Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Malimid-tiyol kimyası ve sortase A aracılı ligasyon ile bölgeye özgü sitotoksik protein konjugatlarının hazırlanması

1.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61918

⸱

5 Ocak 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Protein Engineering, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, 2Department of Protein Biotechnology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

Bu makalede

Özet

Burada, maleimid-tiyol reaksiyonu ve sortaz A aracılı ligasyon kullanılarak sitotoksik ilaçlarla proteinlerin bölgeye özgü etiketlenmesi için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.

Özet

Kanser şu anda dünya çapında en yaygın ikinci ölüm nedenidir. Kanser hücrelerinin ayırt edici özelliği, yüzeylerinde büyüme faktörü reseptörleri gibi spesifik işaretleyici proteinlerin varlığıdır. Bu özellik, spesifik bir bağlayıcı ile yüksek sitotoksik ilaçlara bağlanan hedefleme proteinlerinden (antikorlar veya reseptör ligandları) oluşan protein biyokonjugatları olan oldukça seçici terapötiklerin geliştirilmesini sağlar. Hedefleme proteinlerinin çok yüksek afinitesi ve seçiciliği nedeniyle, biyokonjugatlar kanser hücrelerinin yüzeyindeki işaretleyici proteinleri tanır ve hücre içine ulaşmak için reseptör aracılı endositozu kullanır. Hücre içi veziküler taşıma sistemi nihayetinde biyokonjugatları lizozomlara iletir, burada proteoliz, serbest sitotoksik ilaçları biyokonjugatların proteinli çekirdeğinden ayırır ve ilaca bağımlı kanser hücresi ölümünü tetikler. Şu anda, kanser tedavisi için onaylanmış birkaç protein biyokonjugatı vardır ve büyük bir kısmı geliştirme veya klinik denemeler aşamasındadır.

Biyokonjugatların üretilmesindeki ana zorluklardan biri, sitotoksik ilacın hedeflenen proteine bölgeye özgü bir şekilde bağlanmasıdır. Son yıllarda, sitotoksik ilaçlarla protein modifikasyonu için kimyasal ve enzimatik stratejilerin geliştirilmesinde muazzam bir ilerleme kaydedilmiştir. Burada, maleimid-tiyol kimyası kullanan kimyasal bir yöntem ve sortaz A aracılı ligasyona dayanan enzimatik bir yaklaşım kullanarak sitotoksik savaş başlıklarının hedefleme proteinlerine bölgeye özgü dahil edilmesi için ayrıntılı protokolleri sunuyoruz. Örnek hedefleme proteinleri olarak fibroblast büyüme faktörü 2 ve insan immünoglobulin G'nin kristalize edilebilir bölgesini ve model sitotoksik ilaçlar olarak monometil auristatin E ve metotreksatı kullanıyoruz. Açıklanan tüm stratejiler, çeşitli kanserlerin seçici tedavisi için potansiyele sahip, tanımlanmış moleküler mimariye sahip biyolojik olarak aktif sitotoksik konjugatların yüksek verimli bir şekilde üretilmesine izin verir.

Giriş

Onlarca yıllık bilimsel çabalar, kanser gelişimini ve ilerlemesini yöneten moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgimizde muazzam bir ilerlemeye yol açmıştır. Aynı zamanda, ilaçların seçicilik eksikliğinden kaynaklanan olumsuz etkileri, tümörlerin büyük değişkenliği ve uzun süreli tedaviden sonra gelişen ilaç direnci nedeniyle terapötik olanaklar hala büyük ölçüde sınırlıdır. Hedefe yönelik anti-kanser tedavileri, çeşitli tümörlerin tedavisinde yeni ve oldukça umut verici yaklaşımlar olarak son yıllarda dikkat çekmektedir. Hedefe yönelik tedaviler, sitotoksik yükü kanser hücrelerine hassas bir şekilde ileten ve sağlıklı olanları koruyan gelişmiş ilaç dağıtım sistemlerine dayanır. Bunlar esas olarak çeşitli nanopartikülleri, lipozomları ve protein bazlı ilaç taşıyıcılarını içerir.

