Zebra Balığında Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığına Bağlı Hepatosellüler Karsinomun Erken İlerlemesi Sırasında Karaciğer Mikroçevresinin Analizi

Özet

Burada, kolesterol fazlasının karaciğer mikroçevresi ve bağışıklık hücresi manzarası üzerindeki etkisini incelemek için alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ile ilişkili Hepatosellüler Karsinom (HCC) zebra balığı modelinin nasıl üretileceğini sunuyoruz.

Özet

Karaciğer kanseri şu anda dünya çapında kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir ve Hepatosellüler Karsinom (HCC) tüm karaciğer kanseri vakalarının% 75-90'ını oluşturmaktadır. Hepatit B / C'yi önlemek ve tedavi etmek için etkili tedavilerin sunulmasıyla, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ve alkolsüz steatohepatit (NASH) olarak bilinen daha agresif form, modern toplumlarda HCC'yi geliştirmek için hızla bir numaralı risk faktörü haline gelmektedir. NASH'ın HCC'nin gelişimindeki rolünü daha iyi anlamak için NASH ile ilişkili bir HCC zebra balığı tasarladık. Zebra balığı larvalarının optik berraklığı ve genetik izlenebilirliği, onları invaziv olmayan floresan canlı görüntüleme kullanarak karaciğer mikroçevresini ve bağışıklık hücresi kompozisyonunu incelemek için çekici ve güçlü bir model haline getirir. Bu protokol, kolesterol fazlasının karaciğer mikro ortamındaki etkisini ve hastalığın erken evrelerinde bağışıklık hücresi kompozisyonu üzerindeki etkisini araştırmak için NASH ile ilişkili HCC zebra balığı modelinin nasıl kullanılacağını açıklar. İlk olarak, hepatosit spesifik aktif beta-katenini eksprese eden HCC larvalarını (s704Tg), NASH ile ilişkili bir HCC modeli geliştirmek için 8 gün boyunca% 10 yüksek kolesterol diyeti ile besliyoruz. Burada, karaciğer alanı, hücre ve nükleer morfoloji (hepatositler alanı, nükleer alan, nükleer:sitoplazmik oran (N:C oranı), nükleer dairesellik, mikronüklei/nükleer herniasyon skorlaması) ve anjiyogenez gibi non-invaziv konfokal mikroskopi ile karaciğerdeki birçok erken malignite özelliğinin değerlendirilmesinde farklı transgenik çizgilerin nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Daha sonra, etiketli bağışıklık hücreleri (nötrofiller, makrofajlar ve T hücreleri) ile transgenik çizgiler kullanarak, NASH ile ilişkili HCC larvalarında karaciğer bağışıklık hücresi kompozisyonunun nasıl analiz edileceğini gösteriyoruz. Tarif edilen teknikler, erken hepatokarsinogenez aşamalarında karaciğer mikroçevresini ve bağışıklık hücresi kompozisyonunu değerlendirmek için yararlıdır, ancak diğer karaciğer hastalığı modellerinde bu özellikleri incelemek için de değiştirilebilirler.

Giriş

Hepatosellüler Karsinom (HCC), sınırlı tedavi seçenekleri olan agresif bir kanserdir. HCC'li tüm hastaların% 30'undan fazlasının obez olduğu ve NAFLD 1,2,3,4'ün agresif bir formu olan ^NASH'ye sahip olduğu bulunmuştur. Kalori bakımından zengin diyetlerin tüketimi, lokal ve sistemik metabolik kaymalara neden olan ve steatoz, hepatosit hasarı, inflamasyon ve fibrozu tetikleyen yağ asidi mevcudiyetini büyük ölçüde arttırır - NASH'nin tüm temel özellikleri. NASH'nin HCC'ye ilerlemesi, karaciğerde lipitlerin birikmesini içerir, bu da inflamasyonu tetikler ve bağışıklık hücresi kompozisyonunu değiştirir ^5,6,7. Karaciğer hastalığı progresyonu sırasında karaciğer mikroçevresinin ve bağışıklık hücresi manzarasının nasıl değiştiğini ve bazı etiyolojik faktörlere bağlı olarak nasıl değiştiğini anlamak özellikle ilgi ve önem taşımaktadır. Kolesterol fazlasının karaciğer mikro ortamı ve bağışıklık hücresi manzarası üzerindeki etkisini daha iyi tanımlamak için, NASH ile ilişkili HCC'nin benzersiz bir zebra balığı modelini geliştirdik. Bu modelin kullanımı bize diyet ve aşırı beslenmenin karaciğer mikroçevresi ve karaciğer hastalığı progresyonu üzerindeki etkisini daha iyi anlamamızı sağlamıştır.

