Yöntem makalesi

Hücrelerde Protein Arginin Metiltransfenaz 1-9 Aktivitesini Incelemek için Nicel Yöntemler

DOI:

10.3791/62418

⸱

7 Ağustos 2021

 ,  , 
1Structural Genomics Consortium, University of Toronto, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoller, protein arginin metiltransfenaz (PRMT) ailesinin bireysel üyelerinin hücrelerdeki enzymatic aktivitesini değerlendirmek için kullanılan metodolojiyi sağlar. Prmt aktivitesinin endojen ve eksojen biyobelirteçler kullanılarak değerlendirilmesi, metil-arginin tanıma antikorları ve inhibitör takım bileşikleri ile ilgili ayrıntılı yönergeler açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein metiltransfenazlar (PRMTs), bir metil grubunun substrat proteinlerinin arginin kalıntılarına transferini kataliz eder. PRMT ailesi, arginin kalıntılarını monometrik veya simetrik/asimetrik olarak dimetillat arginin kalıntılarına sahip dokuz üyeden oluşur. Çeşitli proteinlerin farklı arginin metilasyonlarını tanıyan çeşitli antikorlar mevcuttur; böylece, PRMT aktivite biyobelirteç tahlillerinin geliştirilmesi için araçlar sağlamak. PRMT antikor bazlı tahliller, üst üste binen substratlar ve motif bazlı antikor özellikleri nedeniyle zorludur. Bu konular ve bireysel PRMT'lerin katkıda bulunduğu arginin metilasyonunu araştırmak için deneysel kurulum tartışılmaktadır. Dokuz PRMT'den sekizi için biyobelirteç olan temsili substratların dikkatli seçimi ile prmt aktivite testlerinden oluşan bir panel tasarlanmıştır. Burada, PRMT ailesinin bireysel üyelerinin hücrelerdeki enzimatik aktivitesini nicel olarak ölçen hücresel tahlil protokolleri bildirilmiştir. Açıklanan yöntemlerin avantajı, hücre kültürü ve floresan batı leke yeteneklerine sahip herhangi bir laboratuvardaki basit performanslarıdır. Substrat özgüllüğü ve seçilen antikor güvenilirliği, devirme ve aşırı ifade yaklaşımları ile tamamen doğrulandı. Tahlil biyobelirteçleri ve antikorların ayrıntılı yönergelerine ek olarak, PRMT'ler için bir inhibitör takım bileşiği toplanmasının kullanımı hakkında da bilgi sağlanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arginin metilasyonu, protein-protein ve protein-RNA etkileşimlerini düzenleyen önemli bir çeviri sonrası modifikasyondur, bu nedenle mRNA öncesi birleştirme, DNA hasarı, transkripsiyon yanıtı ve büyüme faktörü aracılı transdüksiyon1,2gibi çeşitli hücresel süreçlerde önemli bir rol oynar. Arginin protein arginin metiltransfenazlar (PRMTs) ile metillendirilir ve monometil arginin (Rme1), asimetrik dimetirlerjinin (Rme2a) veya simetrik dimetirlerjinin (Rme2s)3. Metilasyon türüne göre PRMT'ler üç gruba ayrılır: Tip I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 ve 8), mono ve asimetrik dimetilasyonu katalze eden; Mono ve simetrik dimetilasyonu katalİze eden Tip II (PRMT5 ve PRMT9); ve Tip III (PRMT7), sadece monometrin arginin3.

Piyasada bulunan arginin metilasyona özgü antikorların sayısının artması nedeniyle PRMT aktivitesi batı şişkinliği kullanılarak ölçülebilir. Floresan bazlı batı blot, daha fazla dinamik aralık ve doğrusallık, daha yüksek hassasiyet ve çoklama4'eizin vermesi nedeniyle kemimuminesan algılama yerine tercih edilen tekniktir. Protein metilasyon seviyelerini ölçmek için metilasyon sinyalinin toplam protein seviyelerine normalleşmesi gerekir. Farklı konakçı türlerde (örneğin fare ve tavşan) yetiştirilen toplam ve metillenmiş protein için antikorlar seçilerek, farklı floroforlarla etiketlenmiş ikincil antikorlar kullanılabilir ve her iki antikor için sinyal aynı örnek bantta belirlenebilir. Metil-arginin antikorları, metil-arginin belirli bir bağlamda bulunduğu monometrik, asimetrik veya simetrik olarak dimetillenmiş proteinleri tanımlamak ve karakterize etmek için geliştirilmiştir. PRMT'lerin çoğunluğu alt tabakaları5içindeki metil glisini ve arginin bakımından zengin motiflerin çoğunluğu, D5A12, ASYM24 veya ASYM25 ve SYM11 gibi monometrik veya asimetrik, simetrik dimetil-arginin-glisin tekrarları içeren peptitler için çeşitli antikorlar yetiştirildi. Diğer metil-arginin antikorları, bu özel bağlamlarda metil-arginin tespitini kolaylaştıran tekrar bir bağlamda asimetrik, simetrik dimetil ve monometil arginin içeren bir peptit kütüphanesine karşı üretildi6. Ayrıca, histone H4R3me2a veya BAF155-R1064me2a gibi metilasyonun seçici olarak tespit edilmesini sağlayan tek bir proteinde spesifik arginin işaretini tanıyan antikorların sayısı da artmaktadır.