Kanser hücreleri genellikle yüzeylerinde yüksek seviyelerde spesifik işaretleyici proteinler açığa çıkarır. Antikor ilaç konjugatları (ADC'ler), monoklonal antikorların aşırı özgüllüğünü ve ilaçların yüksek sitotoksik potansiyelini tek bir molekülde birleştiren yeni protein bazlı anti-kanser terapötikleridir. Kanser hücresi yüzeyine bağlandıktan sonra, ADC hücreye girmek için reseptör aracılı endositoz kullanır. Daha sonra, ADC'ler endozomal bölmeler yoluyla lizozomlara taşınır, burada proteazlar ADC'leri bozar ve aktif sitotoksik ilaçları serbest bırakır. Şu anda, ABD'de üçlü negatif meme kanseri, HER2 pozitif meme kanseri, ürotelyal kanser, yaygın büyük B hücreli lenfoma, hematolojik malignite, Hodgkin lenfoma ve akut miyeloid lösemi dahil olmak üzere çeşitli tümörlerin tedavisi için onaylanmış sekiz ADC bulunmaktadır. Çok sayıda ADC de ya geliştirilme aşamasındadır ya da onay beklemektedir1. Dikkate değer bir şekilde, protein mühendisliği yaklaşımları, monoklonal antikorlara protein iskelelerine ve bunların sitotoksik konjugatlarına çeşitli alternatiflerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bunlar arasında farklı antikor fragmanları 2,3, DARPins 4,5, knottinler 6,7, centyrins8, affikorlar 9,10 veya tasarlanmış reseptör ligandları11,12 bulunur.

Başarılı bir protein bazlı sitotoksik konjugat tarafından karşılanması gereken birkaç kritik gereksinim vardır, yani konjugat stabilitesi, olağanüstü özgüllük, konjugatın kansere özgü belirteçlere karşı yüksek afinitesi, konjugatın kanser hücresinin içine hızlı içselleştirilmesi, lizozomlara verimli bir şekilde taşınması ve aktif yükün etkili hücre içi salınımı. Bir diğer önemli özellik, büyük ölçüde yükün hedefleme proteinlerine bağlanması için uygulanan stratejiye bağlı olan eşlenik homojenliktir. Proteinlerin sitotoksik ilaçlarla bölgeye özgü konjugasyonu için, protein yan zincir sistein veya lizin kalıntılarının modifikasyonu, ilacın hedefleme proteinlerine dahil edilen doğal olmayan amino asitlere bağlanması veya hedefleme proteinlerinin enzimatik modifikasyonları (ör., transglutaminaz, glikosiltransferaz, formilglisin üreten enzim, sortaz A ile) gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Çoğu durumda, bölgeye özgü konjugasyon yöntemleri, hedefleme moleküllerinin modifikasyonlarını gerektirir (örneğin, sistein mühendisliği veya kısa peptit etiketlerinin eklenmesi yoluyla), ancak bunun sonucunda homojen bir ilgili konjugatın verimli bir şekilde üretilmesi ile sonuçlanır.

Burada, sitotoksik ilaçlarla hedefleme proteinlerinin yüksek verimli bölgeye özgü konjugasyonu için protokoller sunuyoruz. Örnek proteinler olarak iki farklı molekül kullandık: insan IgG'sinin kristalleşebilir fragmanı (Fc) ve insan fibroblast büyüme faktörü 2'nin (FGF2) tasarlanmış bir varyantı. Fc fragmanı, tipik ADC'lerin ayrılmaz bir parçasını oluşturur, ancak aynı zamanda sitotoksik peptikolar veya antikor fragmanlarının konjugatları gibi diğer konjugat tiplerinde de bulunur. FGF2, FGFR aşırı üreten kanser hücrelerini hedefleyen seçici bir sitotoksik konjuge elde etmek için başarıyla tasarlanmış doğal bir fibroblast büyüme faktörü reseptörü (FGFR) ligandıdır.

