Geçici Bilateral Ortak Karotid Arter Tıkanması sonucu İndüklenen İskemik Retina Yaralanmasının Murine Modeli

Retina görme fonksiyonu için nörosensör bir dokudur. Görme fonksiyonu için önemli miktarda oksijen gerektiğinden, retina vücuttaki en yüksek oksijen talep eden dokulardan biri olarak bilinir¹. Oksijen kan damarlarından iletilirken retina damar hastalıklarına karşı hassastır. Diyabetik retinopati ve retinal kan damarı (damarlar veya arterler) tıkanıklığı gibi çeşitli damar hastalıkları retina iskemisine neden olabilir. Retina iskemisinin patolojik mekanizmalarını araştırmak için retina iskemisinin tekrarlanabilir ve klinik olarak ilgili deneysel modelleri gerekli kabul edilir. Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) intralüminal filament takılarak deneysel serebral iskemi^2,3in vivo kemirgen modellerinin geliştirilmesi için en genel olarak kullanılan yöntemdir. Oftalmik arterin (OpA) MCA'ya yakınlığı nedeniyle, MCAO modelleri retina iskemisinin patofizyolojisini anlamak için aynı anda da kullanılır^4,5,6. Retina iskemisi ile birlikte serebral iskemiyi teşvik etmek için, uzun filamentler tipik olarak ortak karotis arterin (CCA) veya dış karotid arterin (ECA) kesisi yoluyla yerleştirilir. Bu yöntemlerin yapılması zordur, ameliyatı tamamlamak için uzun bir süre gerektirir (bir fare için 60 dakikadan fazla) ve ameliyattan sonraki sonuçlarda yüksek farklılıklara yol açar⁷. Bu endişeleri iyileştirmek için daha iyi bir model geliştirmek önemli olmaya devam ediyor.

Bu çalışmada, farelerde retina iskemisini indük etmek için iğneler ve bir kelepçe ile kısa geçici bilateral CCA tıkanıklığı (tBCCAO) kullandık ve retinadaki iskemik yaralanmaların tipik sonuçlarını analiz ettik. Bu videoda, tBCCAO prosedürünün bir gösterisini vereceğiz.

Burada açıklanan tüm yöntemler Keio Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Cerrahi aletlerin ve hayvanların hazırlanması

1. Cerrahi aletleri otoklavlayın ve% 70 etil alkolde saklayın. Her yeni cerrahi işlemden önce cerrahi aletleri %70 etil alkol kullanarak dikkatlice temizleyin.
2. Ameliyattan önce, ameliyat sırasında ve sonrasında steril koşulları korumak için erkek BALB/cAJc1 farelerini (6 haftalık, 26-28 kg) belirli patojensiz (SPF) bir odada hazırlayın.