PRMT hücresel tahlilleri için araç olarak kullanılabilen ticari olarak kullanılabilen birkaç PRMT inhibitörü vardır. Bununla birlikte, hepsi seçicilik ve hedef dışı etkiler için kapsamlı bir şekilde karakterize değildir ve bazıları dikkatli kullanılmalıdır. Yapısal Genomik Konsorsiyum, akademik laboratuvarlar ve ilaç ortaklarıyla işbirliği içinde, bilim topluluğu tarafından hiçbir kısıtlama olmadan kullanılabilen iyi karakterize güçlü, seçici ve hücre geçirgen PRMT inhibitörleri (kimyasal problar) geliştirmiştir. Bu inhibitörler hakkında bilgi https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics ve https://www.chemicalprobes.org/ bulunabilir. Kimyasal problar in vitro IC 50 veya Kd < 100 nM, aynı ailedeki proteinler üzerinde 30 kat seçicilik ve 1 μM'de önemli hücresel aktiviteye sahip küçük molekülinhibitörleridir.

Bu protokolün amacı, floresan batı lekesi yöntemini kullanarak bireysel PRMT aile üyelerinin hücresel aktivitesini ölçmektir. Burada doğrulanmış test biyobelirteçleri, antikorlar ve güçlü hücre aktif inhibitörleri ve başarılı tahlil uygulaması için değerli stratejiler hakkında ayrıntılı bilgi verilmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültleme ve kaplama

NOT: Önerilen ortama sahip kültür hücreleri ve mikoplazma kontaminasyonu için rutin olarak test edin. Hek293T, MCF7 ve C2C12 hücreleri örnek olarak seçilmiştir, çünkü bu hücre hatları PRMT testlerinde başarıyla kullanılmıştır.

  1. DMEM'deki Kültür HEK293T, MCF7 ve C2C12, 10 cm doku kültürüyle işlenmiş (TC) yemeklerde %10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin(100U mL−1)ve streptomisin (100 μg mL −1) ile desteklenmiştir.
  2. PRMT8 tahlili için, test başlamadan önce 3 gün boyunca prmt1 indükleyen hek293T hücrelerini doksiksin (2 μg/mL) içeren medyada büyütün.
  3. Hücreleri kaplamak için, ortamı plakadan çıkarın ve atın.
  4. Hücreleri yıkamak ve çözeltiyi atmak için 10 mL PBS (Ca+2 ve Mg+2 iyonları olmadan) ekleyin.
  5. 1 mL Trypsin-EDTA (%0,25) ekleyin, oda sıcaklığında (RT) 1 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından çözeltiyi atın. Hücreler yuvarlanana kadar kuluçkaya yaslanın ve plakadan ayırın. Gerekirse hücreleri ayırmaya yardımcı olmak için plakaya dokunun. C2C12 gibi denenecek zor hücreler için plakayı 37 °C'de 1-2 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Hücre canlılığını azaltacağından, hücrenin tripsin çözeltisine daha uzun süre (>10 dk) maruz kalmasından kaçının.
  6. Plakaya 1 mL önceden ısıtilmiş ortam ekleyin ve hücre kümelerini parçalamak için hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı borulayın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3-5 mL ortam ekleyin.
  7. Hücre sayısını ölçmek için, 10 μL hücreyi 10 μL Trypan mavisi ile karıştırın ve 10 μL'yi hemositometreye aktarın veya başka bir hücre sayma yöntemi kullanın.
  8. Önerilen hücre yoğunluğuna göre hücreleri seyreltin ve 24 kuyulu TC plakalarına 500 μL / kuyu koyun (Tablo 1). Endojen testlerde (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ve PRMT9) Adım 3.1'e geçin.

