Method Article

İn vitro Floresan Mikroskopi Bazlı Hareketlilik Testlerinin Miyosin'e Özgü Uyarlamaları

DOI:

10.3791/62180

⸱

February 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan miyosin 5a'yı ifade etmek ve arındırmak için bir prosedür ve ardından hem topluluk hem de tek moleküllü in vitro floresan mikroskopi bazlı tahliller kullanılarak karakterizasyonu ve bu yöntemlerin nonmuscle miyosin 2b'nin karakterizasyonu için nasıl değiştirilebileceği tartışılmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miyosin proteinleri filamentli aksin (F-actin) ile bağlanır ve etkileşime girer ve filogenetik ağaçtaki organizmalarda bulunur. Yapıları ve enzymatic özellikleri, hücrelerde çalıştırdıkları belirli işleve uyarlanır. Myosin 5a, hücrelerdeki melanozomları ve vezikülleri taşımak için F-actin üzerinde işlemsel olarak yürür. Tersine, nonmuscle myosin 2b yaklaşık 30 molekül içeren bipolar filament olarak çalışır. Karşı kutuplu F-actin'i filamentin merkezine doğru hareket ettirir, burada miyozin molekülleri aksini bağlamak, bir güç darbesi vermek ve döngüyü tekrarlamadan önce ayrışmak için zaman uyumsuz olarak çalışır. Nonmuscle myosin 2b, diğer nonmuscle miosin 2 izoformları ile birlikte hücre yapıştırma, sitokinoz ve gerilim bakımı içeren rollere sahiptir. Miyosinlerin mekanokimyası, saflaştırılmış proteinler kullanılarak in vitro hareketlilik tahlilleri yapılarak incelenebilir. Kayma aktisin filament testinde, miyosinler bir mikroskop kapak yüzeyine bağlanır ve izlenebilir floresan etiketli F-actin'i translokasyona uğratır. Bununla birlikte, tek molekül / topluluk hareketliliği testinde, F-actin bir kapak hareketine bağlıdır ve floresan etiketli miyosin moleküllerinin F-actin üzerindeki hareketi gözlenir. Bu raporda, rekombinant miyosin 5a'nın benzeşim kromatografisi kullanılarak Sf9 hücrelerinden arındırılması özetlenmiştir. Bunu takiben, iki floresan mikroskopi tabanlı tahlil özetliyoruz: süzülen aktüer filament tahlili ve ters hareketlilik tahlil. Bu tahlillerden, görüntü analiz yazılımı kullanılarak aksin translokasyon hızları ve tek molekül çalışma uzunlukları ve hızları gibi parametreler çıkarılabilir. Bu teknikler, burada nonmuscle miyozin 2b bağlamında tartışılan nonmuscle miyozin 2 izoformlarının tek filamentlerinin hareketini incelemek için de uygulanabilir. Bu iş akışı, tek molekül ve topluluk dinamiklerini incelemek için kullanılabilecek bir protokol ve nicel araçlar kümesini temsil eder.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miyosinler, adenozin trifosfat (ATP) hidrolizi1'denelde edilen enerjiyi kullanarak aksin filamentlerine güç uygulayan motor proteinlerdir. Miyozinler bir baş, boyun ve kuyruk alanı içerir. Baş etki alanı, aksin bağlama bölgesinin yanı sıra ATP bağlama ve hidroliz alanını içerir. Boyun etki alanları, hafif zincirlere, calmodulin veya calmodulin benzeri proteinlere bağlanan IQ motiflerinden oluşur2,3. Kuyruk bölgesi, iki ağır zincirin küçültmesi, kargo moleküllerinin bağlanması ve miyosin'in baş etki alanlarıyla otoinhibitory etkileşimleri yoluyla düzenlenmesi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere her miyosin sınıfına özgü çeşitli işlevlere sahiptir1.

Miyozin'in hareketli özellikleri sınıflar arasında büyük ölçüde değişir. Bu özelliklerden bazıları görev oranını (miyosin'in hareket etmeye bağlı olduğu mekanik döngüsünün fraksiyonu) ve süreçselliği (bir motorun ayrılmadan önce pistinde birden fazla adım atma yeteneği)4. 40'ın üzerinde miyozin sınıfı sıra analizleri5, 6,7,8esas alınarak belirlenmiştir. Sınıf 2 miyozinler, ilk çalışılanlar oldukları için "geleneksel" olarak sınıflandırılır; Bu nedenle, diğer tüm miyozin sınıfları "alışılmadık" olarak sınıflandırılır.

Myosin 5a (M5a) sınıf 5 miyozindir ve bir işlem motorudur, yani ayrışmadan önce aktüer boyunca birden fazla adım atabilir. Mekanik döngüsünün büyük bir kısmını 9 , 10 , 11 ,12,13,14. Diğer miyosinlerle ortak olarak, ağır zincir, hem aksin bağlama hem de ATP hidroliz bölgesini ve ardından temel ışık zincirlerine (ELC) ve calmodulin (CaM)15'ebağlanan altı IQ motifi ile kol kolu görevi gören bir boyun bölgesini içeren bir N-terminal motor etki alanı içerir. Kuyruk bölgesi, molekülü küçülten α sarmal sarmallar ve ardından yükü bağlamak için küresel bir kuyruk bölgesi içerir. Kinetiği, melanositlerdeki melanozomların ve Purkinje nöronlarındaki endoplazmik retikulumun taşınmasındaki rolünü yansıtır16,17. M5a prototipik kargo taşıma motoru18olarak kabul edilir.

Sınıf 2 miyozinler veya geleneksel miyozinler, iskelet, kardiyak ve düz kasın güç kasılmasını sağlayan miyozinleri içerir, nonmuscle miyozin 2 (NM2) izoformlarına ek olarak, NM2a, 2b ve 2c19. NM2 izoformları tüm hücrelerin sitoplazmasında bulunur ve sitokin, yapıştırma, doku morfogenez ve hücregöçünde 19,20 ,21,22ortak rollere sahiptir. Bu makalede, nonmuscle myosin 2b (NM2b)23bağlamında geleneksel miyozin protokolleri tartışılmaktadır. NM2b, M5a'ya kıyasla düşük bir görev oranına sahiptir ve M ≈5a'nın V maks. Özellikle, iki başlı kesilmiş NM2b yapıları, aktiin üzerinde işlemsel olarak kolayca hareket etmez; bunun yerine, aktivin ile her karşılaşma, molekülün ayrışması ile takip eden bir güç vuruşu ile sonuçlanır25.

NM2b, her biri bir küresel kafa etki alanına sahip iki miyozin ağır zincir, bir kol kolu (bir ELC ve bir düzenleyici ışık zinciri (RLC) ve bu iki ağır zinciri küçülten yaklaşık 1.100 amino asit uzunluğunda α sarmal bobin çubuğu / kuyruk etki alanı içerir. NM2b'nin enzymatic aktivitesi ve yapısal durumu RLC23'ünfosforilasyonu ile düzenlenir. Fosforilasyonsuz NM2b, ATP ve fizyolojik iyonik güçlü yönlerin (yaklaşık 150 mM tuz) varlığında, iki kafanın asimetrik bir etkileşime katıldığı ve kuyruğun iki yerde kafaların üzerine geri katlandığı kompakt bir uygunluk benimser23. Bu durumda, miyozin aktiz ile güçlü bir şekilde etkileşime girmez ve çok düşük enzimmatik aktiviteye sahiptir. Calmodulin bağımlı miyosin ışık zinciri kinaz (MLCK) veya Rho ile ilişkili protein kinazı ile RLC fosforilasyonu üzerine, molekül yaklaşık 30 miyozin molekülünün bipolar filamentlerini oluşturmak için kuyruk bölgesinde diğer miyozinlerle genişler ve ilişkilendirir23. RLC'nin yukarıda belirtilen fosforilasyonu, NM2b'nin aksinle aktive atpase aktivitesinin yaklaşık dört kat artmasına neden oluyor26,27,28. Her iki ucunda birçok miyozin motoru bulunan bu bipolar filament düzenlemesi, karşı kutuplara sahip aktüer filamentlerin birbirine göre hareket ettirilebildiği kasılma ve gerilim bakımındaki roller için optimize edilmiştir23,29. Buna göre, NM2b'nin actin ile etkileşime girerken bir motor topluluğu olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Bu filament içindeki çok sayıda motor, NM2b filamentlerinin aktüer filamentler üzerinde işlemsel olarak hareket etmesine izin verir, bu da in vitro filament sürecini karakterize etmeyi mümkün hale getirir29.

