Burada, bir fare tümörü modelinde tümöre özgü ve periferi kaynaklı tümör kaynaklı lenfositlerin karakterizasyonu için bir tümör transplantasyon protokolü sunulmaktadır. Alıcı kaynaklı immün hücrelerin akışının akım sitometrisi ile spesifik olarak izlenmesi, antitümör immün yanıtlar sırasında bu hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerinin dinamiklerini ortaya koymaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
T hücresi aracılı bağışıklık, tümörlere karşı immün yanıtlarda çok önemli bir rol oynarken, sitotoksik T lenfositler (CTL'ler) kanserli hücrelerin eradikasyonunda öncü rol oynamaktadır. Bununla birlikte, tümör mikroçevresi (TME) içindeki tümör antijenine özgü CD8 + T hücrelerinin kökenleri ve yenilenmesi belirsizliğini korumaktadır. Bu protokol, vekil neoantijen, ovalbümin (OVA) ve TCR transgenik OT-I farelerini istikrarlı bir şekilde eksprese eden B16F10-OVA melanom hücre hattını kullanır; burada CD8 + T hücrelerinin% 90'ından fazlası, sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülü H2-Kb'ye bağlı OVA türevi peptid OVA 257-264'ü (SIINFEKL) spesifik olarak tanır. Bu özellikler, tümörigenez sırasında antijene özgü T hücre yanıtlarının incelenmesini sağlar.
Bu modeli tümör nakli cerrahisi ile birleştirerek, donörlerden gelen tümör dokuları, alıcı kaynaklı bağışıklık hücrelerinin nakledilen donör dokulara akışını kesin olarak izlemek için tümörle eşleşen sinjenik alıcı farelere nakledildi ve tümöre özgü ve periferi kaynaklı antijene özgü CD8 + 'nın bağışıklık yanıtlarının analizine izin verdi. T hücreleri. Bu iki popülasyon arasında dinamik bir geçişin gerçekleştiği bulunmuştur. Toplu olarak, bu deneysel tasarım, TME'deki CD8 + T hücrelerinin bağışıklık tepkilerini tam olarak araştırmak için başka bir yaklaşım sağlamıştır ve bu da tümör immünolojisine yeni bir ışık tutacaktır.
Giriş
CD8 + T hücre aracılı immün yanıt, tümör büyümesini kontrol etmede çok önemli bir rol oynar. Tümörigenez sırasında, naif CD8 + T hücreleri, MHC sınıf I kısıtlı bir şekilde antijen tanınması üzerine aktive olur ve daha sonra efektör hücrelere farklılaşır ve tümör kütlesi 1,2'ye sızar. Bununla birlikte, tümör mikroortamında (TME), uzun süreli antijen maruziyeti ve immünosüpresif faktörler, infiltre edilmiş tümöre özgü CD8 + T hücrelerini "tükenme" olarak bilinen hiporesponsive bir duruma yönlendirir3. Tükenmiş T hücreleri (Tex), akut viral enfeksiyonda hem....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm fare deneyleri, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitelerinin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. 6-8 haftalık C57BL/6 fareleri ve 18-22 g ağırlığındaki naif OT-I transgenik fareleri kullanın. Hem erkek hem de dişi randomizasyon veya "körleştirme" olmadan kullanın.
1. Ortam ve reaktiflerin hazırlanması
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına %10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin ve 2 mM L-glutamin ekleyerek hücre kültürü ortamı D10'u daha önce tarif edildiği gibihazırlayın 29 .
- RPMI-1640'ı% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Tümör aşılamasından sekiz gün sonra, CD45.1 + ve CD45.1 + CD45.2 + OT-I hücreleri, B16F10-OVA tümörü taşıyan C57BL / 6 farelere enjekte edildi. Tümör, transfer sonrası 8. günde CD45.1+ OT-I hücre implante edilmiş farelerden (donör) cerrahi olarak diseke edildi ve implante edilen tümörle aynı taraftaki dorsal kanatta tümörle eşleşen CD45.1 + CD45.2 + OT-I hücre implante edilmiş fa.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
T hücre aracılı bağışıklık, tümörlere karşı bağışıklık yanıtlarında çok önemli bir rol oynarken, CTL'ler kanserli hücrelerin yok edilmesinde öncü rol oynamaktadır. Bununla birlikte, TME içindeki tümör antijenine özgü CTL'lerin kökenleri aydınlatılamamıştır30. Bu tümör transplantasyon protokolünün kullanılması, kök benzeri TCF1 + progenitör CD8 + T hücrelerinin varlığına rağmen, intratümöral antijene özgü CD8 + T hücrelerinin uzun süre devam etmeyebileceğine dair ön.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Seçkin Genç Akademisyenler için Ulusal Doğa Bilimleri Fonu (LY'ye No. 31825011) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (QH'ye No. 31900643, ZW'ye No. 31900656) hibelerle desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 μ m filtre | Kırlangıç SLGPR33RB | ||
| 1 mL tüberkülin şırınga | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL santrifüj tüpü | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insülin şırıngası | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL konik tüp | KUNDUZ | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoetanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Metil-2-bütanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μ m naylon hücre süzgeci | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-fare CD45.1 | BioLegend | 110714 | Klon: A20 |
| B16F10-OVA hücre hattı | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (sığır serum albümini) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Fare Anti-Fare CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Klon: 104 |
| hücre kültürü kabı | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| santrifüj | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| siklofosfamid | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Fare CD8+ T Hücre İzolasyon Kiti | Kök Hücre Teknolojileri | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tüpleri | BD Falcon | 352052 | |
| fetal sığır serumu | Gibco | 10270-106 | |
| akış sitometresi | BD | FACSCanto II | |
| hemositometre | PorLab Scientific | HM330 | |
| izofluran | RWD yaşam bilimleri | R510-22-16 | |
| KHCO3< / sub> | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke Kiti, 633 veya 635 nm uyarma için | Yaşam Teknolojileri | L10199 | |
| iğne taşıyıcı | RWD Yaşam Bilimleri | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehit | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-fare TCR V & alpha; 2 | BioLegend | 127808 | Klonu: B20.1 |
| Kalem Strep Glutamin (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP / Cy5.5 anti-fare CD8a | BioLegend | 100734 | Klonu: 53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodyum azid | Sigma | S2002 | |
| cerrahi forseps | RWD Yaşam Bilimleri | F12005-10 | |
| cerrahi makas | RWD Yaşam Bilimleri | S12003-09 | |
| dikiş ipliği | RWD Yaşam Bilimleri | F34004-30 | |
| tripsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Kaynaklar
- Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4),....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