2. Geçici bilateral ortak karotis arter tıkanma (tBCCAO)

1. Daha önce^{açıklandığı}gibi "MMB" olarak adlandırılan midazolam (40 μg/100 μL), medetomidin (7,5 μg/100 μL) ve butorphanol tartrate (50 μg/100 μL) kombinasyonu ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bir fareyi anestezi altına^alın. Fare tamamen uyuşturulana kadar farenin gözlerini çarpmamasını önlemek için farenin arka kaplamalarını tutun.
   1. Tam anesteziyi kontrol etmek için yaygın olarak kullanılan yöntem olan yanıt alıncaya kadar fare baş parmağına sıkıştırarak anestezinin derinliğini yargılayın¹⁰.
      NOT: Farelerin uykuya dalmasına genellikle 5 dakikadan az bir süre gerekir. Genel anestezi için uygun tarifler kurumlar tarafından farklı olabilir.
2. Anestezi altında gözlerde kuruluğu önlemek için gözlere % 0.1 saflaştırılmış sodyum hyaluronat göz damlası çözeltisi uygulayın.
3. Fareyi arkasına yerleştirin ve yapışkan bantlar kullanarak farenin pençelerini sabitleyin.
4. Ameliyattan önce %70 etil alkol kullanarak farenin boyun bölgesini dezenfekte edin.
   NOT: Kürkün ek kupürü, sonraki cilt iltihabına neden olabileceğinden yapılmamıştır^11,12.
5. Boynun sagittal kesisini bir bıçakla gerçekleştirin (Şekil 1).
   NOT: Boyun, sternum ve trakea arasındaki orta hatta kesi yapılması gerekir.
6. Her iki tükürük bezini de iki forseps kullanarak dikkatlice ayırın ve alttaki CCA'ları görselleştirmek için harekete geçirin.
7. Doğru CCA'yı ilgili vagal sinirlerden ve eşlik eden damarlardan yapılarına zarar vermeden dikkatlice izole edin ve CCA'nın altına iki adet 6-0 ipek dikiş yerleştirin. Kan akışını engellemek için iki bağı sıkıca bağlayın (Şekil 1).
   NOT: İşlem sırasında küçük damarlar zarar görmüş olabilir. Kanama görülürse, CDA'ları net bir şekilde görselleştirmek için silme gereklidir.
8. Sol CCA'yı ilgili vagal sinirlerden ve eşlik eden damarlardan yapılarına zarar vermeden dikkatlice bulun ve sol CCA'yı bir kelepçe ile 2 saniye boyunca tıkayın (Şekil 1).
   NOT: Bir yeri sıkıştırmak için sol CCA'nın altına 6-0 ipek dikiş iğnesi yerleştirilmesi gerekir.
9. Sol CCA'nın yeniden açılmasından sonra, boynun dikiş yaraları 6-0 ipek dikiş ile ve bakteriyel enfeksiyonu inhibe etmek için boyuna bir dab antibiyotik (50 μL) uygulayın.
   NOT: Sol CCA'nın yeniden açılması sırasında arteriyel duvara zarar vermemek için bir kelepçeyi yavaşça çıkarın.
10. Farenin derin anesteziden hızlı bir şekilde kurtulmasına yardımcı olmak için fareye intraperitoneal olarak 0,75 mg/kg atipamezole hidroklorür enjekte edin. Fareyi önceden ısıtılmış pedlere sahip bir fare kafesine geri döndürün.
    NOT: Fare sternal recumbency korumak için yeterli bilinci kazanana kadar farenin başıboş kalmasına izin vermeyin.
11. Fare uyandığında ağrının yönetimi için fareye 0,4 mg / kg butorphanol tartrate enjekte edin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Başarılı tBCCAO için ilk ipucu olarak, farenin göz kapağı sarkması gözlenebilir (Şekil 2).
12. Ötenazi için, farelere 3x MMB karışımı enjekte edin ve deneyler için kurban edin.

3. Genel gözlemler (sağkalım oranları ve göz kapağı sarkması)

1. Ameliyattan sonra, 0 (ameliyattan sonra), 1, 3 ve 7.
2. Göz kapağı sarkması 4 puanlık bir derecelendirme ölçeği ile değerlendirin: 1 = sarkma yok, 2 = hafif sarkıklık (~%50), 3 = şiddetli sarkıklık (%50'nin üzerinde) ve 4 = göz akıntısı ile şiddetli sarkıklık.

4. Retina kanı perfüzyonu

1. Fare retina damarlarında kan perfüzyonunun gözlemlenmesi için yaygın olarak kullanılan farenin sol ventrikülüne 200 μL FITC-dektran (25 mg/mL) enjekte edin^13,14.
2. Dolaşımdan 2 dakika sonra, gözleri enükle edin ve 1 saat boyunca% 4 paraformaldehitte sabitleyin. Retinalar, daha önce¹⁵olarak tanımlandığı gibi dikkatlice elde edildi ve düz monte edildi ve floresan mikroskobu ile incelendi.
3. Retina bütün montajlarının fotoğraflarını 4x büyütmede çekin ve daha önce açıklanan bir birleştirme çözümleyicisi kullanarak tek bir tanede birleştirin¹⁶.
4. NIH Fiji/ImageJ yazılımındaki bir gemi analiz aracıyla perfüzyon alanlarını ölçün.

5. Batı lekesi

1. TBCCAO'dan 3 ve 6 saat sonra, farelerin gözlerini elde edin ve retinaları izole etmek için hemen soğuk PBS içeren bir Petri kabına aktarın.
2. Retinaların izolasyonundan sonra, daha önce açıklandığı gibi batı şişkinliği gerçekleştirin⁹.
3. Hipoksi-indükleyici faktör-1α (HIF-1α; genel bir hipoksi belirteci) ve β-Actin (iç yükleme kontrolü) için bir gecede antikorlarla kuluçkaya yatırın ve ardından HRP konjuge sekonder antikorların inkübasyonu. Sinyalleri chemiluminescence ile görselleştirin.