Miyozinlerin hücredeki rolünü anlamada ilerleme kaydedilirken, protein düzeyinde bireysel özelliklerinin anlaşılmasına ihtiyaç vardır. Aktomiyosin etkileşimlerini bir hücrenin içinde değil, basit bir protein-protein etkileşim düzeyinde anlamak için, in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere rekombinant miyosinleri ifade edebilir ve saflaştırabiliriz. Bu tür çalışmaların sonuçları daha sonra mechanobiyologları karmaşık hücresel süreçleri yönlendiren spesifik miyosinlerin biyofiziksel özellikleri hakkında bilgilendirir12 , 13,14,25,29. Tipik olarak, bu, tam uzunlukta veya kesilmiş bir miyozin yapısına benzeşim etiketi eklenerek ve benzeşim kromatografisi29,30,31ile arındırılarak gerçekleştirilir. Ek olarak, yapı genetik olarak kodlanabilir bir florofor veya sentetik bir florofor ile protein etiketleme etiketi içerecek şekilde tasarlanmıştır. Böyle bir floresan etiket eklenerek miyosin mekaniği ve kinetiği gözlemlemek için tek moleküllü görüntüleme çalışmaları yapılabilir.

Saflaştırmadan sonra, miyozin çeşitli şekillerde karakterize edilebilir. ATPase aktivitesi kolorimetrik yöntemlerle ölçülebilir, motorun farklı koşullar altında genel enerji tüketimi ve aktüen benzeşimi hakkında fikir sağlar32. Hareketliliğinin mekanokmemetrisi hakkında bilgi edinmek için daha fazla deney yapılması gerekir. Bu makalede, saflaştırılmış bir miyosin proteininin hareketli özelliklerini karakterize etmek için kullanılabilecek iki in vitro floresan mikroskopi tabanlı yöntem ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Bu yöntemlerden ilki, miyozin motorlarının topluluk özelliklerini nicel olarak incelemek ve bir grup saflaştırılmış proteinin kalitesini niteliksel olarak incelemek için kullanılabilecek kayma aktinin filament tahliltahlilidir 33. Bu makalede bu test için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisinin kullanımı tartışılsa da, bu deneyler birçok laboratuvarda yaygın olarak bulunan dijital kamera ile donatılmış geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak etkili bir şekilde gerçekleştirilebilir34. Bu testte, bir kapak kapağına doygun bir miyozin motor tabakası tutturulur. Bu, nitroselüloz, antikorlar, zarlar, SiO2türetilmiş yüzeyler (trimetilchlorosilane gibi), diğerleri29, 33,35,36,37,38kullanılarak gerçekleştirilebilir. Floresan etiketli aktisin filamentleri, akinin yüzeye bağlı miyosin'e bağlandığı kapak odasından geçirilir. ATP (ve NM2 çalışmasındaki kinazlar) ek olarak, oda yüzeye bağlı miyozinler tarafından aktiin filamentlerinin translokasyonunun gözlemlenmesi için resmedilir. İzleme yazılımı, her bir kayma eyleminin hızını ve uzunluğunu ilişkilendirmek için kullanılabilir. Analiz yazılımı ayrıca, belirli bir miyozin preparatının kalitesini belirlemek için yararlı olabilecek hem hareketli hem de sabit aktüer filamentlerinin sayısının bir ölçüsünü sağlayabilir. Durmuş filamentlerin oranı, aktin yüzeyinin diğer proteinlere bağlanmasıyla kasıtlı olarak modüle edilebilir ve miyozin39'unyük bağımlılığını belirlemek için ölçülebilir. Her aktüen filament çok sayıda mevcut motor tarafından itilebildiğinden, bu test çok tekrarlanabilir, son ölçülen hız başlangıç miyozin konsantrasyonundaki değişiklikler veya çözeltideki ek faktörlerin varlığı gibi pertürbasyonlara karşı sağlamdır. Bu, değiştirilmiş fosforilasyon, sıcaklık, iyonik mukavemet, çözelti viskozitesi ve yüzey tetherlerinin neden olduğu yükün etkileri gibi farklı koşullar altında miyozin aktivitesini incelemek için kolayca değiştirilebileceği anlamına gelir. ATP hidrolizden aciz güçlü bağlayıcı miyozin "ölü kafalar" gibi faktörler duran aksin filamentlerine neden olsa da, bu tür sorunları azaltmak ve doğru ölçümlere izin vermek için birden fazla yöntem mevcuttur. Miyozinin kinetik özellikleri sınıflar arasında büyük ölçüde değişir ve kullanılan spesifik miyozinlere bağlı olarak, bu testte süzülen aktüer filament hızı 20 nm / s (miyozin 9) 40,41ve 60.000 nm / s 'ye (Characean myosin 11)42'ye kadar değişebilir.

İkinci test, kayma aktinin geometrisini tersine çevirir filament12. Burada, aktisin filamentleri kapak yüzeyine tutturulur ve M5a'nın tek moleküllerinin veya NM2b'nin bireysel bipolar filamentlerinin hareketi görselleştirilir. Bu test, actin üzerindeki tek miyozin moleküllerinin veya filamentlerinin çalışma uzunluklarını ve hızlarını ölçmek için kullanılabilir. Bir kapak, spesifik olmayan bağlamayı engelleyen ve aynı zamanda biyotin-polietilen glikol (biotin-PEG) gibi yüzeyi işlevselleştiren kimyasal bir bileşikle kaplanır. Modifiye avidin türevlerinin eklenmesi daha sonra yüzeyi astarlar ve biyotinillenmiş aktin hazneden geçirilir, bu da odanın dibine bağlı bir F-aktin tabakası ile sonuçlanır. Son olarak, aktif ve floresan etiketli miyosin (tipik olarak 1-100 nM) hazneden akar, daha sonra sabit aksin filamentleri üzerinde miyosin hareketini gözlemlemek için görüntülenmiştir.

Bu yöntemler, hem nonmuscle hem de kas miyozinlerinin dinamiklerini incelemek için bunların kullanılabileceği hızlı ve tekrarlanabilir yöntemleri temsil eder. Bu rapor, sırasıyla alışılmadık ve geleneksel miyozinleri temsil eden hem M5a hem de NM2b'yi arındırma ve karakterize etme prosedürlerini özetlemektedir. Bunu, tahlilin iki tipinde hareketin başarılı bir şekilde yakalanmasını sağlamak için gerçekleştirilebilen miyozine özgü uyarlamalardan bazılarının tartışılması takip eder.

İfade ve moleküler biyoloji
İlgi miyozin için cDNA, M5a-HMM'yi ifade ediyorsa C terminali BAYRAK etiketi (DYKDDDDK) veya NM2b23, 43 , 44 ,45,46tam uzunluk moleküllerini ifade ediyorsa bir N-terminal FLAG-tag için kodlanan değiştirilmiş bir pFastBac1 vektörüne klonlanmalıdır. NM2b'deki C-terminal FLAG etiketleri, FLAG benzeşimi sütunu için proteinin zayıflamış bir benzeşimiyle sonuçlanır. Buna karşılık, N-terminally FLAG etiketli protein genellikle FLAG benzeşimi sütunu23'eiyi bağlanır. N-terminal etiketli protein enzmatik aktiviteyi, mekanik aktiviteyi ve fosforilasyona bağlı düzenlemeyi korur23.

Bu yazıda, FLAG etiketi ile miyosin ağır zincirinin C-terminusu arasında GFP bulunan kesilmiş bir fare M5a ağır meromyosin (HMM) benzeri bir yapı kullanılmıştır. NM2b'den farklı olarak, M5a-HMM'nin N veya C terminali FLAG etiketleriyle başarıyla etiketlenebilir ve saflaştırılabilir ve her iki durumda da sonuçta elde edilen yapının etkin olacağını unutmayın. M5a ağır zinciri amino asit 1090'da kesilmiştir ve GFP ile M5a47'ninsarmal bobin bölgesi arasında üç amino asit bağlayıcı (GCG) içerir. GFP ve FLAG etiketi arasına ek bağlayıcı eklenmedi. M5a-HMM calmodulin ile birlikte ifade edildi. Tam boy insan NM2b yapısı ELC ve RLC ile birlikte ifade edildi. RLC'nin N-termini, beş amino asit (SGLRS) bağlayıcısı aracılığıyla bir GFP ile kaynaştırıldı. FLAG etiketine doğrudan iliştirilmiş bir HaloTag idi. HaloTag ve miyosin ağır zincirinin N-terminusları arasında iki amino asit (AS) yapılmış bir bağlayıcı vardı.