Fareler ve insan doku örnekleri gibi memeli modelleri, steatohepatit ve steatoz^8'in patogenezini anlamada gerekli olmuştur. Fareler karaciğer hastalığı ve kanser için tercih edilen modeldir, ancak hücresel düzeyde optik netlikten yoksundurlar, insan doku örnekleri ise genellikle hayvan modellerinin taklit edebileceği 3D ortamdan yoksundur. Bu engeller Zebra Balığını araştırma topluluğunda güçlü bir model haline getirmiştir. Zebra balığı, en az% 70 gen koruması ile insanlarla dikkate değer benzerliklere sahiptir. Karaciğer mikroçevresini, hepatik hücresel bileşimini, fonksiyonunu, sinyalizasyonunu ve yaralanmalara yanıtı korurlar ^9,10. HCC'nin transgenik zebra balığı modeli ile birlikte yüksek kolesterollü bir diyet (HCD) kullanarak, NASH ile ilişkili HCC'nin bir zebra balığı modelini geliştirdik.

Burada, NASH ile ilişkili HCC zebra balığı modelinin nasıl oluşturulacağını ve karaciğer mikroçevresinin nasıl çalışılacağını ve in vivo olarak erken malignite özelliklerinin nasıl ele alınacağını açıklayan bir protokol sunuyoruz. İnvaziv olmayan konfokal mikroskopiyi, floresan etiketli hepatosit membran ve çekirdeğe sahip zebra balığı transgenik çizgileri ile birlikte kullanarak, karaciğer morfolojisini (alan, hacim ve yüzey alanı), hücre ve nükleer morfolojiyi (hepatositler alanı, nükleer alan, N: C oranı, nükleer dairesellik, mikronüklei / nükleer herniasyon skorlaması) ve anjiyogenezi (damar yoğunluğu) analiz ederek erken malignite özelliklerini ele alabiliriz. İmmün hücre mikroçevresi, hepatokarsinogenez^11,12,13,14 üzerinde de önemli bir özelliktir^, bu nedenle, etiketli bağışıklık hücrelerine (nötrofiller, makrofajlar ve T hücreleri) sahip transgenik zebra balığı çizgileri kullanarak^, NASH ile ilişkili HCC larvalarında karaciğer bağışıklık hücresi kompozisyonunun nasıl analiz edileceğini de gösteriyoruz. Tarif edilen teknikler modele özgüdür ve karaciğer hastalığı progresyonunda karaciğer mikroçevresini ve bağışıklık hücresi kompozisyonunu değerlendirmek için son derece yararlıdır.

Protokol

Hayvan çalışmaları, Albert Einstein Tıp Fakültesi'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürleri izleyerek gerçekleştirilir. Protokolde kullanılan tamponlar ve çözeltiler için tarifler için lütfen Ek Tablo 1'e bakın.

1. Akut kolesterol fazlası için% 10 Kolesterol ile zenginleştirilmiş diyetin hazırlanması.

1. İki adet 25 mL cam beherde 2 x 4 g Altın İnci Diyeti 5-50 nm Aktif Küre (GPAS) tartın - biri Normal Diyet (ND) için, diğeri % 10 Yüksek Kolesterol Diyeti (HCD) için.
   NOT: Zebra balığı larvaları için herhangi bir ticari kuru gıda diyeti kullanılabilir.
2. 10 mL'lik bir cam beherde 0.4 g Kolesterol tartın. Beheri biraz folyo ile örtün.
3. 20 G'lik bir iğne ile 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 5 mL Dietil Eter'i ölçün. Daha sonra, Dietil Eter'i ND beherine ekleyin ve hemen bir spatula kullanarak kuru yiyeceklerle karıştırın.
   DİKKAT: Dietil Eter göz, cilt ve solunum yolu tahrişine neden olur. Sadece kimyasal bir duman davlumbazında kullanın.
4. 20 G'lik bir iğne ile 10 mL'lik bir şırınga kullanarak tekrar 5 mL Dietil Eter ölçün ve Kolesterollü 10 mL beher'e ekleyin, hemen şırınga ile yukarı ve aşağı aspire ederek karıştırın.
5. Kolesterol çözeltisini HCD kabına hızla ekleyin ve çözelti düzgün olana kadar hemen bir spatula ile karıştırın.
6. Dietil Eter'i tamamen buharlaştırmak için beherleri kaputta 24 saate kadar bırakın. Ertesi gün, GPAS diyetlerini bir havane ve harç kullanarak ince parçacıklara öğütün.
   NOT: Diyetleri öğütmek çok önemli bir adımdır, larvalar 50 nm'den büyük parçacıkları yiyemezler.
7. Her diyeti küçük, etiketli bir plastik torbaya veya 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve -20 ° C'de saklayın.