2. Hücre nakli

  1. Eksojen tahliller için (PRMT3, PRMT6, PRMT8) HEK293T hücrelerini önerilen DNA miktarı ile transfect (Tablo 2). HEK293T hücrelerinin transfect edilmesi kolaydır, böylece üreticinin talimatına uyarak herhangi bir transfeksiyon reaktifi kullanılabilir.

3. Bileşik tedavi

NOT: Kültür ortamlarında %0,1 son dimetil sülfit (DMSO) konsantrasyonunu aşmayın. Her kuyuda aynı DMSO konsantrasyonu tutun. Seçici PRMT inhibitörleri (kimyasal problar) ve yakından ilişkili inaktif analogları Tablo 3'tebulunabilir.

  1. Endojen testlerde (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ve PRMT9), hücrelerden ortam çıkarın ve 500 μL ortamla sadece bileşik veya DMSO (kontrol) ile değiştirin.
    NOT: R metilasyon seviyelerinde %80'in üzerinde azalma gözlemlemek genellikle 2 gün sürer.
  2. Eksojen tahliller (PRMT3, PRMT6, PRMT8) için, transfeksiyondan sonra 4 saat medyayı çıkarın, sadece bileşik veya DMSO (kontrol) ile 500 μL ortam ekleyin ve 20-24 saat kuluçkaya yatırın.

4. Hücre lysate hazırlığı

  1. Kuyulardaki tüm ortamları çıkarın, artık ortamı çıkarmak için 100 μL PBS ile yıkayın ve 60 μL lizis tamponu ekleyin (20 mM Tris-HCl pH 8, Her kuyuya 150 mM NaCl, 1 mM etileniaediaminetetraasetik asit (EDTA), 10 mM MgCl2, %0,5 Triton X-100, 12,5 U mL−1 benzonaz, komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli).
    1. RT'de 1 dakikadan daha az bir süre kuluçkaya yatırarak liziz tamponu hücrelere dağıtmak için plakayı sallar. Daha sonra son % 1 konsantrasyona 3 μL% 20 w / v sodyum dodecyl sülfat (SDS) ekleyin ve hafifçe sallayarak karıştırın. Lisatları mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve buzda tutun.
      NOT: Kullanmadan önce benzonaz ve protein inhibitörü kokteyli taze ekleyin. Benzonaz ilavesi, hücreli likat viskozitesini azaltan nükleik asitleri hızla hidrolize eder.
  2. BCA Protein Test Kiti kullanarak numunelerin protein konsantrasyonunun belirlenmesi veya çözeltide %1 SDS'nin tolere edilmesi için başka bir yöntem kullanılması.
    1. 96 kuyulu şeffaf plakanın kuyularına 2 μL lizat ve protein standartları (lizis tamponunda 0, 1, 2, 4 ve 8 μg/mL BSA) ekleyin.
    2. Reaktif A'yı 50:1 oranında B reaktifi karıştırın ve kuyu başına 200 μL ekleyin. 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın ve emiciliği okuyun.
  3. Lizis tamponu ile protein konsantrasyonu numuneler arasında eşit olacak şekilde ayarlayın.
  4. 60 μL hücre lisatine 20 μL 4x Yükleme Tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın. Isı denatürasyonundan sonra, lysates -20 ° C'de saklanabilir.