6. Nicel PCR (qPCR)

1. tBCCAO'dan 6, 12 ve 24 saat sonra, daha önce açıklandığı gibi qPCR için elde edilen retinaları işleyin¹⁷.
2. QPCR'ı gerçek zamanlı PCR sistemi ile gerçekleştirin. Kullanılan astarlar Tablo 1'de listelenmiştir. ΔΔC_T yöntemi ile farklı transkript seviyeleri arasındaki kat değişimlerini hesaplayın.

7. İmmünohistokimya (IHC)

1. TBCCAO'dan 3 gün sonra farelerin gözlerini elde edin ve parafin içine gömün.
2. Göz bölümlerini elde etmek için parafin gömülü gözleri bir mikrotom ile kesin.
3. Daha önce açıklandığı gibi 5 μm kalınlığındaki göz bölümlerini renksizleştirin ve lekelendirin¹³.
4. Glial fibril asidik protein (GFAP; retinadaki astrositler ve Müller hücreler için güvenilir bir belirteç) için bir antikor ile kuluçkaya yatır ve ardından Alexa Fluor 555 konjuge sekonder antikor inkübasyonu.
5. Retinadaki çekirdeği boyamak için DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindole) kullanın. Sinyalleri floresan mikroskopla görselleştirin.
6. Morfoloji puanlamasını daha önce açıklandığı gibi 4 puanlık bir derecelendirme ölçeğiyle değerlendirin^13,18: 0 = sinyal yok, 1 = ganglion hücre katmanında (GCL) birkaç pozitif glial son ayak, 2 = GCL'den dış nükleer katmana (ONL) ulaşan birkaç etiketli süreç ve GCL'den ONL'ye ulaşan en etiketli süreçler.

8. Elektroretinografi (ERG)

1. tBCCAO'dan 3 ve 7 gün sonra, daha önce açıklandığı gibi bir Ganzfeld kubbesi, satın alma sistemi ve LED uyarıcılar kullanarak ERG gerçekleştirin⁹.
2. Bir gecede karanlık adaptasyonu takiben, fareleri loş kırmızı ışık altında MMB kombinasyonu ile uyuşturun.
3. Gözbebeklerini genişletmek için %0,5 tropikamid ve %0,5 fenilefrin gibi karışık bir çözelti kullanın.
4. Aktif elektrotları kontakt lense yerleştirin ve referans elektrotları ağız içine yerleştirin.
5. Her hayvanın her iki gözünden ERG yanıtları alın.
6. Çeşitli uyaranlarla karanlık adaptasyon altında scotopik yanıtları kaydedin.
7. Bir dalganın genliklerini taban çizgisine ve en düşük dalga noktasına kadar ölçün.
8. B dalgasının genliklerini bir dalganın en düşük noktasından b dalgasının zirvesine kadar ölçün.
9. İşlem sırasında ısı pedlerini kullanarak tüm fareleri sıcak tutun.

9. Optik tutarlılık tomografisi (OCT)

1. tBCCAO'dan 2 hafta sonra, daha önce bildirildiği gibi SD-OCT sistemini kullanarak OCT^{gerçekleştirin8},⁹.
2. Ölçüm için, fareleri% 0.5 tropikamid ve% 0.5 fenilefrin karışımı ile midriasis'e ve MMB karışımı ile genel anesteziye tabi edin.
3. Ekvatoral en-face tarama dilimlerinden B tarama görüntüleri elde edin.
4. Retinaları optik sinir kafasından 0.2, 0.4 ve 0.6 mm'de inceleyin.
5. Retina sinir lifi tabakasından (NFL) dış sınırlayıcı zara (ELM) kadar retina kalınlığını ölçün ve ölçülen değerlerin ortalamasını tek bir farenin retina kalınlığı olarak düşünün.
6. Sonuçları örümcek diyagramları olarak çizin.

FITC-dektranın 2 dakika boyunca sistemik dolaşımından sonra, sham ile çalışan farelerde ve tBCCAO tarafından işletilen farelerde sol ve sağ retinaların retinal vaskülatları incelendi (Ek Şekil 1). FITC-dektran, sham tarafından işletilen farelerde hem retinalarda hem de tBCCAO tarafından işletilen farelerde sol retinada tamamen görünürken, tBCCAO tarafından işletilen farelerde sağ retinada kısmen tespit edilebilirdi.

TBCCAO'dan sonra göz kapağı sarkması incelendi (Şekil 2

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.