2. Kolesterolle zenginleştirilmiş diyetle beslenen kısa süreli larvalarla NASH indüksiyonu - statik koşullar.

1. -1. günde transgenik balık hatları kurun (Tablo 1). Ertesi sabah (0. Gün), balıklar yumurtladıktan sonra, bir ağ süzgecinde yumurta toplayın.
2. Embriyo suyu (E3) içeren bir yıkama şişesi kullanarak, yumurtaları iyice durulayın ve yumurtaları E3 orta boy 10 cm'lik Petri kaplarına dikkatlice aktarın.
3. Ölü veya döllenmemiş yumurtalar da dahil olmak üzere üreme kutularında birikmiş olabilecek tüm kalıntıların plakalarını temizleyin.
   NOT: Yumurtaların durulanması ve plakaların temizlenmesi, mikroorganizmaların kontrolsüz büyümesini ve bunun sonucunda larva gelişimindeki kusurları önlemek için çok önemlidir.
4. Yumurtaları 10 cm petri kabı başına 70/80 yoğunlukta bölün (25 mL E3'te). 1. Günde, bir transillumination tabanı ile donatılmış bir diseksiyon kapsamında, ölü embriyoları veya gelişimsel kusurları olan embriyoları kontrol edin ve temizleyin.
   NOT: Gelişim etkileri olan embriyoları tanımlamak ve plakalardaki mikroorganizmaların büyümesini kontrol etmek için transillumination baz karanlık alan modunu kullanın. Farklı tesislerin sistemlerinde farklı mikroorganizma verimi vardır. Olumsuz etkilerden kaçınmak için gerekirse E3 ortamını ve/veya bulaşıkları değiştirin.
5. 5. Günde, tüm yemeklerden larvaları 15 cm'lik bir Petri kabında birleştirin, metilen mavisi olmadan E3 ekleyin. Daha sonra, larvaları besleme kutularına aşağıdaki gibi bölün (Tablo 2).
   NOT: Kontrol koşullarında, sistemik kronik inflamasyonu tetiklemeden sağlıklı larvalar üretmek için, larvalar larva başına günde yaklaşık 0.1 mg gıda ile beslenmelidir. Toplam yiyecek miktarının (Tablo 2) günde iki beslemeye eşit olarak bölündüğüne dikkat edin.
6. Larvaları 28 ° C'de bir inkübatörde, karanlık-ışık döngüsünde (örneğin, 14 saat ışık / 10 saat karanlık döngü) tutun ve larvaları 5. Gün'den 12. Gün'e kadar günde iki kez besleyin.
7. Günlük olarak herhangi bir gıda artıklarını ve ortamın %90-95'ini 1 mL'lik pipet ucuna bağlı bir vakum sistemi kullanarak aspire edin. Daha sonra larvalara zarar vermemek için besleme kutusunun bir köşesine metilen mavisi içermeyen yeni E3'ü dikkatlice dökün.
   NOT: Besleme kutularının günlük temizliği, mikroorganizmaların kontrolsüz büyümesini önlemek için çok önemlidir.

3. Döllenme sonrası 13 gün larvalarının beslenme kutularından toplanması.

1. 13. Günde, oluşturulan deneysel koşulların sayısına göre toplama yemekleri hazırlayın. Kalıcı bir işaretleyici kalemle, numunelerin değiştirilmesini önlemek için bulaşıkların yanında (kapak ve alt) bir işaret yapın, örneğin normal diyet için bir siyah şerit (ND) ve HCD için iki siyah şerit.
2. Her yemeğin altını örtmek için metilen mavisi olmadan yeterince E3 dökün. Vakum sistemini dikkatlice kullanarak, suyu besleme kutularından aspire edin, bu malzemelerin toplama kaplarına aktarılmasını önlemek için herhangi bir döküntüyü veya ölü larvayı alttan aspire etmeye çalışın.
3. Su seviyesi düşmeye başladığında, larvaların köşelerden birine yüzmesini sağlamak için besleme kutusunu yavaşça kaldırın, ardından ters yönde aspire edin.
   NOT: Suyu aspire ederken farklı çaplara izin vermek için farklı yüksekliklerde kesme uçlu 1 mL pipet kullanın. Farklı boyutlar arasında geçiş yapın, daha büyük bir çapla başlayın ve su hacmi azaldıkça ve larva yoğunluğu arttıkça daha küçük bir çapa geçin.
4. Sadece yaklaşık 20-30 mL sıvı olduğunda, larvaları Adım 1'de hazırlanan toplama petri kabına dikkatlice boşaltın. Etiketli bandı besleme kutusundan tabağın kapağına yerleştirin.
5. Tüm besleme kutuları için 3.2-3.4 arasındaki adımları yineleyin.