5. Batı blot analizi

  1. Histone proteinlerinin analizi için 5-20 μg ve diğer proteinler için 20-100 μg toplam hücre lisatı% 4-12 Bis-Tris protein jeline yükleyin.
  2. Jeli MOPS SDS'de tampon (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, %0,1 SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7,7) ile 100 V'de yaklaşık 2 saat boyunca veya boya önü jelin dibine ulaşana kadar çalıştırın.
  3. Islak transfer yapıyorsanız, transfer sandviçini buz gibi Tris-Glisin transfer tamponunda (25 mM Tris, 192 mM Glisin, %20 v/v metanol ve %0,05 w/v SDS) monte edin.
    1. Süngerleri, filtre kağıdını, PVDF membranını ve jeli üreticinin talimatlarına göre yerleştirin. Montajdan önce 30 sn boyunca transfer tamponunda metanol ve denge jeli içine batırarak PVDF membranını etkinleştirin.
      NOT: Düşük otofluoresans ve histonlar(Malzeme Tablosu)gibi düşük moleküler ağırlıklı proteinler için uygunluk olduğundan önerilen PVDF batı şişkin membran kullanın.
  4. Proteinleri jelden Tris-Glisin transfer tamponunda PVDF membranlarına buz üzerinde 1,5 saat boyunca 70 V'ta aktarın.
  5. Blok tamponunda membranları 30 dakika boyunca engelleyin (fosfat tamponlu salin, PBS'de% 5 w/v süt). Yıkama tamponu (PBST: PBS'de % 0,1 v/v Ara-20) ile durulayın ve sığır serum albümin (BSA) çözeltisinde (PBST'de% 5 BSA) birincil antikorlarla bir gecede 4 °C'de(Tablo 3)kuluçkaya yatırın.
    NOT: Daha uzun depolama için BSA çözeltisini filtreleyin, %0,02 w/v sodyum azit ekleyin ve 4 °C'de tutun.
  6. MEMBRAN 3 x 5 dk PBST ile yıkayın. Daha sonra önerilen blokaj tamponunda keçi-anti-tavşan (IR800) ve eşek anti-fare (IR680) antikorları ile kuluçkaya yatırın (Malzeme Tablosu, Tablo 3) RT'de 30 dakika ve PBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  7. Sinyali 800 ve 700 nm'de floresan bir batı leke görüntüleyicisinde okuyun. Tercihen, güçlü ve soluk bantların yüksek hassasiyet ve dinamik aralık, yüksek sinyal-gürültü oranı, görüntü doygunluğuna ulaşıldığında bir uyarı ve aynı örnek banttaki iki floresan rengin çoklanması ile tek bir görüntüde net bir şekilde görüntülenmesini sağlayan cihazı kullanın.
  8. Floresan batı görüntüleme için uygun yazılımı kullanarak batı leke analizi için bant yoğunluklarını belirleyin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bireysel PRMT'lerin hücresel tahlilleri için batı lekesi sonuçları örnekleri aşağıda sunulmuştur. Tahlil detayları tablo 4'te de özetlenmiştir.

PRMT1 tahlil
PRMT1 hücrelerde histone 4 arginin 3 asimetrik dimetilasyon (H4R3me2a) ana katkıda bulunur13. PRMT1 aktivitesinin kaybedilmesi üzerine, küresel Rme1 ve Rme2s seviyeleri önemli ölçüdeartar 13. Şekil 1A ve 1B'de gösterildiği gibi, Rme1, Rme2a, Rme2s ve H4R3me2a'daki küresel değişiklikleri izlemek için çeşitli antikorlar kullanılabilir. Küresel Rme2a ve H4R3me2a seviyelerinde önemli bir düşüş ve Rme1 ve Rme2'lerde artışlar 3 günlük PRMT1 nakavttan sonra gözlenebilir (Şekil 1A, B). Bazal H4R3me2a sinyalinde hücre hatları farklılık gösterir, bu nedenle PRMT1 aktivitesinin kaybını izlemeyi kolaylaştırmak için, yüksek bazal metilasyon seviyelerine sahip MCF7 gibi hücre hatları kullanılabilir (Şekil 1C). PRMT1 inhibisyonunun etkisini gözlemlemek için en uygun süre, örneğin TIP I PRMT inhibitörü MS023 8 ile tedavi üzerine,2gündür(Şekil 1D,1E). Daha uzun tedavi hücre canlılığının ve büyümesinin azalmasına neden olur.

PRMT3 tahlil
PRMT3 hücresel tahlili için, PRMT3 devirme veya aşırı ifade üzerine batı lekesinde metilasyon değişikliklerinin tespit edilemediği seçici biyobelirteç proteinleri tespit edilemedi. PRMT3 asimetrik dimetilit H4R3 in vitro14olarak gösterilmiştir, ancak, işaret ağırlıklı olarak PRMT1 tarafından biriktirilir ve bu nedenle aşırı ifade edilen PRMT3 ile eksojen bir test tasarlanmıştır. In vitro bulgularla tutarlı olarak, vahşi tip PRMT3'ün aşırı ifade edilmesi, ancak katalitik mutantının (E338Q) H4R3me2a seviyelerinde bir artışa yol açtı (Şekil 2A). HEK293T hücreleri, bu işaretin düşük bazal metilasyonuna sahip oldukları için kullanılmıştır (Şekil 1C). Tahlil ayrıca PRMT3 seçici inhibitörü SGC7077ile daha da doğrulandı, bu da PRMT3'e bağımlı H4R3 asimetrik metilasyonını inhibe etti (Şekil 2B).

