Method Article

Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi

DOI:

10.3791/62207

⸱

April 12th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine, Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, canlı pankreas doku dilimlerinin adacık fizyolojisi ve adacık-immün hücre etkileşimlerinin incelenmesine uygulanmasını sunun.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı pankreas doku dilimleri, adacık fizyolojisinin incelenmesine ve bozulmamış bir adacık mikroçevresi bağlamında işleve izin verir. Dilimler agarose içine gömülü canlı insan ve fare pankreas dokusundan hazırlanır ve vibratom kullanılarak kesilir. Bu yöntem, dokunun tip 1 (T1D) ve tip 2 diyabet (T2D) gibi altta kalan patolojileri korumanın yanı sıra canlılığını ve işlevini korumasını sağlar. Dilim yöntemi, pankreasın endokrin ve ekzokrin dokularını oluşturan karmaşık yapıların ve çeşitli hücreler arası etkileşimlerin sürdürülmesi yoluyla pankreasın incelenmesinde yeni yönler sağlar. Bu protokol, adacık fizyolojisi değerlendirmeleri ile birlikte pankreas dilimleri içindeki canlı endojen bağışıklık hücrelerinin lekeleme ve zaman atlamalı mikroskopisinin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektedir. Ayrıca, bu yaklaşım, ana histocompatibility complex-multimer reaktifler kullanılarak adacık hücresi antijenlerine özgü immün hücre popülasyonlarını ayırt etmek için rafine edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreasın tutulumu pankreatit, T1D ve T2D1,2,3 gibi hastalıklara patognomoniktir. İzole adacıklardaki fonksiyon çalışması genellikle adacıkların çevrelerinden uzaklaştırılmasını içerir4. Canlı pankreas dokusu dilim yöntemi, sağlam adacık mikroçevrelerini korurken ve stresli adacık izolasyon prosedürlerinin kullanımından kaçınırken pankreas dokusunun incelenmesine olanak sağlamak için geliştirilmiştir5,6,7. İnsan donör dokusundan alınan pankreas dokusu dilimle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTLAR: Fare kullanan tüm deneysel protokoller Florida Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (201808642) tarafından onaylandı. Her iki cinsiyetten doku donörlerinden insan pankreas bölümleri, Florida Üniversitesi Diyabetli Pankreas Organ Donörleri Ağı (nPOD) doku bankası aracılığıyla elde edildi. İnsan pankreatası, organ bağışı yasa ve yönetmeliklerine uygun olarak nPOD ile ortaklık yapan sertifikalı organ tedarik kuruluşları tarafından kadavra organ bağışçılarından hasat edilmiş ve Florida Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) (IRB no. 392-2008) tarafından "İnsan Olmayan Konular" olarak sınıflandırılarak rıza ihtiyacından feragat edilmiştir. Bu proje i....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol hem işlevsellik çalışmalarına hem de immün hücre kayıtlarına uygun canlı pankreas doku dilimleri sağlayacaktır. Hem parlak alanda hem de yansıyan ışığın altındaki dilim görünümü Şekil 1A,B'de gösterilmiştir. Tartışıldığı gibi, adacıklar, insülin içeriği nedeniyle ortaya çıkan artan tanecikleri nedeniyle yansıyan ışığı kullanarak dilimler halinde bulunabilir (Şekil 1C) ve yansıyan ışık kullanıldığında arka plan dokusuna göre açıkça gö.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, pankreas dilimlerinin neslini ve dilimleri fonksiyonel ve immünolojik çalışmalarda çalıştırmak için gereken prosedürleri ortadan çıkarmaktır. Canlı pankreas dilimleri kullanmanın birçok faydası vardır. Bununla birlikte, açıklanan deney protokolleri sırasında dokunun canlı ve yararlı kalması için gerekli olan birkaç kritik adım vardır. Hızlı çalışmak zorunludur. Doku canlılığını korumak için pankreasın enjekte edilmesi ile vibratom üzerindeki dilimlerin üretilmesi arasındaki süre en aza indirilmelidir.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH hibe R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 ve P01 AI042288 hibeleri tarafından finanse edildi. Bu araştırma Diyabetli Pankreas Organ bağışçıları Ağı (nPOD; RRID:SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) ve Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053) sponsorluğunda ortak tip 1 diyabet araştırma projesidir. İfade edilen içerik ve görüşler yazarların sorumluluğundadır ve nPOD'un resmi görünümünü yansıtmak zorunda değildir. Araştırma kaynakları sağlamak için nPOD ile ortaklık sağlayan Organ Tedarik Kuruluşları (OPO) http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/'de listelenmiştir. Florida Üniversitesi'nden D....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#3 Stil Neşter SaplıFisherbrand12-000-163