Her iki miyozin preparatı da yaklaşık 2 x 106 hücre/mL yoğunlukta baculovirüs ile enfekte olmuş bir litre Sf9 hücre kültüründen arındırıldı. Her alt birim için baculovirüs hacimleri, üreticinin talimatlarıyla belirlenen virüsün enfeksiyon çokluğuna bağlıydı. M5a durumunda, hücrelere calmodulin için iki farklı baculovirus-bir ve M5a ağır zinciri için bir tane ile birlikte enfekte edildi. NM2b durumunda, hücrelere ELC için üç farklı virüs-bir, RLC için bir ve NM2b ağır zinciri için bir virüs bulaştı. Çeşitli miyosinlerle (veya diğer çok karmaşık proteinlerle) çalışan laboratuvarlar için bu yaklaşım, ağır ve hafif zincirlerin ve calmodulin gibi yaygın olarak kullanılan hafif zincirlerin birçok kombinasyonuna izin verdiğinden, birçok farklı miyosin ağır zinciri ile birlikte trans enfekte edilebilir. Tüm hücre çalışmaları, kontaminasyonu önlemek için uygun steril teknikle biyogüvenlik kabininde tamamlandı.

Hem M5a hem de NM2b'nin ekspresyonu için, rekombinant miyozinleri üreten Sf9 hücreleri, santrifüjleme yoluyla enfeksiyondan 2-3 gün sonra toplandı ve -80 °C'de depolandı. Hücre topakları, 4 °C'de 2.800 x g'da30 dakika boyunca birlikte enfekte olmuş Sf9 hücrelerinin santrifüj edilmesiyle elde edildi. Protein saflaştırma işlemi aşağıda ayrıntılı olarak verilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protein saflaştırma

  1. Hücre lizisi ve protein ekstraksiyonu
    1. Tablo1'i temel alan 1,5x Ayıklama Arabelleği hazırlayın. 4 °C'de filtreleyin ve saklayın.
    2. Hücre topaklarını buzda eritmeye başla. Peletler çözülürken, 1.2 mM dithiothreitol (DTT), 5 μg/mL leupeptin, 0.5 μM feniltilsülfonil florür (PMSF) ve iki proteaz inhibitörü tablet ile 100 mL Ekstraksiyon Tamponu takviyesi. Buzda kal.
    3. Pelet çözüldükten sonra, 10 mL hücre kültürü başına ekli Ekstraksiyon Tamponu'ndan 1 mL ekleyin. Örneğin, hücre peletleri 500 mL hücre kültüründen oluşturulmuşsa, pelete 50 mL takviyeli Ekstraksiyon Tamponu ekleyin.
    4. Hücre topaklarını buzda tutarken sonicate edin. Her pelet için aşağıdaki koşulları kullanın: 5 s ON, 5 s KAPA, süre 5 dk, güç 4-5.
    5. Tüm homojenize lisatları bir behere toplayın ve ATP'nin son konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde ATP (0,1 M stok çözeltisi; pH 7,0) ekleyin. Soğuk bir odada 15 dakika karıştırın. ATP, aktif miyozini aktüerden ayırarak aşağıdaki santrifüj adımında ayrılmasına izin verir. Bu nedenle, ATP tükenmesi ve yeniden bağlama olasılığını en aza indirmek için hemen bir sonraki adıma geçmek önemlidir.
    6. Lysates'i 4 °C'de 1 saat boyunca 48.000 x g'da santrifüj edin. Bu meydana gelirken, üreticinin talimatlarına göre, 100 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile %50 anti-FLAG benzeşim reçinesinin (1 L hücreden oluşan bir pelet için) 1-5 mL'sini yıkamaya başlayın. Örneğin, 5 mL reçine için, % 50 bulamacın 10 mL'sini yıkayın. Son yıkama adımında, reçineyi% 50 bulamacı oluşturmak için yeterli hacimde 1-5 mL PBS ile yeniden atın.
    7. Lisat santrifüjlemeden sonra, süpernatantı yıkanmış reçine bulamacı ile birleştirin ve soğuk odada 1-4 saat boyunca hafifçe sallayın. Beklerken, Tablo 1'de açıklanan tamponları yapın ve buzda tutun.
  2. BAYRAK benzeşimi saflaştırma hazırlığı
    1. Çözümü 1,7 adımda 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. Reçine tüpün altına paketlenecektir. Reçineyi bozmadan, süpernatant çıkarın.
    2. Reçineyi Tablo 1'de ayrıntılı olarak belirtildiği gibi 50 mL Tampon A'da ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjde yeniden sakla. Reçineyi bozmadan, süpernatant çıkarın.
    3. Reçineyi Tablo 1'de ayrıntılı olarak belirtildiği gibi 50 mL Tampon B'de ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjde yeniden sakla. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın ve reçineyi 20 mL Tampon B'de yeniden dirildi. Daha sonra tüpü yaklaşık 10 kez elle hafifçe ters çevirerek reçineyi ve tamponu iyice karıştırın.
  3. Protein salınımı ve konsantrasyonu
    1. Tablo 1'de açıklandığı gibi 30 mL Elution Buffer yapın ve buzda soğumasını bırakın.
    2. İfade sütununu soğuk bir odaya kurun. Reçine bulamacını yavaşça sütuna dökün. Reçine altta paketli olarak sütunu 1-2 sütun hacimli B Tamponu ile yıkayın ve reçinenin kurumamasını sağlayın.
    3. Elution Buffer'ın 1 mL'lik kısmını reçineden geçirin ve akışı 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın. 12, 1 mL kesirlerin toplandığı şekilde tekrarlayın.
    4. Bu noktada, hangi fraksiyonların en konsantre48olduğunu niteliksel olarak belirlemek için kesirler üzerinde kaba bir Bradford testi gerçekleştirin. 96 kuyu plakasının bir satırında pipet 60 μL 1x Bradford reaktifi. Kesirler toplandıkça, kuyu başına her kesirden 20 μL karıştırın. Koyu mavi renklendirme, daha konsantre kesirleri gösterir.
    5. 50 mL'lik bir tüpte, sütun akışında reçineye bağlı kalan miyozinleri serbest bırakmak için kalan Elution Buffer'ı sütundan hafifçe pipetleyerek kalan proteini toplayın. Bu akış bir sonraki adımda yoğunlaştırılacaktır. Reçinenin daha sonra yeniden kullanılmak üzere yeniden canlandığından ve üreticinin talimatlarına göre saklandığından emin olun.
    6. En konsantre üç fraksiyonu birnize ayırın ve 50 mL'lik tüpte ve kalan 1 mL fraksiyonlarda 100.000 MWCO konsantre tüpü kullanarak akış akışını daha da yoğunlaştırın. Havuza alınan numuneyi konsantre tüpe yükleyin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 750 x g'da santrifüje yükleyin ve elde edilen tüm protein yaklaşık 0,5-1 mL'lik son hacme konsantre olana kadar tekrarlayın.
      NOT: Bu gözenek boyutu, moleküler ağırlık kesmesinin birkaç katı kütleye sahip olan miyozin moleküllerinin tutulmasını sağlar. Işık zincirleri, son üründe SDS-PAGE jel elektroforezi yapılarak doğrulanan bu konsantrasyon süresi boyunca motor etki alanlarına sıkıca bağlı kalır.
  4. Diyaliz ve flaş dondurma
    1. Tablo 1'deaçıklandığı gibi 2 L Diyaliz Tamponu yapın. Numuneyi bir diyaliz torbasına veya haznesine yükleyin ve soğuk odada gece boyunca dialyze yapın. Diyaliz tamponlarının bileşiminin NM2b ve M5a için farklılık gösterir.
      NOT: NM2b durumunda, bu diyaliz adımının amacı düşük iyonik mukavemet tamponunda miyozin filamentleri oluşturmaktır. Bu filamentlerin çökeltilmesi daha sonra ek bir saflaştırma adımı sağlar ve numunenin konsantrasyonuna izin verir. Bu nedenle, ertesi gün diyaliz odasında görünür bir beyaz çökelti olacaktır. Bu filamentler santrifüjleme ile toplanacak ve 5.1. M5a-HMM durumunda, gece diyalizden sonra, protein sonraki tahlillerde kullanım için yeterince saf olacaktır. Gerekirse jel filtrasyonu veya iyonik değişim kromatografisi gibi daha fazla saflaştırma adımı yapılabilir. Diyaliz sonrası M5a iyileşmesi için 5.2.
  5. Diyaliz sonrası miyozin kurtarılıyor
    1. NM2b için, miyozin filamentlerini toplamak için 49.000 x g'da 15 dakika boyunca 4 °C'de diyaliz torbasından veya odasından ve santrifüjden tüm numuneyi dikkatlice boşaltın. Üstnatantı atın ve çözülene kadar Depolama Arabelleği'ni Tablo 1'de açıklandığı gibi pelete artımlı olarak ekleyin. Nazik yukarı ve aşağı pipetleme peleti yatıştırmaya yardımcı olur. Normalde, bu tüp başına 500 μL'den fazla gerektirmez. Peletin yüksek iyonik mukavemetli depolama tamponunda tamamen çözülmesini sağladıktan sonra, miyozin artık elverişsiz olacağından ve süpernatanta kalacağından, gerekirse istenmeyen agregaları çıkarmak için ek bir santrifüjleme adımı (49.000 x g'da15 dk) gerçekleştirilebilir.
    2. M5a-HMM için, istenmeyen agregaların olması durumunda 49.000 x g'da 15 dakika boyunca 4 °C'de diyaliz odasından ve santrifüjden tüm numuneyi dikkatlice toplayın. Üst subayı al.
  6. Konsantrasyon belirleme ve flaş dondurma
    1. Ürünün konsantrasyonunu belirlemek için, 260, 280, 290 ve 320 nm dalga boylarında bir spektrofotometre kullanarak emiciliği ölçün. Denklem 1ile mg/mL (c mg /mL) konsantrasyonu hesaplayın , burada A280 emilimi 280 nm'de ve A320 emilimi 320 nm'de temsil eder. Mg/mL'de elde edilen konsantrasyon Denklem 2 ile miyozin moleküllerinin μM'sinedönüştürülebilir , burada M tüm proteinin moleküler ağırlığıdır (ağır zincirler, hafif zincirler, floroforlar ve tüm etiketler dahil).
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      μM molekülleri = 1000cmg/mL/M (2)
      NOT: Bir seyreltme gerekliyse, yüksek iyonik mukavemet tamponunda yapılmalıdır. Yok olma katsayısı (ε), proteinin amino asit dizisinin ExPASy gibi bir programa ithal edilmesiyle belirlenebilir. M5a-HMM için tipik verim yaklaşık 0.5-1 mL 1-5 mg/mL protein ve tam uzunlukta NM2b için 0.5-1 mL 0.5-2 mg/mL'dir. Bu yazıda kullanılan M5a-HMM'nin yok olma katsayısı 0.671 idi. Bu yazıda kullanılan NM2b'nin yok olma katsayısı 0.611 idi.
    2. Saflaştırılmış miyozini iki yoldan birinde saklayın. Polimerizasyon zinciri reaksiyon tüpü gibi ince duvarlı bir tüpe 10-20 μL arasında aliquot ve tüpü flaş dondurma için bir sıvı nitrojen kabına bırakın. Alternatif olarak, doğrudan 20-25 μL miyotin arasında sıvı nitrojene pipet ve dondurulmuş protein boncuklarını steril kriyojenik tüplerde saklayın. Her iki durumda da, elde eden tüpler ileride kullanılmak üzere -80 °C veya sıvı azot içinde saklanabilir.
      NOT: Aşağıda açıklanan her iki hareketlilik tahlilleri de çok az miktarda protein gerektirdiğinden, açıklandığı gibi küçük aliquotlarda depolama ekonomiktir.