PRMT4 tahlil
PRMT4 asimetrik olarak arginin 1064 15'te BAF155'i dimetillatlar. BAF165-R1064me2a'yı tespit eden antikor ticari olarak mevcut olduğundan, hücrelerdeki PRMT4 aktivitesi R1064me2a işaret seviyelerindeki değişiklikler tespit edilerek batı lekesi tarafından izlenebilir. PRMT4 seçici inhibitörü, TP-06410ile PRMT4 proteininin kaybı veya katalitik aktivitenin inhibisyonu, BAF165-R1064me2a seviyelerinde bir azalmaya neden olur (Şekil 3). Metilasyon sinyalinin çoğunu çıkarmak için genellikle 2 günlük bir tedavi yeterlidir.

PRMT5 tahlil
PRMT5, protein asinin simetrik dimetilasyonunun çoğundan sorumludur. Daha önce SmBB'ler de dahil olmak üzere çeşitli SMN kompleks proteinlerinin PRMT5 substratları16olduğu bildirilmiştir. PRMT5 aktivitesi, SmBB'nin proteinlerinin simetrik arginin dimetilasyonu veya simetrik dimetilasyonundaki küresel seviyelerdeki değişikliklere bakılarak izlenebilir. PRMT5'indevrilmesi , ancak PRMT1, 3, 4, 6 ve 7'nin değil, küresel Rme2s seviyelerinde bir azalmaya neden olur (Şekil 4A). Çoğu hücre hattında, PRMT5 seçici inhibitörleri LLY-28311 ve GSK591 olan hücrelerin 2-3 gün boyunca tedavisi SmBB'Rme2s sinyalinin çoğunu baskılamıştır (Şekil 4B). Çoğu hücre PRMT5 inhibisyona karşı hassastır, bu da hücre çoğalmasında ve uzun süreli inhibitör maruziyeti ile hücre ölümünde azalmaya neden olur.

PRMT6 tahlil
PRMT6'nın hücre17'dekiH3 arginin 2 asimetrik dimetilasyona (H3R2me2a) ana katkıda bulunduğu bildirilmiştir. HEK293T hücrelerinde 3 gün boyunca PRMT6 nakavt H3R2me2a seviyelerinde önemli bir düşüş gözlemlemek için yeterli değildi. Bununla birlikte, vahşi TIP PRMT6'nın aşırı ifadesi, ancak katalitik mutantının (V86K / D88A) H3R2me2a seviyelerinin yanı sıra H3R8me2a ve H4R3me2a(Şekil 5A)seviyelerini arttırır. Farklı güç ve seçiciliğe sahip PRMT6 aktivitesini engelleyen birkaç inhibitör vardır: seçici, allosterik PRMT6 inhibitörü SGC687018, PRMT tipi I inhibitörü MS0238ve PRMT4/6 inhibitörü MS0499. Tüm bunlar inhibe PRMT6 bağımlı H3R2 (Şekil 5B), yanı sıra H4R3 ve H3R8 asimetrik dimetilasyon (veri gösterilmez).

PRMT7 tahlil
PRMT7, HSP70'in (sırasıyla HSPA8 ve HSPA1/6) hem kesin hem de indükleyici formlarında arginin 469'u monometrik olarak oluşturur12. HSP70-R469me1 seviyelerini tespit eden piyasada mevcut antikor olmamasına rağmen, pan monometril antikorlarla iz tespit edilebilir. PRMT7 seçici inhibitörü SGC302712ile PRMT7 proteininin kaybı veya katalitik aktivitenin inhibisyonu, HSP70-R469me1 seviyelerinin azalmasına neden olur (Şekil 6A, B). SGC3027, hücrelerde indirgemeler tarafından PRMT7 seçici inhibitörü SGC8158'e dönüştürülen hücre geçirgen bir prodrugdur, bu nedenle hücresel güç hücre çizgileri arasında farklılık gösterebilir. Birkaç kanser hücre hattı yüksek seviyelerde indüklenebilir HSP70 izoformlarını ifade eder ve üst üste binen nükleer kökenli belirsiz bir bant nedeniyle metilasyonu tespit etmek zor olabilir (Şekil 6C). Bu nedenle, PRMT7 hücresel tahlili için, C2C12 gibi çoğunlukla HSPA8'i ifade eden hücre çizgileri önerilir veya HSP70 esas olarak sitoplazmada lokalize olduğundan, tercih edilen hücre hatlarının sitoplazmik fraksiyonunda HSP70-R469me1 seviyelerini belirleyin.

