Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Metastaz Oranını Kontrol Etmek için Amputasyonlu Syngeneic Ortotopik Osteosarkom Sprague Dawley Sıçan Modeli

3.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62139

⸱

3 Mayıs 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Comparative Pathobiology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University, 3Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 5Program for Comparative Medicine, Gene Therapy Program, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 6Tuskegee College of Veterinary Medicine, 7Department of Human Pathology, Juntendo University Faculty of Medicine, 8Department of Surgery, Juntendo University Shizuoka Hospital, Juntendo University School of Medicine, 9Department of Urology, The Johns Hopkins School of Medicine, 10Department of Gastroenterology and Minimally Invasive Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine

Bu makalede

Özet

Burada, metastaz biyolojisinin preklinik araştırılması ve yeni terapötiklerin gelişimi için kullanılabilecek spontan pulmoner metastaz ile osteosarkomun amputasyon prosedürünün ardından singeneik ortotopik implantasyon tanımlanmıştır.

Özet

Osteosarkom (OS) tedavisinde en son ilerleme, 1980'lerde multi-ajan kemoterapinin sadece cerrahiye kıyasla genel sağkalımını iyileştirdiği gösterildiğinde gerçekleşti. Bu sorunu gidermek için çalışmanın amacı, sıçanlarda daha az bilinen bir işletim sistemi modelini, sağkalım süresini uzatan kapsamlı bir histolojik, görüntüleme, biyolojik, implantasyon ve amputasyon cerrahi yaklaşımı ile iyileştirmektir. Pediatrik işletim sistemini modellemek için 3 haftalık erkek ve dişi sıçanlara ortotopik tibial tümör implantları ile implante UMR106 OS hücre hattı (SD sıçanından kaynaklanan) ile singeneik bir sıçan modeli olan immün yetmetik, dışlanmış bir Sprague-Dawley (SD) kullandık. Sıçanlarda tekrarlanabilir primer ve metastatik pulmoner tümörler geliştiğini ve implantasyon sonrası 3 haftalık uzuv amputasyonlarının pulmoner metastaz insidansını önemli ölçüde azalttığını ve beklenmedik ölümleri önlüyor olduğunu gördük. Histolojik olarak, sıçanlardaki birincil ve metastatik işletim sistemi insan işletim sistemine çok benziyordu. OS hücrelerinin protein ekspresyon araştırması, bu tümörlerin ErbB ailesi kinazlarını ifade ettiğini ortaya koymaktadır. Bu kinazlar çoğu insan işletim sisteminde de yüksek oranda ifade edildiğinden, bu sıçan modeli tedavi için ErbB yol inhibitörlerini test etmek için kullanılabilir.

Giriş

Osteosarkom (OS) çocuklarda, ergenlerde ve genç erişkinlerde en sık görülen primer kemik tümörüdür. OS tedavisindeki en son ilerleme, 1980'lerde çok ajanlı kemoterapinin sadece cerrahiye kıyasla genel sağkalımını iyileştirdiği gösterildiğinde meydana geldi1. İşletim sistemi hızlı kemik büyümesi sırasında gelişir, tipik olarak femur, kaval kemiği ve humerus gibi uzun tübüler kemiklerde meydana gelir. Osteolitik, osteoblastik veya belirgin periosteal reaksiyonlu karışık görünüm ile karakterizeedilirler 2. Kemoterapi ve cerrahi rezeksiyon, hastaların % 65'i için 5 yıllık sağkalımlı hastalar için sonucu iyileştirebilir2,3. Ne yazık ki, metastatik hastalığı olan yüksek dereceli işletim sistemi hastaları% 20 sağkalıma sahiptir. İşletim sistemi bölgesel olarak istila eder ve öncelikle akciğerlere veya diğer kemiklere metastaz eder ve erkeklerde daha yaygındır. Bu genç hastalar için en zorlayıcı ihtiyaç, uzak metastazların canlılığını önleyen ve ortadan kaldıran yeni bir tedavidir.