2. Gliding actin filament test

  1. Kapak hazırlığı
    1. Amil asetat içinde% 1 nitroselüloz çözeltisi yapın.
    2. Bir doku kültürü kabı (150 x 25 mm) alın ve kabın altına dairesel bir filtre kağıdı (125 mm çapında) ekleyin.
    3. Sekiz No. 1.5 kalınlığında 22 mm kare kapakları bir rafa yükleyin ve yaklaşık 2-5 mL 200 geçirmez etanol ve ardından 2-5 mL damıtılmış su (dH2O) ile yıkayın. Su ile biten bu yıkama adımını tekrarlayın. Ardından, filtrelenmiş bir hava hattı veyaN 2hattı kullanarak kapakları tamamen kurulayın.
    4. Bir kapak ucu alın ve kaymanın bir kenarı boyunca% 1 nitroselüloz çözeltisinin 10 μL'sini yavaşça pipetleyin. Daha sonra, tek bir düz hareketle, pürüzsüz taraflı 200 μL pipet ucunun yan tarafını kullanarak kapak ucunun geri kalanına sürün. Bu örtüşümü nitroselüloz tarafı yukarı olacak şekilde doku kültürü kabına yerleştirin. Kalan kapaklar için tekrarlayın ve kalan reaktifleri hazırlarken kurumasını bekleyin ve kaplamadan sonra 24 saat içinde kapak örtüleri kullanın.
  2. Oda hazırlığı
    1. Büyük kalıntıları temizlemek için mikroskop kaydırağı optik lens kağıdıyla silin. Yaklaşık 2 cm uzunluğunda iki parça çift taraflı bant kesin.
    2. Mikroskop slaytının uzun kenarının ortasına bir parça yerleştirin. Bandın kenarının slaydın kenarıyla hizalı olduğundan emin olun. İkinci bant parçasını, ilk bant parçasının yaklaşık 2 mm altına yerleştirin, böylece ikisi paralel ve hizalanır. Bu, yaklaşık 10 μL çözelti tutabilen bir akış odası oluşturur (bkz. Şekil 1).
    3. Bölüm 1'den nitroselüloz kaplı kapaklardan birini alın. Kapak sapını bant üzerine dikkatlice yapıştırın, böylece nitroselülozla kaplanmış taraf bantla doğrudan temas eder, (bkz. Şekil 1). Pipet ucu kullanarak, kapak kapağının slayda düzgün yapıştığından emin olmak için slayt bandı arayüzüne hafifçe bastırın. Kaydırağın kenarında asılı kalan fazla bandı jiletle kesin.
  3. Actin hazırlığı
    1. Polimerizasyon tamponunda (50 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7.0)) bir gecede globüler aksin (G-actin) polimerize ederek 20 μM F-actin yapın.
    2. F-actin'i hareketlilik tamponunda 5 μM'ye seyreltin (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)). Rhodamine-phalloidin en az 1.2x molar fazlalığı ile etiket. Buz üzerinde en az 2 saat bekletin (alüminyum folyo ile kaplı). Bu, buz üzerinde depolanan 1-2 aya kadar kullanılabilir.
  4. Myosin 5a süzülme eylemi filament testini gerçekleştirme
    NOT: Bu bölümde myosin 5a (HMM) kayma testinin detayları verilmiştir.
    1. Tablo 2'de açıklanan miosin 5a için çözümleri hazırlayın ve buzda tutun.
    2. Miyozin 5a'nın (50-100 nM) 10 μL'sinde akış odasından akar ve 1 dakika bekleyin.
    3. 1 mg/mL BSA'nın 10 μL'sinde 1 mM DTT ("düşük tuz" tamponu) ile 50 mM MB'de akış. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra 1 dakika bekleyin. Kağıdın köşesini akış odası çıkışına hafifçe yerleştirerek çözeltiyi kanaldan geçirmek için bir kağıt mendil veya filtre kağıdının köşesini kullanın.
    4. 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    5. Tartışma bölümünde tartışıldığı gibi "ölü kafaları" ortadan kaldırmak için siyah aksin çözeltisinin 10 μL'sinde (5 μM F-actin, 1 μM calmodulin ve 1 mM DTT ile 50 mM MB'de 1 mM ATP) akış.
      1. Çözeltiyi odaya sokmadan önce aktiin filamentlerini yamaçlamak için çözeltiyi 1 mL şırınga ve 27 G iğne ile pipetle. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın ve üçüncü seferden sonra 1 dakika bekleyin. Yaklaşık 20 pipetleme olayı yeterlidir.
      2. "Ölü kafa" dönüşünü gerçekleştirmek için, 500 mM tuz konsantrasyonunda 1 mM ATP ve 1 mM MgCl2 varlığında miyosin'e bir stoichiometrik miktarda F-actin ekleyin. Daha sonra 4 °C'de 15 dakika boyunca 480.000 x g'da ultracentrifuge. Ölü miyozin pelet içinde olacak.
    6. Serbest aksin filamentleri odasını tükenmek için 1 mM DTT ve 1 mM ATP ile 50 mM MB'lık 50 μL'lik akış.
    7. 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Herhangi bir ATP'nin haznesini tükenmek için bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    8. 50 mM MB'de 1 mM DTT içeren 10 μL 20 nM rhodamine actin (Rh-Actin) çözeltisinde akış ve örtünün yüzeyine bağlı miyozin 5a'ya aksin filamentlerinin sert bir şekilde bağlanmasına izin vermek için 1 dakika bekleyin.
    9. Yüzeye bağlı olmayan Rh-Actin filamentlerini yıkamak için 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    10. 30 μL Son Tamponda akış.
    11. Rh-Actin'i görselleştirmek için 561 nm'lik bir heyecan dalga boyu kullanarak floresan mikroskopta görüntü kaydedin. Uygun bir maruz kalma süresi, toplam 0,5-1 dk alım süresi için 1,4 mW lazer gücünde 200 ms'dir.