PRMT8 tahlil
PRMT8, doku kısıtlamalı ifade deseni olan tek PRMT'dir - büyük ölçüde beyinde ifade edilir19


figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6

figure-results-7

figure-results-8





Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, PRMT ailesinin üyeleri için floresan batı şişkinlik yöntemlerini kullanan ayrıntılı hücresel test protokolleri açıklanmıştır. Arginin metilasyonundaki değişikliklerin bireysel PRMT kaybı veya katalitik inhibisyon üzerine kolayca tespit edilebildiği ve diğer aile üyeleri tarafından telafi edilemediği benzersiz substratlar seçilmiştir. Bazı proteinler birden fazla PRMT21,23ile metillenir, bu da bazı PRMT'lerin belirli bir protein substratı24 , 25 , 26,27'de sadece az miktarda hücresel işarete katkıda bulunduğu substrat özgüllüğünde bir çakışma olduğunu gösterir, örneğin, hem PRMT8 hem de PRMT1 EWS'nin metilasyonuna katkıda bulunur. Bu nedenle, her test, devir ve / veya aşırı ifade deneyleri ile substratların ve antikorların kapsamlı bir şekilde doğrulanmasını ve iyi karakterize edilmiş seçici inhibitörlerle daha fazla doğrulamayı gerektiriyordu. Metil-arginin işaret düzeylerini dolaylı olarak etkileyebilecek hücre canlılığının ve çoğalmasının bileşik etkilerini önlemek için PRMT sonrası kayıp/inhibisyon sonrası 2-3 gün içinde metilasyon işareti değişikliklerinin tespit edilebileceği PRMT'ye özgü substratlar belirlendi. PRMT1, 4, 5, 7 ve 9 için benzersiz substratlar bulmak mümkün olsa da; PRMT3, 6 ve 8 için fonksiyon yaklaşımının kazanımının istihdam edilmesi gerekiyordu. Çeşitli hücresel hedefler için çeşitli arginin metil spesifik antikorlar test edildi, ancak hiçbiri PRMT3 ve PRMT6 nakavttan sonraki 3 gün içinde önemli değişiklikleri tespit edemedi; Bu nedenle, biyobelirteç tahlilleri, taban çizgisi substrat metilasyonu için bir kontrol görevi gören katalitik olarak inaktif mutantlarla birlikte ektopik olarak ifade edilen enzimler kullanılarak geliştirilmiştir. PRMT8 yakın bir PRMT1 homolog'udur ve benzer substrat tercihlerini paylaşır. Bir PRMT8 seçici biyobelirteç tanımlanamadığı için, PRMT8'in EWS ile birlikte ifade edildiği PRMT1 knockdown hücrelerinde bir test geliştirilmiştir. PRMT1 aynı zamanda H4R3 asimetrik metilasyonundan sorumlu önemli bir enzimdir, bu nedenle H4R3me2a'yı PRMT3 ve PRMT6 hücresel tahlilleri için biyobelirteç olarak kullanmak için, düşük bazal H4R3me2a seviyelerine sahip hücreler seçildi ve katalitik olarak inaktif mutantlar arka plan kontrolü olarak kullanıldı. Endojen tahliller tercih edilse de, eksojen tahliller birkaç seçici PRMT inhibitörünün hücresel gücünü test etmek için paha biçilmezdir7,8,9. PRMT biyolojisi hakkında artan bilgi birikimimizle, PRMT3, PRMT6 ve PRMT8 için daha spesifik biyobelirteç proteinleri bularak tahlilleri geliştirmeyi bekliyoruz.

Doğrulanmış antikorların ve uygun kontrollerin kullanımı PRMT test performansı için kritik öneme sahiptir. Burada önerilen tüm antikorlar nakavt ve aşırı ifade deneyleri ile iyice doğrulanmıştır, ancak özellikle poliklonal antikorlar durumunda toplu-toplu farklılıklar performanslarını hala etkileyebilir. Bu nedenle, test güvenilirliğini doğrulamak için genetik yöntemlerin ve kimyasal probların yakından ilişkili negatif kontrolleriyle birlikte kullanılması çok önemlidir. Ek olarak, protein aşırı ekspresyonu gerektiren PRMT tahlilleri için, bazal metilasyon seviyelerini belirlemek için vahşi tip protein ile birlikte katalitik olarak inaktif mutantların kullanılması çok önemlidir.