OS klinik öncesi modeller gözden geçirilmiştir4,5,6,7 ve ortotopik işletim sisteminin amputasyonu kullanılarak mevcut birkaç immün yetmetik model geliştirilmiştir. 2000 yılında, ortotopik singeneik işletim sistemi ve amputasyon8ile BALB / c fareler kullanılarak önemli bir model geliştirilmiştir. Bu fare modeline kıyasla, sıçan modeli genetik olarak yetiştirilmiş ve bazı avantajlara yol açan 10 kat daha büyük hayvanlara dayanmaktadır. Sıçan UMR106 modeli, bir hücre hattı9'atüretilen bir Sprague Dawley (SD) sıçanında 32P kaynaklı bir işletim sistemi tarafından geliştirilmiştir. 2001 yılında UMR106-01 ortotopik implantasyonu ilk olarak athimik farelerin implante tibialarında hızlı, tutarlı primer tümör gelişimi ve insanlarda işletim sistemi ile ortak radyolojik, histolojik özelliklerle tanımlanmıştır. Pulmoner metastazlar gelişti ve UMR106'nın kemik mikroçevresine ortotopik yerleşimine bağlıydı10. 2009 yılında Yu ve arkadaşları11, daha büyük erkek SD sıçanlarda UMR106 hücrelerini kullanarak tekrarlanabilir bir ortotopik femur OS sıçan modeli kurdu. Amputasyon yapılmamış sıçanlarda başarılı tümör implantasyonları ve akciğer metastaz oranı burada sunulan verilere benzerdi. Bu çalışmada, özellikle metastatik ilerleme ile ilgili olarak, primer tümör çıkarma zamanlamasının modelleme işletim sisteminde çok önemli olduğunu öne süren genç sıçanlar kullanılarak modele ek bir amputasyon yapıldı. Bu arıtma ile amputasyon ve in vivo görüntüleme, işletim sistemi için yeni ilaç değerlendirmesi için klinik öncesi çalışmalar için bu modeli geliştirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Sıçanları içeren tüm prosedürler ve deneyler Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirildi.

1. SD rat OS hücre hattı UMR-106 hücre kültürü protokolü

  1. DMEM'de% 10 (v/ v) FBS, penisilin (10 U / mL)- streptomisinin (10 U / mL) nemli% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de ( 10 U / mL) ile desteklenmiş hücreleri büyütün. 2-812pasajlı hücreleri kullanarak deneyler gerçekleştirin.

2. İşletim sistemi hücreleri protokolünün intratibiyal enjeksiyonu

NOT: Zaman çiftleşmiş hamile SD sıçanları hayvan tesisinde doğum yapmakta ve 3 haftalıkken çöpler kullanılmaktadır (UMR 106 hücre hattı SD sıçanlar için singeneik olduğundan, ışınlama gerekmez).