      NOT: Alım oranının hareketli filamentlerin hızına uygun şekilde ölçeklendirilmesini sağlayın. İzleme programlarıyla kullanılmak üzere veri toplamadan önce önemli bir husus, edinme kare hızıdır. Çerçeveler arasındaki alt piksel hareketleri hızın abartmasıyla sonuçlanır ve doğru değerleri elde etmek için birkaç yüz nanometrenin hareketleri gerekir. En uygun alım oranı, kareler arasında en az bir piksel mesafe için süzülme özelliğine sahiptir. Buradaki görüntüleme için kullanılan TIRF mikroskobu durumunda, bu eşik 130 nm'ye dönüşür; bu nedenle, 10 nm/sn yol kat etmesi beklenen bir miosin 0,05 kare/sn (20 s aralık) gerektirirken, 200 nm hareket elde etmek için 5 kare/s (0,2 s aralık) hızında görüntülenmelidir. Bu nedenle, gerekirse veriler bu aşamada altörneklenebilir (daha fazla ayrıntı için Tartışma'ya bakın).
  5. Nonmuscle myosin 2b süzülme actin filament testini gerçekleştirme
    NOT: Bu bölümde, tam boy nonmuscle myosin 2b kayma testinin ayrıntıları verilmiştir. Nonmuscle myosin 2b gliding actin filament test protokolü belirli adımlarda myosin 5a protokolünden farklıdır. Bu adımların her biri için doğru arabelleklerin kullanıldığından emin olun. Örneğin, NM2b tahlili, miyozin yüksek tuz tamponundaki kapak kapağına bağlanmasını gerektirirken, M5a yüksek veya düşük tuz tamponlarında kapak kapağına takılabilir. Ek olarak, M5a süzülme aktiment filament tahlili, alım sırasında parçalanan aktiin filamentlerinin sıklığını azaltmak için daha düşük bir miyozin konsantrasyonu kullanır.
    1. NM2b çözümlerini Tablo 2'de açıklandığı gibi hazırlayın ve buzda tutun.
    2. 500 mM Hareketlilik Tamponu (MB) ("yüksek tuz" tamponu) ve 1 mM dithiothreitol (DTT) içinde 10 μL'lik miyosin 2b (0,2 μM) akış odasından akar ve 1 dakika bekleyin.
      NOT: Yüksek tuz tamponları miyozin filamentlerini ayırır ve tek miyozin moleküllerinin yüzeye bağlanmasına izin verir, çünkü nonmuscle miyozin 2b iyonik konsantrasyonda filamentlere polimerize olabilir <150 mM.
    3. Tablo 2'deaçıklandığı gibi 1 mg/mL sığır serum albüminin (BSA) 10 μL'sinde 500 mM MB'de 1 mM DTT ("yüksek tuz" tamponu) ile akış. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra 1 dakika bekleyin. Çözeltiyi kanaldan geçirmek için bir kağıt mendilin köşesini kullanın veya kağıdı filtreleyin.
    4. Tablo 2'de açıklandığı gibi 1 mM DTT ile 500 mM MB'lık 10 μL ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    5. Tartışma bölümünde daha fazla tartışıldığı gibi "ölü kafaları" ortadan kaldırmak için Tablo 2'de açıklandığı gibi siyah aksin çözeltisinin 10 μL'sinde akış. Siyah aksin çözeltisi, odanın yüzeyindeki lekesiz miyozin 2b'yi fosforilasyona dahil etmek için 5 μM etiketsiz F-actin, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mMCaCl2 , 1 μM CaM ve 50 mM NaCl hareketlilik tamponunda 1 mM DTT içerir.
      1. Çözeltiyi odaya sokmadan önce aktiin filamentlerini yamaçlamak için çözeltiyi 1 mL şırınga ve 27 G iğne ile pipetle. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın ve üçüncü seferden sonra 1 dakika bekleyin. Yaklaşık olarak, 20 pipetleme olayı yeterlidir.
    6. Serbest aksin filamentleri odasını tükenmek için 1 mM DTT ve 1 mM ATP ile 50 mM MB'lık 50 μL'lik akış.
    7. 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Herhangi bir ATP'nin haznesini tükenmek için bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    8. 50 mM MB'de 1 mM DTT içeren 10 μL 20 nM Rh-Actin çözeltisinde akış ve kapak ucunun yüzeyine bağlı olmayan miyozin 2b'ye aktizon filamentlerinin sert bir şekilde bağlanmasına izin vermek için 1 dakika bekleyin.
    9. Yüzeye bağlı olmayan Rh-Actin filamentlerini yıkamak için 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    10. 30 μL Son Tamponda akış. Nonmuscle myosin 2b gliding actin filament testi için, Son Tampon ayrıca video görüntüleme sırasında nonmuscle miyosin2b'nintam fosforilasyonını sağlamak için calmodulin, CaCl 2 ve miyosin ışık zinciri kinazını içerir. Aksin filamentleri sadece gevşek bir şekilde bağlıysa veya yüzeye bağlı değilse, %0,7 metilselüloz da Son Tampona dahil edilebilir. Bu, Tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak ele alınmıştır.
    11. 561 nm'lik bir heyecan dalga boyu kullanarak floresan mikroskopta görüntü kaydedin. Uygun bir pozlama süresi, toplam 0,5 -3 dk alım süresi için 1,4 mW lazer gücünde 200 ms'dir.
      NOT: Alım oranının hareketli filamentlerin hızına uygun şekilde ölçeklendirilmesini sağlayın. İzleme programlarıyla kullanılmak üzere veri toplamadan önce önemli bir husus, edinme kare hızıdır. Çerçeveler arasındaki alt piksel hareketleri hızın abartmasıyla sonuçlanır ve doğru değerleri elde etmek için birkaç yüz nanometrenin hareketleri gerekir. En uygun alım oranı, kareler arasında en az bir piksel mesafe için süzülme özelliğine sahiptir. Buradaki görüntüleme için kullanılan TIRF mikroskobu durumunda, bu eşik 130 nm'ye dönüşür; bu nedenle, 10 nm/sn yol kat etmesi beklenen bir miosin 0,05 kare/sn (20 s aralık) gerektirirken, 200 nm hareket elde etmek için 5 kare/s (0,2 s aralık) hızında görüntülenmelidir. Bu nedenle, gerekirse veriler bu aşamada aşağı örneklenebilir (daha fazla ayrıntı için tartışma'ya bakın).