4. Diyete bağlı hepatik steatoz için kontrol testi - Yağ Kırmızı O (ORO) boyama, görüntüleme ve puanlama.

1. Bir cam Pasteur pipet kullanarak, 15-20 larvayı 2 mL'lik yuvarlak bir alt tüpe aktarın ve yaklaşık 15-30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ortamın çoğunu tüpten çıkarın.
2. Larvaları sabitlemek ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe etmek için% 4'lük paraformaldehitin (PFA) 2 mL'sini ekleyin.
3. Ertesi sabah,% 4 PFA çözeltisini çıkarın ve larvaları 2 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.
4. Bir ağ kuyu eki ile koşul başına 12 kuyucuklu bir plaka (Şekil 2A) hazırlayın.
5. Bir cam pipet kullanarak, larvaları 2 mL tüpten daha önce kuyuya yerleştirilmiş olan eke aktarın, 5 mL 1x PBS ekleyin. 2 mL tüpleri lekelemeden sonra numune depolamak üzere saklayın.
   DİKKAT: Larvalar bu aşamada son derece yapışkandır, plastik pipet kullanmayın.
6. Larva ile birlikte 5 mL% 60 İzopropanol çözeltisi ile başka bir kuyuya aktarın. Larvaları 30 dakika oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
7. Bu arada,% 60 İzopropanol çözeltisinde% 0.3'lük bir Yağ Kırmızı O hazırlayın. 0,45 μm şırınga filtresi kullanarak %0,3 Yağ Kırmızısı çözeltisini iki kez filtreleyin.
   NOT: İzopropanol içinde 3 mL'lik %0,5 Yağ Kırmızı O'yu 2 mL damıtılmış su ile karıştırarak kuyu başına 5 mL çözelti hazırlayın. %60 İzopropanol çözeltisindeki %0,3 Yağ Kırmızı O'nun taze olarak hazırlanması gerekir.
8. Daha sonra, larva ile ağ ekini% 60 İzopropanol çözeltisinde 5 mL taze yapılmış% 0.3 Yağ Kırmızı O ile başka bir kuyuya aktarın. RT'de 3 saat boyunca inkübe edilmiş larvalar hafif sallanma ile.
9. ORO boyamasından sonra, larvaları% 60 İzopropanol ile başka bir kuyuya aktararak durulayın. Larvaları% 60 İzopropanol'da iki kez% 60 İzopropanol ile sırayla yuvalara aktararak her seferinde 30 dakika boyunca yıkayın.
10. Larvaları 1x PBS-0.1% Ara'da 5 dakika boyunca üç kez, 1x PBS-0.1% Ara'lı kuyucuklara sırayla aktararak yıkayın.
11. Larvaları 2 mL tüplere aktarın. PBST'yi çıkarın, 1 mL% 80 Gliserol ekleyin ve görüntülemeye kadar 4 ° C'de saklayın.
12. Daha iyi görüntüleme için, larvaları 1x PBS-0.1% Ara'ya aktarın ve diseksiyon kapsamı altında, iki # 55 forseps kullanarak dokuları dikkatlice çekerek karaciğerleri disseke edin.
    NOT: Casper kullanılarak arka plan görüntülemesi tüm larvalar kullanılarak gerçekleştirilebilir.
13. Bir cam pipet kullanarak, karaciğerleri% 50 Gliserol içeren bir Porselen Spot Plakanın bir kuyucuğuna dikkatlice aktarın. Larvaları manipüle etmek için küçük bir alet kullanarak karaciğerleri konumlandırın (örneğin, kirpik aleti - Şekil 2B). Görüntü karaciğerleri renkli bir kamera ile donatılmış bir stereomikroskopta.
14. Skor hepatik steatoz (ORO boyama yok = yok; açık kırmızı ORO boyama = hafif; kırmızı-koyu kırmızı ORO boyama = orta / şiddetli).

5. Zebra balığı Büyüme ve Görüntüleme için Yaralama ve Tuzak Cihazı (zWEDGI) kullanılarak invaziv olmayan konfokal görüntüleme.