  1. Indüksiyon
    1. Sıçanı orta büyüklükte bir indüksiyon odasına yerleştirin ve% 2-3 izofluran ile anesteziye neden edin. Parmağı kıstırmak için refleks, solunum hızı ve karakter ile anestezi derinliği için hayvanı sürekli izleyin.
    2. Burnu burun kemiğine sokun. Gerekirse bantla sabitleyin.
    3. Sağ bacakta bulunan saçları ventral ve sırt alt karın bölgesine kadar makasla çıkarın veya tüy döken madde kullanın. Sıçanı bir supine pozisyonuna getirin.
    4. Cerrahi bölgeyi %70 etanol kullanarak aseptik olarak ovalayın ve klorheksidin asetat veya seyreltilmiş betadin seyreltin. Diz bölgesinin etrafından başlayın ve hem proksimal hem de distal olarak dairesel bir hareketle ovalayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın. Tümör implantasyonunda perde kullanılmaz.
    5. Anestezinin neden olduğu kornea tahliyesini önlemek için sıçanın her iki gözüne de göz yağı uygulayın. Sıçanı düşük ısı ayarlı bir ısıtma yastığına yerleştirin. Sıçanın normal vücut sıcaklığına (37 °C) ve normal solunum hızına sahip olduğundan emin olun.
  2. Ameliyat
    1. isoflurane'yi ~%1,5-%2 oranında açın (bakım için). Hayvanın bir parmak sıkışma refleksi eksikliği ile yeterli bir anestezi düzlemsinde olduğundan emin olun. Değilse, izofluran yüzdesini% 2,5'e çıkarın.
    2. Derinliğe yerleştirmek için uçtan 10 mm'de steril bir iğneyi (yaklaşık 22 G) işaretleyin.
    3. Tibial platonun ortasında bükülmüş dizine girerek, bir açıklık yapmak için hafif matkap benzeri bir hareket kullanarak iğneyi metafizden diafiz içine uzatarak iğneyi kaval kemiğinin diyafizine 10 mm aşağı yerleştirin. İğneyi çıkar.
    4. Kaval kemiğine enjeksiyondan önce hücre süspansiyonu doğrudan Hamilton şırındıcına yükleyin. Bunu yapmak için, yerçekimi hücrelerin tüpün dibine yerleşmesini sağlarken şırınd içine çekmeden önce hücreleri hafifçe karıştırın.
      NOT: Hücreler, dikkatli bir karıştırmadan sonra Hamilton şırıncısına (100 μL) çekmeden önce 1,5 ila 2 mL'lik bir tüpte (oda sıcaklığında) saklanabilir. Hücreler implantasyon işlemi sırasında oda sıcaklığında 2-3 saat bekletilebilir. İmplantasyon seansından önce ve sonra tüpteki hücrelerin hücre canlılığını her zaman kontrol edin. Trypan mavi dışlama hücre canlılığı değerlendirmesi için en kolay yöntemdir.
    5. Kemik ilk iğne ile geçirildikten sonra, hücrelerle dolu 100 μL Hamilton şırıngasına bağlı ikinci bir (10 mm'de işaretlenmiş daha küçük çaplı iğne) iğne yerleştirin. İğneyi 10 mm'lik işarete kadar diyafiz içine uzanan aynı deliğe soktuğundan emin olun.
    6. PBS'deki 75.000 işletim sistemi hücresi süspansiyonunun 20 μL'lik kısmını diafiz ve ilik boşluğuna hafifçe boşaltın.
      NOT: İğne kemikte sallanmamalı ve kendini güvende hissetmelidir. İğne kolayca hareket ederse, korteks diyofizden geçilmiş olabilir. Hücrelerin enjeksiyonundan önce daha sıkı bir yerleşim elde etmek için ekleme işlemini tekrarlayın.
    7. Hamilton iğnesini kemikten çıkar.
      NOT: Küçük bir kan damlası oluşursa, hafif basınç uygulayın. Delinme bölgesinde berrak sıvı damlası oluşursa, iğne kemikte yeterince uzatılmamış olabilir ve tümör hücresi süspansiyonu delikten geri sızmış olabilir. Bunu notlara kaydedin, ancak genellikle tümör implantasyonu başarılı olacaktır. Deneyimle, tümör implantasyon prosedürü sıçan başına 5 dakika sürmelidir. Deneyimle, kemikteki hücrelerin tümör implantasyonu kolaylaşacaktır. Kemiğin etrafındaki kastaki hücrelerin yanlışlıkla enjekte edilmesi, pulmoner metastaz için gerekli tümör mikroçevresine yol açmayabilir.
  3. Kurtarma
    1. Sıçanın normotermik olduğundan emin olun. Sıçanı iyileşme için kafesin altına yerleştirilmiş bir ısıtma yastığı ile bir kafese yerleştirin.
    2. Tamamen uyanık, hareketli ve iyi nefes aldıktan sonra, sıçanlara Buprenorfin (1.0-1.2 mg / kg SC) enjekte edin.
      NOT: Buprenorfin'e erişmek için, siparişi vermek için veteriner personeli aracılığıyla onay seçeneklerini görmek için kuruma danışın.
    3. Fareleri temiz kafeslere geri taşıyın ve her hafta günde bir kez izleyin.

3. Ölçüm ve izleme

  1. Büyüme hızını belirlemek için implantasyon sonrası 9-10 gün ve implantasyon sonrası 3 haftaya kadar her 2 günde bir tümör boyutunu ölçün. Elektronik veya manuel kaliper kullanarak kaval kemiğinin maksimum çapını ölçün. Tümör hacmini hesaplamak için verileri bir formülle elektronik tabloda depolayın. Kontralateral (implante tibia değil) taban çizgisi olarak ölçün.
    NOT: İmplant edilen hindlimb çapları tümör büyüklüğü için taşıyıcı olarak kullanılır. Arka uzuvlar, uzuv üzerinde ventral/dorsal ve media/lateral olmak üzere iki ölçüm için en büyük çapta kaval kemiği uzun eksenine dik olarak ölçülür. Tahmini tümör hacmi11: Tümör hacmi (mm3)= en büyük çap (mm) x en küçük çap (mm)2 /2formülü ile hesaplanır.
  2. Tümörler en büyük boyutta 15 mm'ye yaklaştığında veya tümör implantasyonundan 3 hafta sonra sağkalım amputasyonu veya kemoterapi tedavisi için sıçanları düşünün. Kontrallateral uzuv, bu yaşta çoğu sıçanda yaklaşık 7-9 mm'dir.