3. Tek moleküllü TIRF tahlil

  1. Kapak hazırlığı
    1. Stok tozunu 10 mg aliquots (1,5 mL tüplerde) metoksi-Peg-silane (mPEG) ve 10 mg aliquots biotin-Peg-silane (bPEG) olarak bölün. -20 °C'de kapalı, nemsiz bir kapta saklayın ve 6 ay içinde kullanın.
    2. Sekiz No. 1.5H (yüksek hassasiyetli) kalınlığında 22 mm kare kapak kapaklarını bir rafa yükleyin ve 2-5 mL 200 geçirmez etanol ve ardından 2-5 mL damıtılmış su ile yıkayın. Su ile biten bu yıkama adımını tekrarlayın. Daha sonra, kapakları bir hava hattı veya N2 kullanarak tamamen kurutun ve 3 dakika boyunca argon ile plazma temizliği.
    3. Temiz kapakları filtre kağıdına (90 mm) bir doku kültürü kabına (100 x 20 mm) yerleştirin ve aşağıdaki adımları gerçekleştirirken 70 °C fırında kuluçkaya yatırın.
      NOT: Plazma temizliği diğer kimyasal temizleme yöntemleri ile değiştirilebilir49.
    4. dH2O ile % 80 etanol çözeltisi hazırlayın ve pH'ı HCl kullanarak 2.0'a ayarlayın. 30 s'den fazla sürmemesi gereken çözünecek girdap.
    5. bPEG çözeltisinin 100 μL'sini alın ve %80 etanolden 900 μL ekleyin (pH 2.0). Bu çözüm 1 mg/mL bPEG'dir. Ardından, her iki PEG'i de iyice karıştırarak aşağıdaki gibi bir çözüm yapın.
      1. 200 μL 10 mg/mL mPEG (son konsantrasyon: 2 mg/mL).
      2. 1 mg/mL bPEG'nin 10 μL'si (son konsantrasyon: 10 μg/mL).
      3. %80 etanol (pH 2.0) çözeltisinin 790 μL'si.
    6. Kapakları fırından çıkar. PEG çözeltisinin 100 μL'lik kısmını her kapak kapağının ortasına dikkatlice dağıtarak sadece üst yüzeyin ıslak olmasını sağlayın. Ardından, kaymaları fırına geri yerleştirin ve 20 ila 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    7. Kapaklar, yüzeyde küçük daireler belirgin olan delikli bir görünüm almaya başladığında, onları fırından çıkarın.
    8. Her kapak kapağını% 100 etanol ile yıkayın, bir hava hattı ile kurulayın ve tekrar fırına yerleştirin. Yalnızca 2.
  2. Oda hazırlığı
    1. Odayı yaparken kullanmak için bir mikroskop kaydıranı temizleyin. Yaklaşık 2 cm uzunluğunda iki parça çift taraflı bant kesin.
    2. Mikroskop slaytının uzun kenarının ortasına bir parça yerleştirin. Bandın kenarının slaydın kenarıyla hizalı olduğundan emin olun. İkinci bant parçasını, ilk bant parçasının yaklaşık 2 mm altına yerleştirin, böylece ikisi paralel ve hizalanır.
    3. İşlevselleştirilmiş kapaklardan birini fırından alın (3.1'de oluşturulur). Kapak sapını, Şekil 1'degösterildiği gibi, PEG ile kaplanmış tarafın yüzü aşağı bakacak ve bantla doğrudan temas olacak şekilde bant üzerine dikkatlice yapıştırın. Pipet ucu kullanarak, kapak kapağının slayda düzgün yapıştığından emin olmak için slayt bandı arayüzüne hafifçe bastırın.
    4. Kaydırağın üzerinde asılı kalan fazla bandı jiletle kesin. Bu odalar hemen kullanılabilir veya çift yönlü olarak 50 mL'lik bir tüpe yerleştirilecek ve ileride kullanılmak üzere -80 °C dondurucuda saklanabilir. Hemen saklamak önemlidir, aksi veya yüzey bozulur.
  3. Miyosin 5a TIRF mikroskopisi testini gerçekleştirme
    1. Tablo 3'te açıklanan myosin 5a ters hareketlilik test için çözümleri hazırlayın ve buzda tutun.
    2. Hazneyi 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın.
    3. 1 mg/mL BSA'nın 10 μL'sinde 1 mM DTT ile 50 mM MB'de akış. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra 1 dakika bekleyin. Çözeltiyi kanaldan geçirmek için bir kağıt mendilin köşesini kullanın veya kağıdı filtreleyin.
    4. 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    5. NeutrAvidin çözeltisinin 10 μL'sinde 1 mM DTT ile 50 mM MB'de akış ve 1 dakika bekleyin.
    6. 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    7. 50 mM MB'de 1 mM DTT içeren 10 μL biyotinillenmiş rhodamin aktininde (bRh-Actin) akış ve 1 dakika bekleyin. Bu adım için, büyük sıkılmış bir pipet ucu kullanın ve uzun aktüer filamentlerin yüzeye (20-30 μm veya daha uzun) takılabilmesini sağlamak için floresan aktisin filamentlerinin makasını en aza indirmek için yukarı ve aşağı pipetlemekten kaçının. Etkili bir alternatif, standart bir pipet ucunun konisini kesmektir (≈1-1,5 mm açıklığı ile).
    8. 1 mM DTT ile 10 μL 50 mM MB ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    9. 10 nM miyosin 5a eklenmiş 30 μL Nihai Tamponda akış, ardından TIRF mikroskobuna hemen yükleyin ve TIRF görüntüleme yöntemi için optimum odağı bulduktan sonra kaydedin. 100-200 ms arasındaki pozlama süreleri, aksin ve GFP etiketli miyozin için 1,4 mW lazer gücünde uygundur. Hız analizi için uygun bir alım süresi 3 dakikadır.
  4. Nonmuscle miyosin 2b TIRF mikroskopisi testini gerçekleştirme
    NOT: Bu bölümde polimerize ve fosforilasyonlu filamentler kullanılarak yapılan nonmuscle miyozin 2b TIRF testinin detayları verilmiştir. Bir tüpteki nonmuscle miosin-2b'nin fosforilasyon ve polimerizasyonu için ayrıntılı protokol (bölüm 4.1-4.3) dahildir.
    1. Saflaştırılmış NM2b'yi fosforilasyon yapmak için, aşağıdaki koşullarla 10x kinaz karışımı yapın: 2 mM CaCl2, 1 μM CaM, 1-10 nM MLCK ve 0,1 mM ATP. Bu, 10 mM DTT ile 500 mM MB ile hacme getirilebilir. 10x kinaz karışımını miyosin için 1:10 hacimsel oranda ekleyin ve oda sıcaklığında 20-30 dakika kuluçkaya yatmasını sağlar. Tipik olarak, bu adım için miyozin konsantrasyonu 1 μM'dir.
    2. Fosforillenmiş miyozini filamentlere polimerize etmek için, NM2b'nin tuz konsantrasyonu 150 mM NaCl'ye düşürülür. Bunu yapmak için, 4x MB'yi dH 2 O'da dört kez seyrelterek tuzsuz 1x hareketlilik tamponu(1xMB) yapın. Bu 1x MB tuz konsantrasyonu düşürmek için kullanılabilir, çünkü NM2b 500 mM tuz tamponunda donduruldu.
    3. Her 3 μL stok NM2b için, tuz konsantrasyonunu 150 mM NaCl'ye düşürmek için 1x MB'lık 7 μL ekleyin ve NM2b filamentleri oluşturmak için 20-30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkalayın.
      NOT: NM2b fosforilasyonlu ve son tuz konsantrasyonu 150 mM olduğu sürece 4.1-4.3 bölümlerindeki sıra çok önemli değildir. 30 dk-1 saat sırasına göre inkübasyon, tam fosforilasyon ve polimerizasyon için yeterli zaman sağlar.
    4. Tablo 3'te açıklanan nonmuscle miozin 2b ters hareketlilik test için çözümleri hazırlayın ve buzda tutun.
    5. Hazneyi 150 mM MB'lık 10 μL ile 1 mM DTT ile yıkayın.
    6. 1 mg/mL BSA'nın 10 μL'sinde 1 mM DTT ile 150 mM MB'de akış Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra 1 dakika bekleyin. Çözeltiyi kanaldan geçirmek için bir kağıt mendilin köşesini kullanın veya kağıdı filtreleyin.
    7. 1 mM DTT ile 150 mM MB 10 μL ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    8. NeutrAvidin çözeltisinin 10 μL'sinde 1 mM DTT ile 150 mM MB'de akış ve 1 dakika bekleyin.
    9. 1 mM DTT ile 150 mM MB 10 μL ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    10. 10 μL bRh-Actin'de akış ve 1 dakika bekleyin. Bu adım için, büyük sıkılmış bir pipet ucu kullanın ve floresan aktisin filamentlerinin yamaçlarını en aza indirmek için, yüzeye uzun aktüer filamentlerin tutturulabilmesini sağlamak için yukarı ve aşağı borulamayı kaçının (20-30 μm veya daha uzun). Etkili bir alternatif, standart bir pipet ucunun konisini kesmektir.
    11. 1 mM DTT ile 150 mM MB 10 μL ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    12. Nonmuscle miyozin 2b çözeltisinin (yaklaşık 30 nM) 10 μL'sinde akış ve 1 dakika bekleyin.
    13. 1 mM DTT ile 150 MB 10 μL ile yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    14. 30 μL Son Tamponda akış, ardından TIRF mikroskobuna hemen yükleyin ve TIRF görüntüleme yöntemi için optimum odağı bulduktan sonra kaydedin. 100-200 ms arasındaki pozlama süreleri, aksin ve GFP etiketli miyozin için 1,4 mW lazer gücünde uygundur. Hız analizi için uygun bir alım süresi 3 dakikadır.

