).
  59. Du, X., et al. Structural basis and kinetic pathway of RBM39 recruitment to DCAF15 by a sulfonamide molecular glue E7820. Structure. 27 (11), 1625-1633 (2019).
  60. Ting, T. C., et al. Aryl sulfonamides degrade RBM39 and RBM23 by recruitment to CRL4-DCAF15. Cell Reports. 29 (6), 1499-1510 (2019).
  61. Hughes, S. J., Ciulli, A. Molecular recognition of ternary complexes: a new dimension in the structure-guided design of chemical degraders. Essays in Biochemistry. 61 (5), 505-516 (2017).
  62. Schapira, M., Calabrese, M. F., Bullock, A. N., Crews, C. M. Targeted protein degradation: expanding the toolbox. Nature Review Drug Discovery. 18 (12), 949-963 (2019).
  63. Dixon, A. S., et al. NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  64. Gilan, O., et al. Selective targeting of BD1 and BD2 of the BET proteins in cancer and immuno-inflammation. Science. 368 (6489), 387-394 (2020).
  65. Oh-Hashi, K., Furuta, E., Fujimura, K., Hirata, Y. Application of a novel HiBiT peptide tag for monitoring ATF4 protein expression in Neuro2a cells. Biochemical Biophysical Report. 12, 40-45 (2017).
  66. Ottis, P., et al. Cellular resistance mechanisms to targeted protein degradation converge toward impairment of the engaged ubiquitin transfer pathway. ACS Chemical Biology. 14 (10), 2215-2223 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

HiBiT CRISPR Cell LinesTargeted Protein DegradationPROTAC CompoundsMolecular GluesEndogenous TaggingLuminescent DetectionKinetic Degradation AnalysisDose Response ProfilingCell Viability MultiplexingNanoBRET Technology

İlgili makaleler