4. Doxorubicin intravenöz uygulama

  1. Sıçanları% 2 izofluran ile uyuşturun. Açıklanan gibi betadin ve alkol kullanarak üç cerrahi yıkama ile cildi şahdamarı üzerinde hazırlayın13.
  2. Dikkatli diseksiyon altında, sağ veya sol şahdamarını görselleştirin. İğneyi aşırı kas içine yerleştirin ve daha sonra pektoralis kasına şahdamar ön kısmında görselleştirildiği için sıçanın kafasına doğru şahdamarına doğru yönlendirin.
    1. İğne şahdamarına yerleştirildiğinde, uygun yerleştirmeyi sağlamak için şırıngaya hafifçe kan çekin. İğnenin damardan geçtiğine inanmak mümkündür, ancak iğne damarın altındadır ve lümende değildir. Şahdamarını ortaya çıkarmak için künt diseksiyon yaparken şahdamarı enjeksiyonlar için çok küçük hale gelirse, enjeksiyon için diğer şahdamarını kullanın.
  3. Doksrubicin (2 mg/ kg) 100-150 μL hacimde 1 dakika boyunca yavaşça enjekte edin. Çözelti doğum sırasında şahdamarında intravenöz olarak görselleştirilebilir.
  4. Kontrol sıçanlarına benzer miktarlarda normal salin enjekte edin.
  5. İğneyi çıkarın ve steril bir gazlı bezle damara hafif bir basınç uygulayın.
  6. 3-4 yara klipsi kullanarak cilt kesisini kapatın. Enjeksiyondan 7-10 gün sonra klipsleri çıkarın.
    NOT: Sıçanlar genellikle metal klipsleri çıkarmaya çalışmazlar, ancak dikişleri ısırır ve çıkarırlar. Damar dışına sızan herhangi bir ilaç kuyruk amputasyon gerektirebilecek kuyruk nekrozuna neden olduğundan, doksofobisin için kuyruk damarı enjeksiyonlarına şah damarı enjeksiyonları tercih edilir.