4. Görüntü analizi

  1. Süzülme eylemi filament tahlili için görüntü analizi
    NOT: Görüntüler, Malzeme Listesi'nde bağlı yazılım ve kılavuzlar kullanılarak analiz edilebilir. Burada açıklanan programın analiz için TIFF yığınları gerektirdiğini unutmayın. Kayma aktinin filament testini analiz etme süreci aşağıdaki gibidir50.
    1. Ham film yığınlarını belirli bir klasör yapısına yükleyin ve film klasörlerinin en üstteki dizinini programa girin.
      NOT: Program, bu dizin ve alt dizinlerdeki dosyaları analiz eder ve en alt düzey dizinleri çoğaltma olarak değerlendirir. Her çoğaltma grubu için ortalama istatistikler üretilir. Bu durumda, her miyozin için tek bir film kullanıldı. Yeni bir miyozini karakterize ederken veya yeni bir deneysel durumu araştırırken, toplam üç oda için oda başına üç görüş alanından (FOV) filmlerin analiz edilmesi ve araştırılan miozinin üç hazırlığı için bu iş akışının tekrarlanması önerilir.
    2. Her TIFF yığınını bir dizi tek tek TIFF dosyası ve her karenin başlangıç saatini içeren karşılık gelen meta veri.txt dosyasını içeren bir klasöre dönüştürmek için kullanıcı tarafından girilen kare hızıyla birlikte "stack2tifs" komut dosyasını kullanın. TIFF yığın biçiminde olmayan veriler için, dönüşüm önce Malzeme Tablosu'nda listelenenler gibi yazılımlar kullanılarak uygulanmalıdır.
      NOT: Bu komut dosyası yazılım paketinin bir parçasıdır. Komut dosyasının bilgilerine buradan ulaşabilirsiniz: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Edinme sırasında piksel boyutu (nm cinsinden) olan -px parametresini kullanın. Bu durumda, piksel boyutu 130 nm'dir. Saçılma çizimi çıkışları için eksenleri ölçeklendirme için -xmax ve -ymax parametrelerini kullanın. Bunlar en uzun çizilmiş filament uzunluğuna ve maksimum çizilen hıza (nm/s olarak) karşılık gelir.
      NOT: Bunlar tahmini değerlerdir ve verilerin çizimde yer almasından emin olmak için beklenenden daha yüksek değerlere ayarlanabilir. Analizden sonra, ham veriler görüntüleme ve analiz için diğer istatistiksel veya grafik yazılımlarında kullanılmak üzere de dışa aktarılabilir.
    4. Hareket etmeyen filamentleri tanımlamak için minimum hız kesme parametresi olan ve bu nedenle analizden dışlanabilen -minv parametresini kullanın. NM2b gibi yavaş bir miyozin için, gerçek kayma hareketlerini kesmeyi önlemek için bu parametrenin düşük olması gerekir (bu örnekte, 5 nm/s). M5a gibi hızlı bir miyozin için, bu parametre daha sıkı bir filtre uygulamak için daha yüksek olabilir (bu örnekte, 100 nm/s) ve gerçek kayma hızı dağılımını korur.
    5. Düzgün hareketi tanımlamak için -pt kesme parametresini kullanın. Her örnekleme penceresi için, 100 x Hız Standart Sapması/Ortalama hızına eşdeğer bir değer hesaplanır. Kesmeden daha yüksek değerlere sahip parçalar, daha fazla değişken hıza sahiptir ve daha fazla analizden hariç tutulur. Bu örnekte, 33 kesme değeri kullanılmıştır. Daha yüksek değerlere sahip parçalar daha değişken hızlara sahiptir ve daha fazla analizden çıkarılır.
    6. Çerçeveler arasında izin verilen maksimum bağlantı mesafesini ayarlamak için -maxd kullanın. Bu, filamentin merkezkoidi tarafından nm birimlerinde taşınan hesaplanan bir kareden kareye mesafedir. Sporadik hareketleri veya filamentler arasındaki yanlış bağlantıyı dışlamak için yararlı olabilir. Buradaki örneklerde, parametre varsayılan değer olan 2.000 nm'de bırakıldı.
  2. TIRF mikroskopisi tahlili için görüntü analizi
    NOT: Özellikle görüntüleme yazılımında listelenen tek moleküllü TIRF testini analiz etme işlemi, Malzeme Masası aşağıdaki gibidir29.
    1. Kaydedilen mikroskopi videosunu tıklatıp yazılımın çalışma alanına sürükleyerekaçın 51. Ardından, satın alma kanallarını bölün. Görüntü > Renk > Bölünmüş Kanallar 'atıklayın.
      NOT: Edinme sırasında kayda değer bir aşama kayması durumunda, görüntüleme düzleminde enstrümantal sürüklenmeyi düzeltmek için görüntüler stabilize edilmelidir. Bu durumda, bu verileri elde etmek için kullanılan mikroskop Z-odağını iyi stabilize ettiği için Z ekseni sürüklenmesi için herhangi bir telafi kullanılmamıştır. Görüntü analiz programındaki görüntüyü stabilize etmek için, Malzeme Listesi 'ne bağlı uygun sabitleyici eklentisini yükleyin. Görüntü sabitleyici, görüntüdeki nesneler için sabit konumlar varsayar ve başvuru olarak önceki karelerin yuvarlanan ortalamasını kullanır. Bu nedenle önerilen prosedür, etiketli akrin görüntülerini içeren kanalla başlamaktır, çünkü bu sabit bir konumdadır.
    2. Eklentiler'etıklayın, ardından Görüntü Sabitleyici'yibulun; Çeviri'nin seçili olduğundan emin olun ve varsayılan ayarları koruyun. Günlük Dönüştürme Katsayıları'nın yanındaki kutuyu işaretleyin. Bu Günlük adımının uygulanması, hesaplanan vardiya parametrelerinin bir sonraki adımda diğer kanala uygulanmasına izin verir. İşlemin tamamlanmasına izin ver.
    3. Ardından, miosin etiketli kanalı açın ve Eklentiler > Görüntü Sabitleyici Günlük Uygulaması'na tıklayarak stabilizasyonu uygulayın. Actin görüntüleri, tek bir kanalda daha yüksek oranlı görüntüleme gereksinimi nedeniyle aynı alım sırasında elde edilemezse, özellikle biyotin-PEG yüzeyine bağlı olmayan biyotinilasyonlu fidüktif işaretleyici veya floroforlar gibi statik nesneler içeren bir bölge seçerek görüntü yığınını stabilize edinir. Bu bölge özgün yığından kırpılabilir ve sabitlenebilir, ardından elde edilen kaydırma değerlerinin özgün yığına uygulanması.
      NOT: Pratikte, hareketlilik deneylerinde gözlenen sürüklenme, birkaç yüz nm / s hareket eden miyozinlerin hareketine göre ihmal edilebilir olacaktır, ancak en yavaş miyozinler için bu önemli bir husus haline gelir.
    4. Ardından TrackMate'i açın, Eklentiler'etıklayın; ardından, açılır menüsünde İzleme 'ye ve son olarak TrackMate'e tıklayın. Bu noktada görüntü analizi florofor parametrelerine ve tahlil koşullarına göre optimizasyona tabidir. Ancak, ideal başlangıç parametreleri aşağıdaki gibidir.
      1. Kalibrasyon ayarları: tüm varsayılan değerleri saklayın.
      2. Dedektör: LoG dedektörü.
      3. Tahmini blob çapı: 0.5-1.0 mikron.
      4. Eşik: 25-200. (Bu, algılanan noktaların filme uygun olup olmadığını görmek için bir sayı seçtikten sonra Önizleme'ye tıklayarak ve uygun şekilde ayarlanarak belirlenebilir.)
      5. İlk eşik: ayarlı değil.
      6. Görünüm: HyperStack Displayer.
      7. Noktalara filtreler ayarlayın: ayarlı değil.
      8. İzleyici: Basit LAP izleyici.
        NOT: Bunlar kare hızına ve miyozin hızına bağlıdır ve farklı parçacıklar arasındaki istenmeyen bağlantıları hariç tutarken sonraki konumları bağlayacak kadar büyük olmalıdır.
      9. Bağlantı maksimum mesafesi: 1.0 mikron.
      10. Boşluk kapatma maksimum mesafesi: 1.0 mikron.
      11. Boşluk kapatma maksimum çerçeve boşluğu: 1.
      12. Parçalarda filtreler ayarlayın: Parça Deplasmanı (>0,39-yalnızca 3 pikselden fazla hareket eden noktaları içerecek şekilde), Parçalardaki noktalar (>3-yalnızca en az 3 noktalı parçaları içerecek şekilde). Uzun süre duran noktaları dışlamak için Minimum Hız gibi diğer filtreler tanıtılabilir. Filtreleme sonuçları, actin ile ilişkili parçaları korurken sahte parçaların (yani, bir aktin izi boyunca olmayan arka plandaki miyozin hareketinin) kaldırıldığından emin olmak için parçaların görsel incelemesiyle kontrol edilmelidir.
    5. Ekran Seçenekleri ekranı açıldıktan sonra, ilgili çıktılar için Analiz'e tıklayın. Üretilen üç tabloyu kaydedin (İzleme İstatistikleri, İzleme İstatistiklerindeki Bağlantılar ve İzleme İstatistiklerindeki Noktalar). İzleme İstatistikleri tablosu, daha sonra yeni bir proteini veya belirli bir deneysel durumun etkilerini karakterize etmek için daha sonra analiz edilebilen hız ve yer değiştirme verilerini içerecektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miyozin saflaştırılması, Şekil 2'degösterildiği gibi sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid (SDS-PAGE) jel-elektroforezi azaltılarak değerlendirilebilir. Bu rakam son, çaprazlama sonrası miyozini temsil ederken, SDS-PAGE, süpernatanta kaybolan ürünleri tanımlamak için saflaştırma prosedürünün çeşitli aşamalarından aliquots üzerinde gerçekleştirilebilir. Myosin 5a HMM 120-130 kDa aralığında bir banda sahiptir ve tam uzunlukta nonmuscle myosin 2b, 29,44ağır zinc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan miyosin 5a ve nonmuscle miyosin 2b saflaştırma ve in vitro karakterizasyon için bir iş akışıdır. Bu deneyler kümesi, saflaştırılmış miyosin yapılarının mekanokimyasal özelliklerini hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek için yararlıdır. Burada gösterilen iki miyozin, birçok olasılıktan sadece iki özel örnek olmasına rağmen, koşullar ve teknikler, bazı terziliklerle, çoğu miyozinlere ve diğer birçok motor proteine uygulanabilir.