1. Tabanı örtecek kadar 15-20 mL 1x Trikain-E3 ile 10 cm'lik bir Petri kabı hazırlayın.
   NOT: 1x Trikain-E3 çalışma çözeltisi (0.16 mg/mL), 25x Trikain stok çözeltisinin (4 mg/mL) 48 mL'lik E3 içinde seyreltilmesiyle elde edilebilir. Trikain konsantrasyonu 0.16 mg / mL'yi geçmemelidir, çünkü larvalar bu gelişim aşamasında anesteziye karşı son derece hassastır.
2. Plastik bir Pasteur pipeti ile 15-20 larvayı 1x Trikain-E3 içeren Petri kabına aktarın ve larvaları 5 dakika boyunca anestezi altına alın.
3. Kuyu başına metilen mavisi olmadan 2-3 mL E3 içeren 6 kuyucuklu bir plaka hazırlayın.
4. Bir floresan stereomikroskopta, anestezi altındaki larvaları istenen floresan belirteçler için tarayın (Tablo 1). E3'te taranan larvaları minimum miktarda Trikain olarak aktarın ve görüntü zamanı gelene kadar 6 kuyu plakasında iyileşmelerine izin verin.
   NOT: İkili, üçlü ve dörtlü transgenik larvaların taranması zaman alır, larvaları E3'e yerleştirir ve gereksiz Trikaine maruz kalmayı azaltmak için genellikle 6 kuyu plakasından medyayı değiştirir. Ayrıca, bu gelişim aşamasındaki larvalar yüzer, bu nedenle larvaları doku hasarına neden olmadan tarama için konumlandırmak için bir kirpik aracı kullanın.
5. Taramadan sonra, 25 mL 1x Trikain-E3 ile 10 cm'lik bir Petri kabı hazırlayın. Plastik bir Pasteur pipeti ile 15-20 larvayı 1x Trikain-E3 içeren petri kabına aktarın ve larvaları 5 dakika boyunca uyuşturun.
6. Bu arada, stereomikroskop altında, yaralama ve tuzak cihazının odalarına 1x Trikain-E3 ekleyin (örneğin, zWEDGI)^15,16. P200 mikropipet kullanarak hava kabarcıklarını odalardan ve kısıtlama tünelinden çıkarın. 1x Tricaine-E3'ün tüm fazlalıklarını çıkarın ve sadece odaları doldurmak için yeterli hacim bırakın.
7. Anestezik bir larvayı zWEDGI'nin yükleme odasına aktarın ve stereomikroskop altında bir kirpik aleti kullanarak konumlandırın. Nazikçe larvaların kafasına dokunun ve kuyruğun kısıtlama tüneline girmesi için itin. Ek olarak, mikropipeti kullanarak larvaların tünele girmesine yardımcı olmak için yaralama odasından 1x Trikain-E3 çıkarın. Larvaların sol lobun görüntülenmesi için uygun şekilde konumlandırıldığından emin olun - Ters Mikroskop: sol taraf aşağıya bakacak; Dik Mikroskop: sol taraf yukarı bakacak şekilde.
   NOT: Bir zWEDGI mevcut değilse, balıklar 1x Trikain-E3'te %1 düşük erime noktası agarozuna monte edilebilir ve yerleştirilebilir, ancak agaroz daldırma sadece hızlı görüntüleme için kullanılabilir (15 dakikaya kadar).
8. Hepatosit ve nükleer morfoloji analizi için, 40x hava hedefi ve 2 μm optik kesitlerin z-yığınlarını kullanarak konfokal mikroskopla görüntü karaciğerleri. Karaciğer morfolojisi, anjiyogenez ve immün hücre işe alım testleri için, 20x hava hedefi ve 5 μm optik bölümlerden oluşan z-yığınları kullanarak görüntü karaciğerleri. Büyük karaciğerli larvalar için, tüm karaciğerin ve çevresindeki 75 μm'lik alanın görüntülenmesini sağlamak için 2 x 2 karo görüntüleri alınmalıdır.
9. Görüntülemeden sonra, larvaları kısıtlama tünelinden çekmek ve metilen mavisi içermeyen E3'lü bir petri kabına aktarmak için 1x Trikain-E3 içeren plastik bir Pasteur pipet kullanın.

6. Karaciğer morfolojik varyasyonlarının analizi.

NOT: Aşağıda listelenen adımlar karaciğer yüzey alanı ve hacim ölçümü için gerçekleştirilir:

