Bu protokol, kemoterapötik tedaviden sonra alternatif birleştirme regülasyonunda karakteristik olmayan işleve sahip bir proteinin rolünü değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir araç sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma
Bu makalede
Özet
Özet
mRNA işleme, mRNA'yı çeviriye hazırlamak için 5'kapaklama, çoklu A ekleme ve birleştirme gibi birden fazla eşzamanlı adım içerir. Konsültasyonel birleştirmenin yanı sıra, alternatif mRNA birleştirme, bir genden çok fonksiyonlu proteinlerin ifadesini sağlar. Interactome çalışmaları genellikle yeni veya bilinmeyen proteinler için ilk analiz olduğundan, yem proteininin birleştirme faktörleriyle ilişkilendirmesi, mRNA birleştirme sürecine katılabileceğinin bir göstergesidir, ancak hangi bağlamda veya hangi genlerin düzenlendiğini belirlemek ampirik bir süreçtir. Bu işlevi değerlendirmek için iyi bir başlangıç noktası klasik minigene aracını kullanmaktır. Burada, farklı hücresel stres uyaranları sonrası alternatif birleştirme değişikliklerini değerlendirmek için adenoviral E1A minigene kullanımını sunuyoruz. Farklı stres tedavilerinden sonra NEK4 proteinini bıçaklayarak HEK293'te E1A minigene'nin birlenmesini değerlendirdik. Protokol, E1A minigene transfection, hücre tedavisi, RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezini, ardından PCR ve jel analizini ve E1A ekli varyantların nicelleştirilmesini içerir. Bu basit ve köklü yöntemin belirli tedavilerle birlikte kullanılması, hücresel süreçlere veya mRNA birleştirme ile hangi genlerin düzenlenebileceğine ışık tutmak için güvenilir bir başlangıç noktasıdır.
Giriş
Birleştirme, 5'mRNA kapaklama ve 3'mRNA poliadenilasyonuna aynı anda meydana gelen ökaryotik mRNA işlemede en önemli adımlar arasındadır, intron kaldırma ve ardından exon kavşağı. Birleştirme alanlarının (SS) spliceosome tarafından tanınması, küçük ribonükleoproteinler (snRNP U1, U2, U4 ve U6), küçük RNA'lar (snRNA'lar) ve birkaç düzenleyici protein1 içeren bir ribonükleoprotein kompleksi, birleştirme için gereklidir.
Ökaryotlarda intron kaldırmanın (konsitutive birleştirme) yanı sıra, intronlar tutulabilir ve eksonlar dışlanabilir, mRNA alternatif birleştirme (AS) adı verilen işlemi yapılandırabilir. Alternatif pre-....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kaplama hücreleri
NOT: Bu açıklanan protokolde, daha önce Nek4'ün kararlı indüklensiz ekspresyörü için oluşturulan HEK293 kararlı hücre hatları21kullanıldı, ancak aynı protokol HEK293 22 , HeLa23 , 24 ,25,26,U-2 OS27,COS728, SH-SY5Y29gibi diğer birçok hücre hattı için uygundur. Bazal koşullar altında minigene E1A izoformlarının ekspresyon modeli bu hücreler arasında değişir ve her durum için kar....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kemoterapi sergisinden sonra hücrelerde birleştirme profilindeki değişiklikleri değerlendirmek için E1A minigene kullanılarak 5' splice sites tahlil yapıldı. Paclitaxel veya cisplatin tedavisinden sonra HEK293 stabil hücrelerinde AS regülasyonunda Nek4 - isoform 1'in rolü değerlendirildi.
Adenoviral E1A bölgesi, farklı splice donörlerinin kullanımı nedeniyle bir RNA öncüsünden üç ana mRNA'nın üretiminden sorumludur. Ortak 5' ve .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Minigenes, küresel alternatif birleştirme in vivo etkilerini belirlemek için önemli araçlardır. Adenoviral minigene E1A,13,14hücredeki bunların miktarını artırarak proteinlerin rolünü değerlendirmek için on yıllardır başarıyla kullanılmaktadır. Burada, kemoterapötik maruziyet sonrası alternatif birleştirmeyi değerlendirmek için minigene E1A kullanımını öneriyoruz. Nek4 isoform 1'i ifade eden kararlı bir hücre hattı kullanıldı ve geçici transeksiyonun neden olduğu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo'ya (FAPESP, Grant Temático 2017/03489-1'den JK'ya ve FLB 2018/05350-3)'e burs ve bu araştırmayı finanse etmek için Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) aracılığıyla. PMTE1A plazmid ve Zerler ve meslektaşlarına E1A klonlama çalışmalarından dolayı teşekkür ederiz. Ayrıca Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti ve Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller'e laboratuvar alan ve ekipmanlarını kullanmamızı sağlayan teşekkür ediyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100 pb DNA Merdiven | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 kuyu plakası | Sarstedt | 833920 | |
| Agaroz | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC su | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP karışımı | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Sığır Serumu - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Floresan Mikroskobu | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Jel görüntüleme toplama sistemi - ChemiDoc Jel Imagin Sistemi | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 kararlı hücreler - HEK293 Flp-In | Flp-In &trade'den üretilen; T-REx ve ticaret; 293 - İnvitrojen ve ref 21'de açıklanmıştır | ||
| Higromisin B | ThermoFisher | 10687010 | Flp-In hücrelerinin bakımı için kullanılır |
| Görüntü işleme ve analiz yazılımı - FIJI yazılımı | ref. 32 | ||
| Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi - jetOPTIMUS Polyplus Reaktif | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plaka Okuyucu / UV absorbans | Biotech | Epoch Biotek / Take3 adaptörü | |
| pMTE1A plazmidi | Dr. Adrian Krainer tarafından sağlanmıştır | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R Canlandırıcı | 5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3' | ||
| Soğutmalı santrifüj | Eppendorf | F5810R | |
| Ters Transkriptaz - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Ters transkriptaz - Üst simge IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitörü RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA ekstraksiyonu fenol-kloroform bazlı reaktif - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA jel lekesi | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq | Platinum | Thermo 10966026 | |
| Tetrasiklin | Sigma | T3383 | Bayrak boş veya Nek4 için kullanılır - Bayrak ifadesi indüksiyon |
| Thermocycler Bio-Rad Bio-Rad | T100 | ||
| Tripsin | Sigma | T4799 |
Kaynaklar
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