5. Hind uzuv amputasyon protokolü

  1. Indüksiyon
    1. Sıçanı orta büyüklükte bir indüksiyon odasına yerleştirin ve% 2-4 izofluran ile anesteziye neden edin. Anestezinin derinliği için sıçanı sürekli izleyin.
      NOT: İndüksiyon odası kömür kutusuna atlanır ve diğer gazlar ameliyat için kullanılan aşağı taslak bir masa ile çıkarılır.
    2. Burnu burun askumu içine sokun. Gerekirse bantla sabitleyin.
      NOT: Bu prosedür, fazla uçucu gazları (yani izoflurane) çöpe atmak için aşağı taslak bir masada yapılır.
    3. Sağ bacakta bulunan saçları ventral ve sırt alt karın bölgesine kadar makasla çıkarın veya tüy döken madde kullanın. Sıçanı bir supine pozisyonuna getirin.
    4. Cerrahi bölgeyi %70 etanol kullanarak aseptik olarak ovalayın ve klorheksidin asetat veya seyreltilmiş betadin seyreltin. Cildi baldırın ortasından sağ alt karın kalça ekleminin hemen üstündeki cilt bölgesine kadar ameliyata hazırlayın. Bacak proksimalini ve distal bölgeyi çevresel olarak ovalayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
    5. Göz yağlayıcıyı sıçanın her iki gözüne de uygulayın. Sıçanın normal vücut sıcaklığına (37 °C) ve normal yaşamsal işaretlere sahip olduğundan emin olun. Rektal sıcaklık probu monitörüne bağlı bir ısıtma yastığı kullanarak vücut sıcaklığını izleyin ve düzenleyin.
  2. Ameliyat
    1. Izoflurane'yi %1,5-%3 oranında açın (bakım). Parmak sıkışmasına, solunum hızına ve karaktere reaksiyon da dahil olmak üzere anestezik derinliği izleyin. Uygun bir anestezi düzlemini korumak için izoofluran oranını gerektiği gibi ayarlayın.
      NOT: Anestezi altındayken solunum hızı dakikada 50-100 nefes arasında olmalıdır. Derin, seyrek nefesler sıçanın çok derin uyuşturuldığının bir göstergesidir.
    2. Steril alet paketlerini ve perdeleri açın ve steril eldivenler takın. İşlem süresince steriliteyi korumaya özenin. Gerekli temel steril cerrahi aletler arasında neşter bıçağı tutucu, forseps, hemostatlar, iğne tutucu, makas ve yara klipsi uygulanıcı bulunur.
    3. Sıçanın bacağını steril cerrahi örtünün havalandırmasına çekin. Hayvanın parmak sıkışma refleksi ile yeterli bir anestezi düzlemsinde olduğundan emin olun.
    4. Neşter bıçağı veya cerrahi makas kullanarak, boğmacaya (diz eklemi) sadece proksimal olan çevresel, kütenöz bir kesi yapın.
    5. Arka uzvun ventral-medial yüzeyindeki femoral arteri ve damarı açığa çıkarmak için gazlı bez veya künt diseksiyon kullanarak arka uzvu deglove edin.
    6. Damarları orta uyluk kemiği seviyesinde 4-0 emilebilir dikiş kullanarak lige edin ve distal olarak transect.
    7. Kas diseksiyonu sırasında sızıntıyı azaltmak için damarı distal olarak kenetleyin.
      NOT: Çevresel kas yapısı femoral arter damarı ligasyonu seviyesine ve uyluk kemiğinden coxofemoral eklem seviyesine yükselen kaslara kadar distal olarak transekte edilecektir.
    8. Künt diseksiyon kullanarak kalça eklemini yanal dışa doğru dönme ile kaçırın.
    9. Uyluk kemiğinin başını bulun ve asetatülden sökün. Bacağı vücuda bağlı tutarak kalan tüm dokuları kesin.
    10. Yaklaşık 6 mg/kg Ropivacaine ile asetabulum ve siyatik sinire sıçrama bloğu verin.
    11. Basit bir kesintiye uğramış dikiş (4-0, emilebilir dikiş) kullanarak asetatülün üzerindeki kasları kapatın.
      NOT: Kapalı kas tabakası (lokal infiltrasyon/sıçrama bloğu) boyunca çeşitli bölgelere ek %0,5 bupivakain veya lidolin (toplam 0,15-0,2 mg) enjekte edilebilir.
    12. Her 5-10 mm'de bir ayrı yerleştirilmiş yara klipslerini kullanarak cildin kenarlarına karşı çıkın ve kapatın.
  3. Kurtarma
    1. Sıçanı, kafesin altına yerleştirilen bir ısıtma yastığı kullanarak ısı desteği ile temiz bir geri kazanım kafesine yerleştirin.
      NOT: Hipertermiyi önlemek için, ısıtma yastığı hayvanla doğrudan temas etmemelidir ve 40 ° C'yi geçmemelidir.
    2. Hayvanı tamamen iyileşene ve normotermik (37,5-39 °C) olana kadar izleyin.
      NOT: Hayvan, tamamen bilinçli ve sert bir şekilde recumbent ve kafes etrafında kolayca hareket edene kadar başıboş bırakılmamalıdır.
    3. Tamamen uyanık, hareketli ve iyi nefes aldıktan sonra, sıçanlara Buprenorfin (1.0-1.2 mg / kg SC) enjekte edin.
      NOT: Anesteziye uğramış bir sıçanda Buprenorfin verilmesi iyileşmeyi bozabilir.
    4. Omuz bıçakları arasında 10 mL ılık laktlı Ringer çözeltisini deri altından tutun.
    5. Sıçanları temiz kafese geri taşıyın ve conspecifics ile tekrar bir araya geliyor.
    6. Piloerection, kambur duruş veya eritem, pürülan akıntı veya yara dehiscence de dahil olmak üzere kesi bölgesi enfeksiyonu belirtileri veya inme belirtileri de dahil olmak üzere tüm hayvanları bir sonraki ay boyunca günde iki kez izleyin.
      NOT: Bugüne kadar hayvanların hiçbirinde ameliyat sonrası iyileşmeyi takiben klinik belirtiler (enfeksiyonlar gibi) gözlemlemedik. Sadece bir sıçan dikişlerle dehiscence vardı, daha sonra yara klipsleri daha fazla sorun olmadan yaraları kapatmak için kullanıldı.
    7. Bir laboratuvar hayvan veterinerine danışarak yayınlanan dozlarda klinik ağrı belirtileri gösteren hayvanlara buprenorfin veya meloksikam sürün.
    8. Bir laboratuvar hayvan veterinerine danışarak yayınlanan dozlarda klinik ağrı belirtileri gösteren hayvanlara antibiyotik (yani sefalosporin) sürün.
      NOT: Analjeziklerle iyileşmeyen uzun süreli ağrı veya sıkıntı belirtileri gösteren hayvanların veya antibiyotiklere yanıt vermeyen enfeksiyon belirtileri gösteren hayvanların insanca ötenazi yapılması gerekir.