1. Görüntüleme yazılımını açın. Analiz edilecek görüntü dosyalarını içeren klasörü Arena'ya Gözlemle klasörü simgesini seçerek ekleyin. Ardından, küçük resimlere sağ tıklayarak dosyaları biçime (.ims) dönüştürmek için Yerel Imaris dosya biçimine dönüştür'ü seçin.
2. Surpass alt menüsünde, her kanal için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Ardından, mavi Yeni yüzeyler ekle düğmesine tıklayarak karaciğerden bir yüzey oluşturun.
3. Ardından, yüzey oluşturma panelinde Karaciğerin bir yüzeyini manuel olarak oluşturmak için Yalnızca ilgilenilen bir bölgeyi segmentlere ayır'ı seçin.
4. Otomatik oluşturma | atla'yı tıklatın Manuel olarak düzenle seçeneği. Kontur'u seçin ve sahne panelindeki "Ses Seviyesi" seçeneğinin işaretini kaldırın.
   NOT: Birim görünümü seçeneğinin işaretinin kaldırılması gerekir, aksi takdirde farklı z-yığınlarındaki ilgi alanı seçimi mümkün olmayacaktır.
5. Z-yığınları arasında gezinin ve Mod'u seçerek her düzlemde ilgilendiğiniz bölgeyi çizin, tercih ettiğiniz çizim modunu seçin. İşaretçiyi Gezinme Değil Modu seç'e çizmeye başlamak için, ardından Çiz'e tıklayın ve bir yatırım getirisi çizmek için işaretçiyi karaciğere doğru sürüklemeye başlayın.
6. Farklı odak düzlemlerinde bir YG seçtikten sonra, seçilen tüm YG'leri birleştirmek ve karaciğer yüzeyi oluşturmak için Bir yüzey oluştur'u seçin.
7. Daha sonra, yeni oluşturulan yüzeyi kullanarak hepatositler sinyalinin bir maskesini oluşturun. Yüzeye tıklayın ve Düzenle sekmesinin (kurşun kalem) altında Tümünü Maskele'yi seçin. Görünen pencerede, karaciğer hacmini ve yüzey alanını ölçmek için kullanılacak maskelemek istediğiniz kanalı seçin. Ardından, vokselleri yüzey dışında 0 olarak ayarla'yı seçin ve maske uygulamadan önce Kanalı çoğalt seçeneğini işaretleyin.
8. Analiz için istatistiksel analiz menüsünden karaciğer yüzey alanı ve karaciğer hacmi değerlerini kullanın.

NOT: Karaciğer alanı ölçümü için aşağıdaki adımları uygulayın.

9. Fiji yazılımını açın. Eklentiler menüsünde, Biyo-formatlar ve ardından Bio-format İçe Aktarıcı'yı seçin, görüntü dosyasını açmak için Kanalları böl seçeneğini işaretleyin.
10. Görüntü menüsünde, görüntünün doğru piksel boyutuna ve voksel derinliğine (doğru değerler değilse) sahip olup olmadığını kontrol etmek için Özellikler'i seçin. Ardından, Görüntüler Menüsü'ne gidin, Ayarla'ya ve ardından Parlaklık ve Kontrast'a tıklayın, görüntü parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.
11. Daha sonra, hepatositler kanalını kullanarak karaciğerin maksimum yoğunluk projeksiyonunu oluşturur. Görüntüler Menüsü'ne gidin, Yığınlar'a ve ardından Z Projesi'ne tıklayın. Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu'nu seçin.
12. Serbest seçim aracını kullanarak, larva karaciğerini çevreleyen bir ilgi alanı (ROI) manuel olarak oluşturun. Ardından, Analiz menüsünde karaciğer alanını elde etmek için Ölç'e tıklayın. Daha fazla analiz için sonuçları elektronik tablo olarak kaydedin.

7. Hepatosit ve Nükleer morfolojik analiz.

1. Fiji yazılımını açın. Eklentiler menüsünde, Görüntü dosyasını açmak için Kanalları böl seçeneğinde Biyo-formatlar ve ardından Biyo-formatlar İçe Aktarıcı'yı işaretleyin.
2. Görüntü menüsünde, görüntünün doğru piksel boyutuna ve voksel derinliğine (doğru değerler değilse) sahip olup olmadığını kontrol etmek için Özellikler'i seçin. Ardından, Görüntüler menüsüne gidin, Ayarla'ya ve ardından Parlaklık ve Kontrast'a tıklayın, görüntü parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.
3. Analiz menüsünde, analiz etmek istediğiniz tüm parametrelerde (ör. alan, çevre ve şekil tanımlayıcıları) Ölçümleri Ayarla onay işaretini seçin. Hepatosit membran floresan kanalını seçin. Z'de gezinirken, bir hepatosit etrafında mükemmel yatırım getirisi elde etmek için serbest seçim aracını kullanın. Ardından, Analiz menüsünde hepatositler alanını hesaplamak için Ölçüm'e tıklayın.
4. 15-30 hepatosit için adım 7.3'ü tekrarlayın. Daha fazla analiz için sonuçları elektronik tablo olarak kaydedin.
5. Ardından, çekirdek floresan kanalını seçin. Z'de gezinirken, hepatosit çekirdeğinin etrafına mükemmel yatırım getirisi çekmek için serbest seçim aracını kullanın. Ardından, Analiz menüsünde nükleer alanı ve daireselliği hesaplamak için Ölç'e tıklayın.
6. 15-30 hepatosit için adım 7.5'i tekrarlayın. Nükleer:sitoplazmik oranın nicelleştirilmesi de dahil olmak üzere daha fazla analiz için sonuçları bir elektronik tablo olarak kaydedin.
7. Mikronüklei varlığı ve fıtıklaşma için örnekleri aşağıdaki gibi puanlayın (Tablo 3).