Burada tartışılan protokoller, laboratuvarın b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Fang Zhang'a bu verileri toplamak için kullanılan reaktiflerin hazırlanmasında teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NHLBI/NIH Intramural Araştırma Programı fonları HL001786 tarafından J.R.S.'ye desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Şırınga< / güçlü>BD309628
2< / güçlü> M CaCl < sub>2 < / alt>ÇözeltiVWR10128-558
< güçlü>2 M MgCl< / güçlü >< sub>2 < / sub>SolutionVWR10128-298
27 Ölçer İğne< / güçlü >Becton Dickinson309623
5 M NaCl Çözeltisi< / güçlü >KD TıbbiRGE-3270
< güçlü > Asetik Asit < / güçlü >ThermoFisher Scientific984303
< güçlü > Amil Asetat< / güçlü >Ladd Araştırma Endüstrileri10825 <
güçlü > Anti-FLAG M2 Afinite Jeli< / güçlü >Millipore SigmaA2220
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdfATPMillipore SigmaA7699
biyotinillenmiş G-Aktin>Hücre İskeleti, Inc.AB07
Sığır Serum Albümini< / güçlü >Millipore Sigma5470
< güçlü >bPEG-silan < / güçlü >Laysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
< güçlü > Bradford Reaktif Konsantresi< / güçlü >Bio-Rad5000006
< güçlü > Calmodulin< / güçlü >PMID: 2985564
SFM'de Katalaz< / güçlü >Millipore SigmaC40
<> Hücre Hattı (Sf9) < / güçlü >ThermoFisher Scientific11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
< güçlü > Dairesel Filtre Kağıdı - Kayma Testi< / güçlü>Millipore SigmaWHA1001125
Dairesel Filtre Kağıdı - Ters TahlilMillipore SigmaWHA1001090
cEksiksiz, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitör TabletleriMillipore Sigma5056489001Bu, 4 ° C'de saklanmalıdır. Tabletler doğrudan kullanılabilir veya 1 tabletin 2 mL damıtılmış suda çözülmesiyle 25x stok çözeltisi olarak yeniden oluşturulabilir. Elde edilen çözelti 4 ° C'de saklanabilir; 1-2 hafta C veya en az 12 hafta -20 ° C'de.
Konsantre Tüpler (100.000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024MWCO, saflaştırılan proteinin toplam moleküler ağırlığından daha az olduğu sürece, tüpün MWCO'su mutlaka "herkese uyan tek bir boyut" değildir. Buradaki NM2b, 100.000 MWCO'luk bir tüp ile konsantre edildi ve M5a, 30.000 MWCO'luk bir tüp ile konsantre edildi.
Coomassie Brilliant Blue R-250 BoyaThermoFisher Scientific20278
Lamel RafıMillipore SigmaZ688568-1EA
güçlü>Lameller: Kayan Etkili Filament DeneyiVWR Uluslararası48366-227
Lameller: Ters Motilite Testi Azer ScientificES0107052
Diyaliz Tüpü (3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5ADiyaliz tüpünün çapı değişebilir, ancak MWCO aynı olmalıdır. Burada kullanılan NM2b, 18 mm'lik bir diyaliz tüpünde diyalize alındı. Tüpler 4 ° C'de% 20 alkol çözeltisi içinde saklanabilir.
DL-Dithiothreitol< / güçlü >Millipore SigmaD0632
< güçlü > Çift Taraflı Bant< / güçlü >Ofis Deposu909955
< güçlü > DYKDDDDK Peptit< / güçlü >GenScriptRP10586Bu, 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN < sub><3 / sub> ve 10 mM MOPS (pH 7.2) içeren bir tampon içinde 50 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözülebilir. Bu -20 ° C'de saklanabilir; C olarak 300 ve mikro; L aliquots. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Elution ColumnBio-Rad761-1550Bunlar tekrar kullanılabilir. Temizlemek için sütunu 2-3 sütun hacmi PBS ve damıtılmış su ile durulayın. Sütunu 4 ° C'de soğutun; Kullanmadan önce C.
< güçlü > Etanol< / güçlü >Fischer ScientificA4094
< güçlü > G-aktin < / güçlü >PMID: 4254541G-aktin stoğu 200 & mu'da saklanabilir; Sıvı N < alt > 2 < / alt > içinde M.
Glikoz< / güçlü >Millipore SigmaG8270
Glukoz Oksidaz< / güçlü >Millipore SigmaG2133
< güçlü > Glisin Tampon Çözeltisi, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L < / güçlü >Santa Cruz Biyoteknolojisc-295018
< güçlü >HaloTag< / güçlü >PromegaG100A
HCl< / güçlü >Millipore Sigma320331
KCl< / güçlü >Fischer ScientificP217-500
< güçlü > Büyük Orifis Pipet Uçları < / güçlü >Fischer Scientific02-707-134
< güçlü > Leupeptin Proteaz İnhibitörü< / güçlü >ThermoFisher Scientific78435
Mark12 Lekesiz Standart Merdiven< / güçlü >ThermoFisher ScientificLC5677
< güçlü > Metanol< / güçlü >Millipore SigmaMX0482
< güçlü > Metilselüloz < / güçlü >Millipore SigmaM0512
< güçlü > Mikroskop Slaytları< / güçlü >Fischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Miyozin Hafif Zincir Kinaz PMID: 23148220FLAG etiketli MLCK, FLAG etiketli miyozinin burada saflaştırıldığı şekilde saflaştırılabilir.
NaN < sub>3< / sub>< / güçlü >Millipore SigmaS8032
< güçlü > NeutrAvidin< / güçlü >ThermoFisher Scientific31050
< güçlü > Nitroselüloz < / güçlü >Ladd Araştırma Endüstrileri10800
< güçlü >NuPAGE % 4 ila 12 Bis-Tris Mini Protein Jel, 15 kuyulu < / güçlü >ThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Fosfat Tamponlu Salin, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF, izopropanol içinde 0.1 M'lik bir stok çözeltisi olarak yapılabilir ve 4 ° C'de saklanabilir. İzopropanol ilavesi, oda sıcaklığında karıştırılarak çözülebilen kristal çökelmesine neden olur. Kullanımdan hemen önce, PMSF, 0.1 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar hızla karıştırılan bir çözeltiye damla damla eklenebilir.
Tıraş Bıçakları< / güçlü >Ofis Deposu397492
Rhodamine-Phalloidin< / güçlü >ThermoFisherScientific R415Stok% 100 metanol içinde 200 &m; M'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltilebilir.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027Bu, 4 ° C'de saklanmalıdır. Raf ömrü üretim tarihinden itibaren 18 aydır.
Doku Kültürü Kabı - Kayma TestiCorning353025Her doku kültürü kabı yaklaşık dokuz lamel tutabilir.
<>Doku Kültürü Kabı - Ters TahlilCorning353003Her doku kültürü kabı yaklaşık dört lamel tutabilir.
< Güçlü> Pürüzsüz kenarlı 200 ve mikro; L Pipet UçlarıThomas Scientific1158U38
EKİPMANLAR
SantrifüjThermoFisher Scientific75006590
mikroskopNikonModel: 100x TIRF Objektifli H-TIRF sistemli Eclipse Ti (NA 1.49)
Mikroskop Kamera< / güçlü>AndorModel: iXon DU888 EMCCD kamera (1024 x 1024 sensör formatı)
Mikroskop Çevre Kontrol Kutusu< / güçlü >Tokai HITÖzel Thermobox
< güçlü > Mikroskop Lazer Ünitesi< güçlü >405nm, 488nm, 561nm ve 640nm
için katı hal lazerli LU-n4 dört lazer ünitesiOrta Tezgah Santrifüjü< / güçlü>ThermoFisher BilimselModel: CR3i
Misonix Sonicator< / güçlü>MisonixXL2020
Optima Max-Xp Masaüstü Ultrasantrifüj< / güçlü>Beckman Coulter393315
Plazma TemizleyiciDiener electronic GmbH + Co. KGSistemi Türü: Zepto
< güçlü > Sonikatör Probu (3.2 mm) < / güçlü >Qsonica4418
< güçlü > Standart İnkübatör< / güçlü >BağlayıcıModel: 56
< güçlü > Waverly Tüp Mikser < / güçlü >WaverlyTR6E
< güçlü > YAZILIM < / güçlü >
< güçlü> ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Sürüm 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST, Mac OSX ve Linux tabanlı sistemler için kullanılabilir.
Görüntü Sabitleyici Eklentisihttps://imagej.net/Image_Stabilizer<
strong>ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
Imaging Software>NIS Elements (AR paketi)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
SF-900 II < File:TrackMate-manual.pdf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032(2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903(2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936(2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554(2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myosin Motility AssaysFluorescence MicroscopyGliding Actin FilamentInverted Motility AssayNonmuscle Myosin 2bMyosin 5a PurificationActin Filament TrackingSingle Molecule DynamicsTotal Internal ReflectionAffinity Chromatography

Related Articles