Sitotoksik ilaçların bölgeye özgü dahil edilmesine izin veren iki farklı konjugasyon stratejisi sunuyoruz. İlk olarak, Hermanson'un protokolü13'e dayanan maleimid-tiyol kimyası yoluyla Fc fragmanının sistein yan zincirlerine konjugasyon protokolü sağlanmıştır (Şekil 1A,B). Bu protokolde, iki disülfid bağı başlangıçta tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) ile indirgenir ve elde edilen serbest tiyol grupları, maleimid-tiyol kimyası yoluyla monometil auristatin E (MMAE) ile konjugasyona tabi tutulur (Şekil 1B). Sabit ağır zincir alanları 2 ve 3 (CH2 ve CH3) arasındaki etkileşim nedeniyle, ilaca bağlı Fc'nin dimerik yapısı korunur. İkinci olarak, iki farklı ilacın bölgeye özgü bir şekilde FGF2'ye dahil edilmesi için sistein mühendisliği ve sortaz A aracılı ligasyonu birleştiren çift savaş başlığı FGF2 konjugatının üretilmesi için strateji sunulmuştur (Şekil 1A,C). FGF2'nin sistein içermeyen varyantı, tek açıkta kalan sistein kalıntısı ve C-terminal LPETGG kısa peptit etiketi ile ek N-terminal KCKSGG taşır12. Malimid-tiyol reaksiyonu, grubumuz14,15 tarafından tasarlanan KCKSSG bağlayıcı içinde MMAE'nin sisteine konjugasyonuna izin verir. Sortase A'ya bağımlı adım (Chen ve ark.'ya göre)16, metotreksat (MTX) ile bağlı tetraglisin peptit GGGG-MTX'in C-terminal LPETGG dizisine bağlanmasına aracılık eder ve iki tip tek savaş başlığı konjugatı verir (Şekil 1C). Sortase A, LPETGG ve GGGG motifleri arasındaki transpeptidasyon reaksiyonunu katalize eden bir sistein proteazdır. Enzim, proteinin C-terminalinde LPETGG motifine bağlanır, daha sonra treonin ve glisin arasındaki amid bağı, bir enzim-substrat kompleksi oluşturmak üzere hidrolize edilir. Bir sonraki adım, bir birincil amino grubunun donörünün tetraglisin motifi17'nin glisin kalıntısı olduğu tiyoester enzim-substrat bağının aminolizidir. Bu iki yaklaşımın kombinasyonu, sahaya özgü FGF2 çift savaş başlığı konjugatları üretir (Şekil 1C). Prensip olarak, sağlanan konjugasyon protokolleri, seçici sitotoksik konjugatlar oluşturmak için ilgilenilen herhangi bir mühendislik hedefleme proteinine başarılı bir şekilde uygulanabilir. Ayrıca, bu yaklaşımın çok yönlülüğü, onu diğer birçok protein-protein ve protein-peptit ligasyonu amacının yanı sıra lipitlerin, polimerlerin, nükleik asitlerin ve floroforların mevcut sülfhidril grubuna sahip proteinlere bağlanması için uygun hale getirir (veya doğal disülfür bağlarının indirgenmesiyle üretilir) ve/veya eklenen küçük peptit etiketi ile.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Fc alanının MMAE ile konjugasyonu

NOT: Bölgeye özgü konjugasyonlardan önce anahtar reaktifleri hazırlayın: yüksek saflıkta ilgilenilen protein (bu durumda Fc fragmanı ve mühendislik FGF2 varyantı, başlangıç noktası olarak 1-5 mg rekombinant protein, Sokolowska-Wedzina18'e göre hazırlanmış), maleimidokaproil-Val-Cit-p-aminobenzil alkol (PABC)-monometil auristatin E (MMAE) (DIKKAT, yüksek sitotoksik ajan, dikkatli kullanın), Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) ve sortase A 16. Tetraglisin peptidine (GGGG-MTX) bağlı metotreksat (dikkat, MTX oldukça sitotoksik bir ajandır, dikkatli kullanın) Fmoc stratejisi19'daki katı faz peptit sentezi (SPPS) yöntemine göre katı destek fazında sentezlenebilir veya ticari kaynaklardan elde edilebilir.

