Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Virüslerin dinamik replikasyon ve montaj süreçlerini yakalamak, viral nükleik asit ve proteinin hassas ve eşzamanlı olarak etiketlenmesini sağlayan sağlam in situ hibridizasyon (ISH) teknolojilerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Konvansiyonel DNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleri genellikle immün boyama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesini sağlayan MICDDRP (MULTIPLEX IMMUNOFLUORESCENT CELL-BASED D ETECTION OF DNA, RNA ve protein) adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik. Geleneksel DNA FISH'lerle karşılaştırıldığında, micddrp, oligonükleotid probu duyarlılığını ve tespitini önemli ölçüde artıran dallanmış DNA (bDNA) ISH teknolojisini kullanır. MICDDRP'nin küçük modifikasyonları, viral proteinlerin farklı sarmallara sahip nükleik asitlerle (RNA veya DNA) eşzamanlı olarak görüntülenmesini sağlar. Bu protokolleri, insan immün yetmezlik virüsü (HIV)-1, insan T-lenfotropik virüsü (HTLV)-1, hepatit B virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV), Zika virüsü (ZKV) ve influenza A virüsü (IAV) dahil olmak üzere çoklu viral patojenlerin yaşam döngülerini incelemek için uyguladık. Viral nükleik asitleri ve proteinleri çeşitli virüslerde etkili bir şekilde etiketleyebileceğimizi gösterdik. Bu çalışmalar bize çoklu viral sistemlerin gelişmiş mekanik anlayışını sağlayabilir ve ek olarak, DNA, RNA ve proteinin çok katlı floresan görüntülemesinin geniş bir hücresel sistem spektrumunda uygulanması için bir şablon görevi görebilir.
Giriş
Geleneksel immün boyama yaklaşımlarıyla proteinleri spesifik olarak etiketlemek için binlerce ticari antikor mevcut olsa da ve füzyon proteinleri, bir örnek1'deki birden fazla proteini izlemek için foto-optimize floresan etiketlerle tasarlanabilirken, proteinin mikroskobik görselleştirilmesi genellikle geleneksel DNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH) ile uyumlu değildir2 . Floresan tabanlı yaklaşımlar kullanılarak DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesindeki teknik sınırlamalar, virüs replikasyonunun derinlemesine anlaşılmasını engellemiştir. Enfeksiyon sırasında hem viral nükleik asidin hem de pro....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kapak kapakları veya oda slaytları üzerindeki tohum hücreleri (Süspansiyon vs Yapışkan Hücreler) (sunulan protokol kapakları kullanır).
- Süspansiyon hücrelerinin tohumlanması
- Poli-D-lizin (PDL) kaplı örtü kızaklarını hazırlayın (süspansiyon hücrelerinin örtü kaymasına yapışmasını kolaylaştırır) önce 5 dakika boyunca etanol (EtOH) içindeki örtü kaymalarını inkübe ederek (örtü kaymalarını sterilize eder ve herhangi bir kalıntıyı giderir). Daha sonra, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika (dak) boyunca PDL'de (20 μg / mL) örtüleri inkübe etmeden önce fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2x yıkayın.
- PDL'yi çıkarın ve PBS'de 2 kat yıkayın. Pe....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MICDDRP'nin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. DNA ve RNA'nın etiketlenmesini immün boyama izler. Dallanma yükselteçlerinin kullanımı sinyali arttırır ve tek nükleik asit moleküllerinin tespit edilmesini sağlar.
Şekil 1: MICDDRP şeması ve adım adım iş akışı. (A) bDNA sinyali, viral DNA (1) ve RNA türlerinin (2) tespi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesi genellikle kapsamlı optimizasyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan iki yöntem 5-etinil-2-deoksiüridin (EdU) etiketleme ve DNA FISH'tir. EdU etiketlemesi, viral DNA ve proteini aynı anda görselleştirmek için uygulanmıştır, çünkü EdU yeni ortaya çıkan DNA'ya dahil edilir ve daha sonra tıklama kimyası yoluyla azid içeren floresan boyalarla etiketlenir. Bu nedenle EdU etiketlemesi, DNA virüslerinin veya virüslerin yerel virüs replikasyon kinetiğini replika.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma tamamen veya kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 ve U54 AI150472) tarafından desteklenmiştir. Dr. Raymond F. Schinazi ve Sadie Amichai'ye influenza A Virüsü ile enfekte olmuş hücreleri sağladıkları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DNA hibridizasyon tamponu için | |||
| 50X yıkama tamponu | ACD Bio | 320058 | |
| 6 oyuklu plakalar | |||
| Amplifikatör 1-FL | ACD Biyo | ||
| Amplifikatör 2-FL | ACD Biyo | ||
| Amplifikatör 3-FL | ACD | ||
| Biyo Amplifikatör 4-FL | ACD Bio | Danışın Protokolde Amp-4 tablosu | |
| Anti-HCV NS5a antikoru | Abcam | ab13833 | Fare monoklonal; HCV genotipleri 1a, 1b, 3 ve 4 ile çalışır |
| Anti-HIV-1 p24 monoklonal antikoru | NIH AIDS Reaktif Programı | 3537 | |
| Anti-Mov10 antikoru | Abcam | ab80613 | Tavşan poliklonal |
| Anti-PB1 antikoru | GeneTex | GTX125923 | Grip proteinine karşı antikor |
| Sığır serum albümini | İmmün boyama için bloke edici reaktif | ||
| Takviyeli | Hücre modeline uygun ortam | ||
| Lameller | |||
| DAPI | ACD Bio | Nükleer boyama (ACD Bio'dan RNAscope kiti) | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (1X PBS) | Gibco | 14190250 | Kalsiyum ve magnezyum içermez |
| Etilen karbonat | Sigma | E26258 | |
| Fetal sığır serumu (FBS)Hangi | serum ikincil antikorunun yükseltildiğine bağlı olarak spesifik FBS kullanın (ör. keçi FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus mikroskop slaytları | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Önceden temizlenmiş |
| HCV-GT2a-sense-C2 probu | ACD Bio | 441371 | HCV (+) sense RNA probu |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probu |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probu |
| HybEZ hibridizasyon fırını | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hidrofobik bariyer kalemi | Vektör Laboratuvarları | H-4000 | |
| Oje | Proteaz tedavisinden önce lamel kaymak için immobolize etmek için | ||
| Nukleaz içermeyen su | Ambion | AM9937 | |
| Poli-d-lizin (PDL) | 20 & mikro'da kaplama lamelleri; 30 dakika boyunca g/mL PDL | ||
| Prob seyreltici | ACD Bio | 300041 | RNA C2 veya C3 problarını seyreltmek için |
| Altın antifadesi | Invitrogen | P36930 | |
| Proteaz III | ACD | Bio 322337 | |
| RNAscope® Prob- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| İkincil antikorlar | |||
| Slaytlar | |||
| DNA hibridizasyon tamponu için | sodyum klorür | ||
| Sodyum sitrat, pH 6.2 | DNA hibridizasyon tamponu | ||
| Tween-20 | için | DNA hibridizasyon tamponu ve PBS-T | |
| V-HBV-GTD | ACD | Bio 441351 | Toplam HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probu |
| V-HCV-GT2a probu | ACD Bio | 441361 | HCV(-) duyu RNA probu |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probu hedefleme HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probu |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) anlamlı RNA probu |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probu |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika (+) duyu RNA probu |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika (-) duyu RNA sonda |
Kaynaklar
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