PrMT'lerin hücrelerdeki aktivitesinin profilini çıkarmak için bu nicel tahlil koleksiyonu, bilim topluluğu için geniş ölçüde yararlı olabilir, çünkü sadece temel hücre kültleme ve floresan batı şişkinlik tekniklerini içeren minimum ekipman ve sınırlı teknik uzmanlıkla hızlı ve kolay bir şekilde uygulanabilir. PRMT'ler için önerilen antikorlar ve kimyasal problar, belirli bir ABPP probunun uygunluğunu belirlemek, hedef katılımını izlemek ve rekabetçi ABPP formatını kullanarak hedef dışı etkileri değerlendirmek için aktivite tabanlı protein profilleme (ABPP) tahlilleri için de kullanılabilir. Burada tartışılan tahlil geliştirme yaklaşımları protein lizin-metiltransfezler ve asetiltransfenazlar gibi diğer enzim aileleri için de tahmin edilebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir rakip finansal çıkar veya diğer çelişkili çıkarları bulunmaz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapısal Genomik Konsorsiyumu, AbbVie 1097737, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Ontario Genomik Enstitüsü aracılığıyla Genom Kanada [OGI-196], Yenilikçi İlaç girişimi 2 Ortak Taahhüt yoluyla AB ve EFPIA [EUbOPEN hibesi 875510], Janssen, Merck KGaA (Kanada ve ABD'de EMD), Pfizer, Takeda ve Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 cm TC tabaklarıGreiner bio-one664160
24 kuyulu TC plakalarıGreiner bio-one662160
4– % 12 Bis-Tris Protein JelleriThermoFisher ScientifficNP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF membranMillipore-Sigma10600021
anti-Asym 24Millipore-Sigma07-414
anti-Asym 25Millipore-Sigma09-814
anti-B-aktinSanta Cruz Biyoteknolojisc-47778
anti-BAF155Santa Cruz Biyoteknolojisc-32763
anti-BAF155-R1064me2aMillipore-SigmaABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000)Millipore-SigmaF4799
anti-GFPClontech632381
anti-H3Abcamab10799
anti-H3R2me2aMillipore-Sigma04-848
anti-H3R8me2aRockland600-401-I67
anti-H4Abcamab174628
anti-H4R3me2aAktif Motif39705
anti-Hsp / Hsc70EnzoADI-SPA-820
anti-PRMT1Millipore-Sigma07-404
anti-PRMT3Abcamab191562
anti-PRMT4Bethyl#A300-421A
anti-PRMT5Abcamab109451
anti-PRMT6Abcamab47244
anti-PRMT7Abcamab179822
anti-Rme1CST8015
anti-Rme2aCST13522
anti-Rme2sCST13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)Abcamab56800
anti-SAP145-R508me2sUmut Şehri Beckman Araştırma Enstitüsü
anti-SmBB'denSanta Cruz Biyoteknolojisc-130670
benzonazKURUM İÇİ ÜRETİLEN
BSAMillipore-SigmaA7906
C2C12hediyesi Dr. Stephane Richard, McGill Üniversitesi
cOmplete, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü KokteyliMillipore-Sigma11873580001
DMEMWisent319-005-CL
DMSOBioshopDMS666.100
eşek anti-fare IgG-IR680Licor926-68072
doksisiklinMillipore-SigmaD9891
EDTABiyoshop EDT111.500
FBSWisent80150
glisinBioshopGLN002.5
keçi karşıtı tavşan IgG-IR800Licor926-32211
York Üniversitesi'nden Dr. Sam Benchimol'denHEK293T
Image Studio Yazılımı ver 5.2Licor
Yükleme tamponu: NuPAGE LDS Numune Tamponu (4x)ThermoFisher ScientifficNP0007
MCF7ATCC® HTB-22 ve ticaret;
NaClBioshopSOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Çalıştırma TamponuThermoFisher ScientifficNP0001
Odyssey Engelleme Tamponu (PBST ile 4 x seyreltin)Licor927-40000Intercept (PBS) Engelleme Tamponu da kullanılabilir # 927-70001
Odyssey CLX Görüntüleme SistemiLicormodel numarası 9140
PBS (doku kültürü)Wisent311-010-CL
PBS (batı lekesi)BioshopPBS405.4
penstrepWisent450-201-EL
, Pierce & trade; BCA Protein Test KitiThermoFisher Scientiffic23225
SDSBioshopSDS001.1
yağsız süt tozuBioshopSKI400.500
TC20 otomatik hücre sayacıBiorad1450102
Tripsin-EDTA (% 0.25)Wisent325-043-EL
TrisBioshopTRS003.5
Tritton X-100BiyodükkanTRX506
tripan mavisiGIBCO15250-061
Ara-20BiyoshopTWN510.500
Dr. Yanzhong Yang'dan nazik hediye hediye