  1. Fc fragmanı içindeki disülfid bağlarını azaltmak için (Şekil 1), PBS'de (100 mM NaCl, 18 mM NaH2PO4, 33 mM Na2HPO4 pH 7.4) Fc proteini (39 μM) üzerine on kat molar fazla TCEP ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. TCEP stok çözeltisinin pH'ı 0.1 M NaOH ila 6.0 ile ayarlanmalıdır, pH değişimlerinden kaynaklanan protein çökelmesini önlemek için.
  2. İnkübasyondan sonra, protein çökeltilerini gidermek için 0.2 μm filtre kullanarak indirgenmiş proteini süzün.
  3. Yeni reaksiyon tüpüne, protein -SH grupları üzerine ilk dört kat molar fazla MMAE ekleyin ( MMAE'yi N, N-dimetilasetamid (DMAc) içinde çözün, 40 mM stok çözeltisi hazırlayın). Daha sonra, Fc proteininin hacmine göre çift hacimde PBS tamponu ekleyin. Sonunda, adım 1.2'den azaltılmış Fc parçası ekleyin.
    NOT: Bu adımda, reaktiflerin eklenme sırası önemlidir.
  4. Konjugasyon reaksiyonunu gece boyunca 15 °C'de hafif bir dönüşle gerçekleştirin. Bu hafif koşullar protein denatürasyonunu önler.
  5. Potansiyel çökeltileri gidermek için 0,2 μm filtre kullanarak çözeltiyi eşlenik ile filtreleyin.
  6. Reaksiyonun verimliliğini analiz etmek için SDS-PAGE'i gerçekleştirin. % 10 ayırma jeli, 10 – 250 kDa protein markörü kullanın ve 35 ila 50 kDa arasındaki bantları analiz edin (Şekil 2).
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve reaksiyon karışımı kısa süreli depolama için 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir. Bununla birlikte, donma ve çözülme, ek çökelmeye neden olabilir ve eşlenik saflaştırma verimlerini azaltabilir.
  7. Reaksiyon karışımını protein A-konjuge boncuklar içeren bir kolona yükleyin ve fazla MMAE'yi 300 mM NaCl, 18 mM NaH2PO4, 33 mM, Na2HPO4,% 0.1 Tween 20, 2 mM EDTA pH 7.4 içeren Yıkama tamponu 1 ile yıkayın. Daha sonra sütunu 650 mM NaCl, 18 mM NaH2PO4, 33 mM Na2HPO4, pH 7.4 ile Yıkama Tamponu 2 kullanarak yıkayın.
    NOT: Konjugatın Fc bölgesinin boncuklar üzerindeki protein A ile seçici etkileşimi sayesinde, konjugat kolon üzerinde yakalanırken, reaksiyona girmemiş MMAE yıkanır. Bu adım, oldukça saf eşlenik elde etmek için gereklidir.
  8. 1 M Tris pH 9.0 (1 mL protein ila 200 μL 1 M Tris pH 9.0) içeren 0.1 M sodyum sitrat pH 3.5 ila 1.5 mL tüpler ile kolondan Fc-MMAE konjugatını çıkarın.
  9. Sephadex G-25 reçineli bir kolon kullanarak Fc-MMAE'yi PBS pH 7.4'e tuzdan arındırın. Bu adım, konjugatın denatürasyonunu önler ve konjugatın in vitro ve in vivo testlerde kullanılmasına izin verir.
    NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
  10. Son Fc-MMAE konjugatını analiz etmek için SDS-PAGE (%10) gerçekleştirin. % 10 ayırma jeli, 10 – 250 kDa protein markörü kullanın ve 35 ila 50 kDa arasındaki bantları analiz edin (Şekil 2).

