Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

Özet

Burada sunulan PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini korumak için bir protokoldür, bu da pulmoner vaskülat ve hava yolunun sofistike bir üç boyutlu görüntüsü ile sonuçlanır, bu da çok sayıda prosedüre duyarlı 10 güne kadar korunabilir.

Özet

Murine akciğer dokusunun görselleştirilmesi, alttaki hava yolu ve vaskülat ile ilgili değerli yapısal ve hücresel bilgiler sağlar. Bununla birlikte, fizyolojik koşulları gerçekten temsil eden pulmoner damarların korunması hala zorluklar ortaya koyuyor. Ek olarak, murine akciğerlerinin hassas konfigürasyonu, hem hücresel kompozisyonu hem de mimariyi koruyan yüksek kaliteli görüntüler için numuneler hazırlamakta teknik zorluklarla sonuçlanır. Benzer şekilde, hücresel kontritite tahlilleri, hücrelerin vazokonstriktörlere in vitroyanıt verme potansiyelini incelemek için yapılabilir, ancak bu tahliller sağlam akciğerin karmaşık ortamını yeniden üretmez. Bu teknik konuların aksine hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS) yöntemi, akciğer dokusunu bölgesel önyargı olmadan üç boyutlu olarak görselleştirmek için etkili bir alternatif olarak uygulanabilir ve 10 güne kadar canlı vekil kontritite modeli olarak hizmet vermektedir. PCLS kullanılarak hazırlanan doku, yapıyı ve mekansal yönelimi korumuştur, bu da hastalık süreçlerinin eks vivoincelenmesini ideal hale getirir. Endojen tdTomato etiketli hücrelerin, indüklenebilir bir tdTomato muhabir murine modelinden elde edilen PCLS'deki konumu konfokal mikroskopi ile başarıyla görselleştirilebilir. Vazokonstriktörlere maruz kalındıktan sonra PCLS, hem damar kontrititesinin hem de zaman atlamalı bir modül tarafından yakalanabilen akciğer yapısının korunmasını gösterir. Batı blot ve RNA analizi gibi diğer prosedürlerle birlikte PCLS, çok çeşitli bozuklukların altında yatan ve pulmoner vasküler hastalıklarda patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına yol açan sinyal basamaklarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Giriş

Anatomik yapıdan ödün vermeden hücresel bileşenleri koruyan akciğer dokusunun hazırlanması ve görüntülenmesinde meydana gelen gelişmeler pulmoner hastalıkların ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Fizyolojik yapıyı korurken proteinleri, RNA'yı ve diğer biyolojik bileşikleri tanımlama yeteneği, çok sayıda pulmoner hastalıkta patofizyolojinin anlaşılmasını genişletebilecek hücrelerin mekansal düzeni hakkında hayati bilgiler sunar. Bu ayrıntılı görüntüler, hayvan modellerine uygulandığında pulmoner arter hipertansiyonu gibi pulmoner vasküler hastalıkların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir ve potansiyel olarak iyileştirilmiş terapötik stratejilere yol açabilir.

Protokol

Tüm hayvan bakımı Boston Çocuk Hastanesi'nin yönergelerine uygundu ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokoller. Bu çalışmada kullanılan fareler vahşi tip C57 /B6 fareler ve Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato çapraz farelerdir.

1. Çözümlerin hazırlanması

1. Deney sırasında gerekli olan fosfat tampon çözeltisini (1x PBS) ve% 2 agarose çözeltisini önceden hazırlayın.
   1. 2 g agarose tozunun 100 mL otomatik kapatılmış suya karıştırılması. Çözelti net olana kadar mikrodalga fırında birkaç saniye ısıtın.
   2. Çözeltiyi kullanıma kadar 42 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.
      NOT: Hem PBS hem de %2 agarose haftalar....

Sonuçlar

Hücrelere veya dokuya eklendiğinde, canlılık reaktifi, canlı dokunun azaltıcı ortamı tarafından değiştirilir ve pembe / kırmızıya döner ve yüksek floresan haline gelir. 0-1 ve 9-10. günden itibaren tespit edilen temsili renk değişiklikleri Şekil 3'tegösterilmiştir. Belirtildiği gibi, çözüm maviye başladı ve bir gecede pembeye döndü ve canlılık gösterdi. Renk değişimi genellikle 1-4 saat içinde gerçekleşir; ancak, daha uzun bir süre gerekebilir. Canlılığı test etmek için, vibratomla hazırlanm.......

Tartışma

Bu yazıda, özellikle vasküler yapının korunmuş kontrititesi ile üç boyutlu olarak görülebilen akciğer dokusunun mikrosliklerini elde etmek için PCLS uygulaması kullanılarak, vasküler yapıyı koruyan ve deneysel esnekliği optimize eden yüksek çözünürlüklü murine akciğer dokusu görüntüleri üretmek için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmıştır. Uygulanabilirlik reaktifini kullanarak, protokol özenle hazırlanmış ve korunmuş dilimlerin bir haftadan fazla yaşayabilirliği koruyabileceğini göstermektedir. Mikrosliklerin korunmuş ca.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Şırıngada 0.5cc fraksiyone heparin	BD		başına 100 USP birimi
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inç ölçer trakea kanülasyonu için künt uçlu iğne	Cml Kaynağı	90120050D
30cc şırınga	BD	309650
Anti Anti çözelti	Gibco	15240096
Otomatik titreşimli bıçak mikrotomu	Leica	VT1200S
Hücre Canlılığı Reaktifi (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Konfokal	Zeiss	880
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium ve GLutaMAX, %10 FBS, %1 Pen/Strep ile desteklenmiş	Gibco	10569-010
Endotelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Havan ve Havan Tokmağı	Amazon
RIPA lizis ve ekstraksiyon tamponu	Thermoscientific	89900
Cerrahi sütür 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reaktif	İnvitrojen, Thermofisher	15596026
UltraPure Düşük Erime Noktalı Agaroz	İnvitrojen	16520050
Vibratom	Leica Biosystems	VT1200 S
Kanatlı kan alma seti (Kelebek iğnesi) 25-30G	BD	25-30G

mL