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine Methylation: The Coming of Age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  2. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  3. Bedford, M. T., Richard, S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function. Molecular Cell. 18 (3), 263-272 (2005).
  4. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. The Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).
  5. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  6. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Science Reports. 3, 1311(2013).
  7. Kaniskan, H. U., et al. A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3). Angewandte Chemie International Edition. 54 (17), 5166-5170 (2015).
  8. Eram, M. S., et al. A Potent, Selective, and Cell-Active Inhibitor of Human Type I Protein Arginine Methyltransferases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 772-781 (2016).
  9. Shen, Y., et al. Discovery of a Potent, Selective, and Cell-Active Dual Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 4 and Protein Arginine Methyltransferase 6. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (19), 9124-9139 (2016).
  10. Nakayama, K., et al. TP-064, a potent and selective small molecule inhibitor of PRMT4 for multiple myeloma. Oncotarget. 9 (26), 18480-18493 (2018).
  11. Bonday, Z. Q., et al. LLY-283, a Potent and Selective Inhibitor of Arginine Methyltransferase 5, PRMT5, with Antitumor Activity. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (7), 612-617 (2018).
  12. Szewczyk, M. M., et al. Pharmacological inhibition of PRMT7 links arginine monomethylation to the cellular stress response. Nature Communications. 11 (1), 2396(2020).
  13. Goulet, I., Gauvin, G., Boisvenue, S., Cote, J. Alternative splicing yields protein arginine methyltransferase 1 isoforms with distinct activity, substrate specificity, and subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 33009-33021 (2007).
  14. Siarheyeva, A., et al. An allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3. Structure. 20 (8), 1425-1435 (2012).
  15. Stefansson, O. A., Esteller, M. CARM1 and BAF155: an example of how chromatin remodeling factors can be relocalized and contribute to cancer. Breast Cancer Research. 16 (3), 307(2014).
  16. Pesiridis, G. S., Diamond, E., Van Duyne, G. D. Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21347-21359 (2009).
  17. Guccione, E., et al. Methylation of histone H3R2 by PRMT6 and H3K4 by an mLL complex are mutually exclusive. Nature. 449 (7164), 933-937 (2007).
  18. Yudao Shen,, L, F., et al. A First-in-class, Highly Selective and Cell-active Allosteric Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6). BioRxiv. , 1-21 (2020).
  19. Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Identification of proteins interacting with protein arginine methyltransferase 8: the Ewing sarcoma (EWS) protein binds independent of its methylation state. Proteins. 72 (4), 1125-1137 (2008).
  20. Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S., Bedford, M. T. PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family. Journal of Biological Chemistry. 280 (38), 32890-32896 (2005).
  21. Kim, J. D., Kako, K., Kakiuchi, M., Park, G. G., Fukamizu, A. EWS is a substrate of type I protein arginine methyltransferase, PRMT8. International Journal of Molecular Medicine. 22 (3), 309-315 (2008).
  22. Yang, Y., et al. PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145. Nature Communications. 6, 6428(2015).
  23. Rakow, S., Pullamsetti, S. S., Bauer, U. M., Bouchard, C. Assaying epigenome functions of PRMTs and their substrates. Methods. 1175, 53-65 (2020).
  24. Musiani, D., et al. Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity. Science Signaling. 12 (575), (2019).
  25. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and Computational Approaches for the Large-Scale Analysis of Protein Arginine Methylation by Mass Spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  26. Shishkova, E., et al. Global mapping of CARM1 substrates defines enzyme specificity and substrate recognition. Nature Communications. 8, 15571(2017).
  27. Pawlak, M. R., Banik-Maiti, S., Pietenpol, J. A., Ruley, H. E. Protein arginine methyltransferase I: substrate specificity and role in hnRNP assembly. Journal of Cellular Biochemistry. 87 (4), 394-407 (2002).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PRMT AktivitesiArginin MetilasyonuFloresan Western BlotProtein MetiltransferazlarPRMT nhibit r DeneyiAntikor Tabanl DeneylerSubstrat zg llH cre Lizat Haz rlamaHiston Metilasyonu

İlgili makaleler