2. Tasarlanmış FGF2'nin konjugasyonu

  1. GGGG-MTX'in sortase A aracılı ligasyon yoluyla tasarlanmış FGF2'nin C-terminali LPETGG dizisine konjugasyonu
    1. N-terminal KCKSGG ve C-terminal LPETGG dizisi (bu adımda konjugasyon için kullanılır) içeren saflaştırılmış mühendislik FGF2'yi sortase A Reaksiyon Tamponuna (25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM CaCl2) G-25 reçineli bir kolon kullanarak. Protein konsantrasyonunu sortase A Reaksiyon Tamponu ile 1 μM'ye ayarlayın.
    2. DMAc içinde çözünmüş GGGG-MTX peptidini doğrudan protein çözeltisine 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
    3. 0.1 μM'lik bir nihai konsantrasyona sortase A ekleyin ve hafif rotasyonla 15 ° C'de 12 saat inkübe edin. Adım 2.1.1-2.1.3'te kullanılacak reaktiflerin konsantrasyonları, büyük ölçüde elde edilecek eşlenik verimi ve hedefleme proteininin biyokimyasal özellikleri (protein saflaştırma etkinliği, çözünürlüğü ve stabilitesi) ile belirlenir. Etkili sortase A reaksiyonu için, LPETGG içeren hedef proteinden on ila yüz kat daha düşük sortaz A konsantrasyonu ve LPETGG etiketli proteinden 100 kat daha yüksek GGGG-MTX konsantrasyonu olan bir başlangıç noktası kullanın.
    4. Reaksiyon karışımını bir Heparin Sefaroz sütununa yükleyin.
    5. Reaksiyona girmemiş molekülleri 25 mM HEPES pH 7.4 ile yıkayın.
    6. Reaksiyonun ürününü (FGF2. MTX) 25 mM HEPES pH 7.4 ile 2 M NaCl ile.
      NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
    7. SDS-PAGE kullanarak konjugasyonun verimliliğini analiz edin. % 15 ayırma jeli, 10 – 250 kDa protein markörü kullanın ve 15 ila 25 kDa arasındaki bantları analiz edin (Şekil 3).
  2. MMAE'nin, maleimid-tiyol reaksiyonu yoluyla tasarlanmış FGF2'nin N-terminal KCKSGG dizisine konjugasyonu
    1. Sephadex G-25 reçineli bir kolon kullanılarak Reaksiyon Tamponuna (25 mM HEPES pH 7.0, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM metiyonin, 0.1 mM EDTA) N-terminal KCKSGG ve C-terminal LPETGG dizisi içeren FGF2'nin tuzdan arındırılması. Reaksiyon Tamponu ile protein konsantrasyonunu 25 μM'ye ayarlayın.
    2. 40 mM stok çözeltisi hazırlamak için MMAE'yi DMAc içinde çözün.
    3. Yeni reaksiyon tüpüne, protein -SH grupları üzerinde MMAE'nin ilk dört kat molar fazlalığını ekleyin. Ardından, FGF2 proteininin hacmine göre çift hacimde PBS tamponu ekleyin. Sonunda FGF2 proteini ekleyin.
      NOT: Bu adımda reaktiflerin eklenme sırası önemlidir.
    4. Reaksiyonu 1 saat boyunca 20 ° C'de hafif bir dönüşle gerçekleştirin.
    5. Reaksiyon karışımını bir Karboksimetil (CM)-Sefaroz kolonuna yükleyin ve konjuge olmayan sitotoksik ajanın fazlalığını 25 mM HEPES pH 7.4 ile yıkayın. Bu hafif koşullar protein denatürasyonunu önler.
    6. MMAE'yi elute edin. FGF2 25 mM HEPES pH 7.4 ile kolondan eşlenik 0.5 M NaCl ile.
      NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
    7. SDS-PAGE kullanarak konjugasyonun verimliliğini analiz edin. % 15 ayırma jeli, 10 – 250 kDa protein markörü kullanın ve 15 ila 25 kDa arasındaki bantları analiz edin (Şekil 3).
  3. Malimid-tiyol kimyası ve sortaz A-aracılı ligasyon kombinasyonu kullanılarak enginnered FGF2'nin çift savaş başlığı konjugatının hazırlanması
    NOT: Tasarlanmış FGF2'nin çift savaş başlığı eşleniklerinin üretilmesi için 2.1 ve 2.2 adımları birleştirilmiştir. İlk MMAE. FGF2 konjugatı, maleimid-tiyol kimyası (adım 2.2) yoluyla üretilir ve sortase A ile GGGG-MTX'in MMAE'nin C terminali LPETGG etiketine bağlanması için kullanılır. FGF2 (adım 2.1). Ayrıca, ters prosedür de mümkündür (önce sortase A aracılı konjugasyon, daha sonra maleimid-tiyol reaksiyonu).
    1. Mono ikameli MMAE'nin hazırlanması için 2.2.1-2.2.7 adımlarını kullanın. FGF2 eşleniği.
    2. Sephadex G-25 reçineli bir kolon kullanarak tamponu sortase A Reaksiyon Tamponu (25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM CaCl2) ile değiştirin.
    3. 2.1.2-2.1.7'de açıklandığı gibi devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sunulan protokoller, farklı sitotoksik ilaçların ilgilenilen proteinlere konjugasyonu için iki farklı stratejiyi tanımlamaktadır. Ayrıca, bölgeye özgü bir şekilde çift savaş başlığı sitotoksik konjugatlarının üretilmesine izin veren bireysel stratejilerin bir kombinasyonu gösterilmiştir.