6. X-ışını ile görüntüleme

  1. Tümör implantasyonundan sonra, kemirgenler için tasarlanmış bir makine ile X-ışını kullanarak tümör büyümesini tespit etmek için kaval kemiğini ve akciğerleri invaziv olmayan bir şekilde görüntüleyin.
  2. Fareleri daha önce yapıldığı gibi uyuşturun.
  3. 25 kV'da 6 s için 3x büyütmede görüntü alın.
  4. X-ray işlemcisini kullanarak filmi işleyin. Radyografiler dijital olarak da taranabilir.

7. Nekropsi prosedürü

  1. Sıçanları CO2ile ötenazi. Kalp atışı eksikliği ile ölümü onaylayın ve serum veya plazma örnekleri için kalpten hemen 3 mL kan çekin.
  2. Toraks ve karnı muayene için açın.
  3. Trakeayı izole edin ve (18 G) kateterle adanın. Kateteri nefes borusuna sabitlemek için, her iki nefes borusunun etrafına kateterle ipek bir dikiş bağlayın.
  4. İnfüzyon kateterini 3 veya 5 mL şırınna bağlayın. Daha iyi histoloji örnekleri için akciğer loblarını hafifçe şişirmek için formalin veya salin demleyin. infüzyonda akciğerler kabarır ve pulmoner metastazların daha iyi bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
  5. Seçilen tüm torasik ve abdominal organları (karaciğer, böbrekler gibi) inceleyin, inceleyin ve tartın.
  6. Organları histopatoloji için formalin olarak sabitlayın veya kuru buz, 2-metilbütan veya sıvı nitrojen üzerinde dondurun.
  7. Batı lekesi kullanılarak protein ekspresyonunun değerlendirilmesi için donmuş dokuların lysates yapın. Sıçan dokuları ile reaksiyona gelen antikorlar ayrıntılıolarak 13.

8. İmmünohistokinoloji

  1. Birincil işletim sistemi dokusunu işleyin, parafin içine gömün ve immünohistokimyasal lekeleme için bölümleyin.
  2. Deparaffinizasyondan sonra antijeni sitrat tamponu (pH 6.0) kullanarak alın. Endojen peroksidazları söndürmek için 30 dakika boyunca metanolde% 0.3H2 O2'de kuluçkaya yatırın.
  3. Normal serum kullanarak 5 μm kalınlığındaki parafin bölümlerini engelleyin.
  4. Primer anti-CD68 ve CD3 antikorları ile kuluçkaya yatırın (tabloya bakınız) gece boyunca 4 °C'de.
  5. Bölümleri PBS'de durulayın ve bir algılama kiti kullanarak HRP polimerinde kuluçkaya yatırın.
    NOT: İmmünostaining, kromojen olarak diaminobenzidin ile geliştirilmiştir.

9. Batı şişkinliği

  1. Standart jel elektroforez ve batı şişkinliği gerçekleştirmek için UMR-106 hücrelerini 200-300 μL lizistamponu 14'te lyse.
  2. %4 ila %12 Bis-Tris jelleri kullanın.
  3. Anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actin veya anti-fare β2-AR primer antikor (tabloya bakınız) ve yaban turpu peroksidaz bağlantılı ikincil antikorda kuluçkaya yatırın.
  4. Chemiluminescent substratını ekleyin. Membranları X-ray filme maruz bırak.
    NOT: yükleme kontrolleri olarak β-actin düzeyleri kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bağışıklık sistemi bozulmamış bir bağışıklık sistemine sahip bir hayvan modeli sunan bu işletim sistemi çalışmaları için bağışıklık sistemi yetersiz SD dışlanmış sıçanlar kullanılmaktadır. ATCC'den UMR106 hücre hattını kullandık, başlangıçta bir SD sıçanından işletim sistemi izole edilmiş hücrelerden geliştirildi. Hücreleri SD sıçanlara yerleştirdik, böylece işletim sistemi için singeneik bir model sağladık. Ayrıca UMR106 hücrelerinin doğrudan kaval kemiği metafizi/diafiz içine ortotopik implantasyonu ilgili bir tümör mi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