1 M HEPESFisher ScientificBP299-100HEPES Tamponu, 1M
Çözelti 10 cm İşlenmemiş Kültür KabıCorning430591
10 mL Luer-Lok ŞırıngaBD301029Luer-Lok Uçlu BD Şırınga
27 G İğneBDBD 305109BD Genel Kullanım ve PrecisionGlide Hipodermik İğneler
35 mm kapaklı cam tabanlı Petri kabıIbidi81156µ-Dish 35 mm, yüksek
50 mL şırıngaBD309653
8 kuyulu odacıklı kapak camıIbidi80826µ-Slide 8 Kuyulu
APC anti-fare CD8a antikoruBiolegend100712
BSAFisher Bilimsel199898
Kalsiyum klorürSigmaC5670CaCl2
Kalsiyum klorür dihidratSigmaC7902CaCl2 (dihidrat)
Kompakt Dijital RockerThermo Fisher Scientific88880020
Konfokal lazer tarama mikroskobuLeicaSP8İğne deliği = 1.5-2 havadar birim; 512&thinsp'de 10x/0.40 sayısal açıklık HC PL APO CS2 kuru ve 20x/0.75 sayısal açıklık HC PL APO CS2 kuru objektif ile elde edilir; &zamanlar; &ince; 512 piksel çözünürlük
D-(+)-GlikozSigmaG7021C6H12O6
>ddiH2O
DitizonSigma-AldrichD5130-10G
DMSOInvitrogenD12345Dimetil sülfoksit
EtanolDecon Laboratuvarları2805
Falcon 35 mm doku kültürü kabıCorning353001Falcon Kolay Tutuşlu Doku Kültürü Yemekleri
FBSGibco10082147
Feather No. 10 Cerrahi Bıçak ElektronMikroskobu Bilimleri7204410
fluo-4-InvitrogenF14201hücre geçirgen Ca2+ göstergesi
Jel Kontrolü Süper YapıştırıcıLoctite45198
Graefe ForsepsGüzel Bilim Araçları11049-10
Sertleştirilmiş İnce MakasGüzel Bilim Araçları14090-09
HBSSGibco14025092Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi
HEPESSigmaH4034C8< / sub>H18< sub>N2< / sub>O4< / sub>S
Buz kovasıFisherbrand03-395-150
IsofluranPatterson VeterinerNDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog KelepçeRoboz Cerrahi MağazaRS-7440ve nbsp; Düz; 500-900 gram basınç; 1.5" Uzunluk
Kimwipes Kimberly-Clark Professional34705Kimtech Bilim ve Ticaret; Kimmendil ve ticaret; Hassas Görev Silecekleri, 2 Katlı
CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite KitiInvitrogenL3224Bu kit, kalsein-canlı hücre boyası içerir.
Düşük glikozlu DMEMCorning10-014-CV
Magnezyum klorür hekzahidratSigmaM9272MgCl2 (heksahidrat)
Magnezyum sülfat heptahidratSigmaM2773MgSO4 (heptahidrat)
Manyetik Isıtmalı PlatformWarner InstrumentsPM-1Dinamik stimülasyon için görüntüleme odası platformu kayıtlar
Mikrodalga GEJES1460DSWW
Nalgene Şırınga FiltresiThermo Fisher Scientific726-2520
No.4 Boya FırçasıMichaels10269140
Açık Elmas Banyosu Görüntüleme OdasıWarner InstrumentsRC-26Dinamik stimülasyon kayıtları için görüntüleme odası
Oregon Green 488 BAPTA-1-InvitrogenO6807hücre geçirgen Ca2+ göstergesi
Gece görüntüleme odasıOkolabH201-LG
PBSThermo Fisher Scientific20012050Dilim üretimi için agaroz yapmak için
PE etiketli insülin tetramerEmory Tetramer Araştırma Çekirdekdizisi YAIENYLEL
Penisilin StreptomisinGibco15140122
Potasyum klorürSigmaP5405KCl
Potasyum fosfat monobazikSigmaP5655KH2< / sub>PO < sub>4< / sub>
Vibratom için Jiletli Bıçaklar ElektronMikroskobu Bilimleri71998; Çift Kenarlı Paslanmaz Çelik, kaplamasız
RPMI 1640Gibco11875093
SeaPlaque düşük erime noktalı agarozLonza50101Dilim üretimi için agaroz yapmak için
Dilim çapaWarner Instruments64-1421
Dilim çapa (dinamik görüntüleme)Warner Instruments640253Dinamik görüntüleme odası
için dilim ankrajSodyum bikarbonatSigmaS5761NaHCO3< / sub>
Sodyum klorürSigmaS5886NaCl
Sodyum fosfat monohidratSigmaS9638NaH < sub > 2 < / sub > PO < sub < / sub>> (monohidrat)
Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörüSigmaT6522-1GGlycine max'tan (soya fasulyesi)
Aşama AdaptörWarner InstrumentsSA-20MW-ALMikroskop sahnesinde dinamik stimülasyon kayıtları için görüntüleme odasına sığdırmak için
Sahne üstü inkübatörOkolabH201
StereoskopLeicaIC90 E MSV266
SYTOX Mavi Ölü Hücre LekesiInvitrogenS34857mavi-floresan nükleik asit lekesi
Transfer PipetiFalcon357575Şahin ve ticaret; Plastik Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri
Valf Kontrol Sistemistimülasyon kayıtları içinWarner InstrumentsVCS-8
Vibratom VT1000 SLeicaVT1000 S
Su banyosuFisher ScientificFSGPD02Fisherbrand Isotemp Genel Amaçlı Deluxe Su Banyosu GPD 02
Dinamik Sistemi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
  2. Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
  3. Taylor, R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pancreatic Tissue SlicesIslet FunctionIslet Immune InteractionsConfocal MicroscopyTime Lapse MicroscopyImmune Cell StainingVibratome SlicingType 1 DiabetesInsulin Tetramer StainingCD8 Antibody Detection

Related Articles