Şekil 2'deki SDS-PAGE jellerinde gösterildiği gibi (şerit 2'ye karşı 3), maleimid-tiyol reaksiyonu, Fc fragmanına MMAE konjugasyonu için neredeyse% 100 verimliliğe ulaşmaya izin v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Çeşitli kanser türlerine karşı seçici terapötiklerin tasarımına olan yüksek ilgi nedeniyle, farklı yüklerin hedefleme proteinlerine bölgeye özgü bağlanmasına izin veren stratejilere acil bir ihtiyaç vardır. Hedefleme proteinlerinin bölgeye özgü modifikasyonu, modern terapötikler için bir ön koşul olan gelişmiş biyoaktif konjugatların homojenliğini sağladığı için kritik öneme sahiptir. Hem kimyasal hem de enzimatik, kargonun tercih edilen proteine bölgeye özgü bağlanmasına izin veren çeşi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Birinci EKİP ve Polonya Bilim Vakfı'nın Yeniden Entegrasyon programları tarafından desteklenmiştir (POIR.04.04.00-00-43B2/17-00; POIR.04.04.00-00-5E53/18-00) Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu kapsamında ortaklaşa finanse edilen, L.O ve A.S.'ye verilen M.Z çalışması, Ulusal Bilim Merkezi'nden OPUS (2018/31/B/NZ3/01656) ve Sonata Bis (2015/18/E/NZ3/00501) tarafından desteklenmiştir. ASW çalışması, Ulusal Bilim Merkezi'nden Miniatura hibesi ile desteklenmiştir (2019/03/X/NZ1/01439).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CM-Sepharose sütunuSigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ABDCCF100
Heparin Sefaroz sütunuGE Healthcare, Chicago, IL, ABDGE17-0407-01
HiTrap Tuz Giderme sütunuGE Healthcare, Chicago, IL, ABDGE17-1408-01
HiTrap MabSelect SuRe sütunuGE Healthcare, Chicago, IL, ABDGE11-0034-93
maleimidokaproil-Val-Cit-PABC-monometil auristatin E (MMAE)MedChemExpress, Monmouth Kavşağı, NJ, ABDHY-100374Toksik
N, N< / em>-Dimetilasetamid (DMAc)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ABD185884
Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ABD646547