OS tibial implantlı sıçanlar implantasyondan 3 hafta sonra ölçülebilir tümörler geliştirirler. Tümörlü uzuvlar implantasyondan 3 hafta sonra kesilirse akciğer metastazının görülme sıklığı önemli ölçüde azalır. OS'ler hem osteolitik hem de osteoblastiktir. Amputasyonsuz sıçanlar, implantasyondan 7 hafta sonra radyografi veya nekropsi ile gözlenen, çoklu ve değişken boyutta akciğer metastazları geliştirir. EGFR, ErbB2 ve ErbB4, insan işletim sistemi 16 ,17,18'...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Beyan edecek bir açıklama yok.

Teşekkürler

Ulusal Kanser Enstitüsü aracılığıyla NIH finansmanı, hibe # CA228582. Shun Ishiyama şu anda Toray Medical Co., Ltd.'den hibe alıyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AKTHücre Sinyalizasyon TEKNOLOJİSİ4685S
emilebilir sütürEthiconJ214H
ve beta;-aktinSANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİsc-47778
ve beta; 2-AR antikoruSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-569&beta ile değiştirildi; 2-AR (E-3): sc-271322
Bis– Tris jellerThermo FisherNP0321PK2
Buprenorfin SR LabZooPharmIZ-70000-201908
CD3 antikoruDako#A0452
CD68 antikorueBioscience# 14-0688-82
Kemilüminesan substratcytivaRPN2232
CL-Xposure filmiThermo Fisher34089
Komple Anestezi SistemiEVETEQUIP922120
diaminobenzidinVEKTÖR LABORATUVARLARISK-4100
DoksorubisinActavisNDC 45963-733-60
EGFR antikoruSANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİsc-03EGFR (A-10) ile değiştirildi: SC-373746
ERBB2 antikoruSANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİSC-284Neu (3B5) ile değiştirildi: sc-33684
ERBB4 antikoruSANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİsc-283ErbB4 (C-7) ile değiştirildi: sc-8050
ERK antikoruSANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİsc-514302
göz yağlayıcıPHARMADERMNDC 0462-0211-38
Hamilton şırınga (100 & mikro; L)HamiltonModel 1710 SN SYR
yaban turpu peroksidaz bağlı ikincil antikorcytivaNA934
HRP polimer tespit kitiVEKTÖR LABORATUVARLARIMP-7401
HRP polimer tespit kitiVEKTÖR LABORATUVARLARIMP-7402
izofluranBUTLER SCHEINNDC 11695-6776-2
izofluran buharlaştırıcıEVETEQUIP911103
UMR-106 hücreliATCCCRL-1661
X-ışınıFaxitronUltraFocus
X-ışını işlemcisiHope X-Ray Peoducts IncMicroMax X-ray İşlemcisi Hopeİşlemcileri artık ABD'de mevcut değil
yara klipsleriBECTON DICKINSON427631
, , ,

Kaynaklar

  1. Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
  2. Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
  3. Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B. Recent advances in osteosarcoma. Current Opinion in Pharmacology. 16, 15-23 (2014).
  4. Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
  5. Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P. Animal models in osteosarcoma. Frontiers Oncology. 4, 189(2014).
  6. Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
  7. Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271(2012).
  8. Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
  9. Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
  10. Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
  11. Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
  12. Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
  13. Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
  14. Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
  15. Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
  16. Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
  17. Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
  18. Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
  19. Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Osteosarkom Sıçan ModeliOrtotopik Tümör İmplantasyonuUzuv AmputasyonuPulmoner MetastazSprague Dawley SıçanlarJuguler Ven EnjeksiyonuX-Işını GörüntülemeİmmünohistokimyaProtein Kinaz EkspresyonuTümör Hücresi İnfiltrasyonu
Metastaz Oranını Kontrol Etmek için Amputasyonlu Syngeneic Ortotopik Osteosarkom Sprague Dawley Sıçan Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.