8. Anjiyogenez analizi.

1. Bu protokolün 6. bölümünde açıklandığı gibi karaciğer için manuel olarak bir yüzey oluşturun. Bu yüzeye "Karaciğer Yüzeyi" adını verin.
2. Karaciğerin içindeki endotel hücreleri sinyali için bir maske oluşturun. Yüzeye tıklayın ve düzenle sekmesinin (kurşun kalem) altında Tümünü Maskele'yi seçin. Görünen pencerede, damar sinyallerini sadece karaciğerden izole etmek için endotel hücreleri kanalını seçin. Vokselleri yüzey dışında 0 olarak ayarla'yı seçin ve Maske'yi uygulamadan önce Kanalı çoğalt seçeneğini işaretleyin.
3. Maskelenmiş yeni endotel hücrelerini Karaciğer Vaskülatürü olarak yeniden adlandırın.
4. Gemi hacmini ve yüzey alanını ölçmek için ikinci bir yüzey oluşturun. Mavi renkli Yeni yüzeyler ekle düğmesine tıklayın. Yüzey oluşturmanın ilk adımında, otomatik olarak bir yüzey oluşturmak için tüm seçeneklerin seçilmediğinden emin olun.
5. İkinci adımda, üzerinde bir yüzey oluşturmak için Karaciğer Vaskülatür kanalını seçin. Gemilerden mümkün olduğunca çok ayrıntı algılamak ve eşik seçeneğinde arka plan çıkarmayı etkinleştirmek için yumuşatma seçeneğinin seçimini kaldırın.
6. Tespit edilen yüzeyin karaciğer vaskülatür sinyaliyle kolokalize olduğundan emin olmak için eşiklemeyi ayarlayın. İstatistiksel analiz menüsünden yüzey alanı ve hacim değerlerini kullanın. Aşağıdaki denklemleri kullanarak gemi yoğunluk indeksini hesaplayın:
   Damar yoğunluk indeksi (Karaciğer μm 2 ile) = (Damar Yüzey Alanı (μm 2)) / (Karaciğer Yüzey Alanı (μm²))
   Damar yoğunluk indeksi (Karaciğer μm 3 ile) = (Damar Hacmi (μm 3)) / (Karaciğer Hacmi (μm³))

9. İmmün hücre işe alım analizi.

1. Fiji yazılımını açın. Eklentiler menüsünde, Görüntü dosyasını açmak için Kanalları böl seçeneğinde Biyo-formatlar ve ardından Biyo-formatlar İçe Aktarıcı'yı işaretleyin.
2. Görüntü menüsünde, görüntünün doğru piksel boyutuna ve voksel derinliğine (doğru değerler değilse) sahip olup olmadığını kontrol etmek için Özellikler'i seçin. Ardından, Görüntüler menüsüne gidin, Ayarla'ya ve ardından Parlaklık ve Kontrast'a tıklayın, görüntü parlaklığını ve kontrastını ayarlayın (örneğin, makrofajlar - mCherry veya dTomato; nötrofiller - BFP; T-hücreleri - EGFP; hepatositler - EGFP veya mCherry).
3. Ardından, her kanala maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun.
4. Bölüm 6'da (Adım 6.9-6.12) açıklandığı gibi, larva karaciğerini çevreleyen bir yatırım getirisi oluşturun ve karaciğer alanını ölçün. Karaciğer alanı ve 75 μm çevre alanı ("İşe alım alanı") dahil olmak üzere ikinci bir yatırım getirisi oluşturun.
5. Ardından, Düzen menüsünde Seçim seçeneğini ve ardından Yöneticiye ekle'yi seçin. Doğuştan gelen bir bağışıklık hücresi kanalı Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu seçerek, İşe Alım alanını ayarlamak için ROI Yöneticisi penceresinden karaciğer yatırım getirisine tıklayın.
6. Eklentiler menüsünde, Analiz Et seçeneğini ve ardından Hücre Sayacı'nı seçin ve İşe Alım alanındaki bağışıklık hücrelerini sayın. Bir elektronik tabloda karaciğer bölgesine işe alınan bağışıklık hücrelerinin sayısını kaydedin.
7. Karaciğer alanı başına düşen bağışıklık hücresi sayısını normalleştirerek nötrofil, makrofaj ve T hücresi yoğunluklarını hesaplayın.