Kaynaklar

  1. Bethany, H. A new generation of antibody-drug conjugates for cancer patients. Chemical & Engineering News. 98 (14), (2020).
  2. Tu, C., et al. A Combination of structural and empirical analyses delineates the key contacts mediating stability and affinity increases in an optimized biotherapeutic single-chain Fv (scFv). Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1267-1276 (2016).
  3. Sokolowska-Wedzina, A., et al. High-affinity internalizing human scFv-Fc antibody for targeting FGFR1-overexpressing lung cancer. Molecular Cancer Research. 15 (8), 1040-1050 (2017).
  4. Seeger, M. A., et al. construction, and characterization of a second-generation DARPin library with reduced hydrophobicity. Protein Science. 22 (9), 1239-1257 (2013).
  5. Deyev, S., et al. Synthesis, characterization, and selective delivery of DARPin-gold nanoparticle conjugates to cancer cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (10), 2569-2574 (2017).
  6. Currier, N. V., et al. Targeted drug delivery with an integrin-binding Knottin-Fc-MMAF conjugate produced by cell-free protein synthesis. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (6), 1291-1300 (2016).
  7. Cox, N., Kintzing, J. R., Smith, M., Grant, G. A., Cochran, J. R. Integrin-targeting knottin peptide-drug conjugates are potent inhibitors of tumor cell proliferation. Angewandte Chemie International Edition. 55 (34), 9894-9897 (2016).
  8. Goldberg, S. D., et al. Engineering a targeted delivery platform using Centyrins. Protein Engineering Design and Selection. 29 (12), 563-572 (2016).
  9. Altai, M., et al. Affibody-derived drug conjugates: Potent cytotoxic molecules for treatment of HER2 over-expressing tumors. Journal of Controlled Release. 288, 84-95 (2018).
  10. Sochaj-Gregorczyk, A. M., Serwotka-Suszczak, A. M., Otlewski, J. A Novel affibody-Auristatin E conjugate with a potent and selective activity against HER2+ cell lines. Journal of Immunotherapy. 39 (6), 223-232 (2016).
  11. Szlachcic, A., Zakrzewska, M., Lobocki, M., Jakimowicz, P., Otlewski, J. Design and characteristics of cytotoxic fibroblast growth factor 1 conjugate for fibroblast growth factor receptor-targeted cancer therapy. Drug Design, Development and Therapy. 10, 2547-2560 (2016).
  12. Krzyscik, M. A., Opaliński, Ł, Otlewski, J. Novel method for preparation of site-specific, stoichiometric-controlled dual warhead conjugate of FGF2 via dimerization employing sortase A-mediated ligation. Molecular Pharmaceutics. 16 (8), 3588-3599 (2019).
  13. Hermanson, G. T. The Reactions of bioconjugation. Bioconjugate Techniques. , 229-258 (2013).
  14. Lobocki, M., et al. High-yield site-specific conjugation of fibroblast growth factor 1 with monomethylauristatin e via cysteine flanked by basic residues. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 1850-1858 (2017).
  15. Krzyscik, M. A., et al. Cytotoxic conjugates of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with monomethyl auristatin e for effective killing of cells expressing FGF receptors. ACS Omega. 2 (7), 3792-3805 (2017).
  16. Chen, I., Dorr, B. M., Liu, D. R. A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11399-11404 (2011).
  17. Weiner, E. M., Robson, S., Marohn, M., Clubb, R. T. The sortase A enzyme that attaches proteins to the cell wall of Bacillus anthracis contains an unusual active site architecture. Journal of Biological Chemistry. 285 (30), 23433-23443 (2010).
  18. Sokolowska-Wedzina, A., et al. Efficient production and purification of extracellular domain of human FGFR-Fc fusion proteins from Chinese hamster ovary cells. Protein Expression and Purification. 99, 50-57 (2014).
  19. Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society. 85 (14), 2149-2154 (1963).
  20. Chen, Y. Drug-to-antibody ratio (DAR) by UV/Vis spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1045, 267-273 (2013).
  21. Falck, G., Müller, K. M. Enzyme-based labeling strategies for antibody-drug conjugates and antibody mimetics. Antibodies. 7 (1), Basel, Switzerland. 4(2018).
  22. Shental-Bechor, D., Arviv, O., Hagai, T., Levy, Y. Folding of conjugated proteins. Annual Reports in Computational Chemistry. , Elseiver. 263-277 (2010).
  23. Bigman, L. S., Levy, Y. Entropy-enthalpy compensation in conjugated proteins. Chemical Physics. 514, 95-105 (2018).
  24. Danielsson, J., et al. Thermodynamics of protein destabilization in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (40), 12402-12407 (2015).
  25. Świderska, K. W., Szlachcic, A., Czyrek, A., Zakrzewska, M., Otlewski, J. Site-specific conjugation of fibroblast growth factor 2 (FGF2) based on incorporation of alkyne-reactive unnatural amino acid. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 25 (14), 3685-3693 (2017).
  26. Krzyscik, M. A., Zakrzewska, M., Otlewski, J. Site-specific, stoichiometric-controlled, PEGylated conjugates of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with hydrophilic auristatin Y for highly selective killing of cancer cells overproducing fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1). Molecular Pharmaceutics. 17 (7), 2734-2748 (2020).
  27. Borek, A., Sokolowska-Wedzina, A., Chodaczek, G., Otlewski, J. Generation of high-affinity, internalizing anti-FGFR2 single-chain variable antibody fragment fused with Fc for targeting gastrointestinal cancers. PLOS ONE. 13 (2), 0192194(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Protein Biyo-konjugatlarBölgeye Özgü KonjugasyonSitotoksik Savaş BaşlıklarıFibroblast Büyüme Faktörü 2İmmünoglobulin G FcMonometil Auristatin EMetotreksatReseptör Aracılı Endositoz

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.