Sonuçlar

Hepatosellüler Karsinom (HCC) zebra balığı modeline kısa süreli yüksek kolesterol diyeti ekleyerek, hepatositlere özgü yapısal olarak aktif bir Beta-katenin formunu (s704Tg; Tg (fabp10a: pt-B-cat, cryaa: Venüs) ¹⁷, NASH ile ilişkili HCC'nin memeli olmayan omurgalı modelini oluşturabiliyoruz. Karaciğer hastalığının ilerlemesi hepatik steatoz, karaciğer boyutu, hepatosit, nükleer morfoloji, anjiyogenez ve immün hücre infiltrasyonu ölçülerek erken izlenebilir (Şekil 1).

Normal bir diyetle beslenen HCC larvaları, Yağ Kırmızı O boyama ile ölçülen hafif hepatik steatoza hiçbir şey göstermez. Bununla birlikte, yüksek kolesterol diyeti ile beslenen HCC larvaları, hepatik steatozda önemli bir artış göstermektedir (Şekil 2).

Karaciğer hastalığının iyi bilinen bir belirteci hepatomegali^17'dir. Karaciğer boyutunu değerlendirmek için, HCC larvaları, özellikle Tg (fabp10a: H2BmCherry) gibi hepatositler üzerinde bir floresan belirteci ifade eden transgenik bir çizgi ile aşılabilir. Hepatomegali'yi değerlendirmek için karaciğer alanının (2D), karaciğer yüzey alanının ve karaciğer hacminin (3D) değerlendirilmesi yapılır. Kolesterol fazlalığına 8 gün maruz kaldıktan sonra, HCC larvalarında karaciğer büyümesi gözlenmiştir (Şekil 3).

Non-invaziv canlı görüntüleme kullanılarak, hepatosit membranlarında (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) ve hepatosit çekirdeklerinde (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry gibi) floresan proteinleri eksprese eden transgenik balık hatları, hepatositlerde malignite ile ilişkili hücresel ve nükleer morfoloji değişikliklerini değerlendirmek için kullanılabilir. NASH ile ilişkili HCC'de hepatosit alanı (Şekil 4A, B, D), nükleer alanda (Şekil 4C, E) ve nükleer:sitoplazmik oranda (Şekil 4F) artmıştır. HCD + HCC grubunda da nükleer döngüsellikte anlamlı bir azalma gözlenmiştir (Şekil 4G). Lipotoksisite, mikronüklei varlığında karsinogenezin bir özelliği olan DNA hasarını tetikler. H2B-mCherry belirtecini kullanarak, yüksek kolesterol diyeti ile beslenen HCC larvalarında daha fazla mikroçekirdek insidansı gözlemledik (Şekil 4H).

Hepatik vaskülatür, zebra balığı modellerinde, vaskülatürü etiketleyen Tg (kdrl: mCherry veya Tg (fli: EGFP) gibi transgenik etiketli bir çizgi kullanılarak kolayca değerlendirilebilir. HCC+HCD larvalarında damar yoğunluğunda anlamlı bir artış gözlendi (Şekil 5).

NASH ile ilişkili HCC'de erken tetiklenen enflamatuar yanıtı gözlemlemek için, Tg (mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP) gibi makrofajlarda ve nötrofillerde floresan proteinleri eksprese eden transgenik bir balık hattı, HCC transgenik çizgisi ile çaprazlandı. Nötrofillerin ve makrofajların infiltrasyonu, HCD ile beslenen HCC ve HCC'de meydana gelir; bu, karaciğer ve çevresindeki nötrofillerin / makrofajların sayısının ve yoğunluğunun (75μm'ye kadar olan çevre) miktarının ve miktarının ölçülmesiyle değerlendirilir (Şekil 6A-H). Bununla birlikte, HCC + HCD, nötrofil sayısında ve yoğunluğunda önemli bir artış göstermiştir (Şekil 6F-H). Döllenmeden 13 gün sonra, adaptif bağışıklık sistemi zaten işlevseldir. Tg (lck: EGFP) gibi T-Hücrelerinde floresan proteini ifade eden transgenik bir balık hattı kullanarak ve HCC transgenik hattı ile kombinasyon halinde; kolesterol fazlasının karaciğere T hücrelerinin alımı üzerindeki etkisini değerlendirdik. HCD ile beslenen HCC larvalarında T-Hücre yoğunluğunda ve toplam sayısında anlamlı bir azalma gözlenmiştir (Şekil 6I-K).

Transgenik Zebra Balığı hatları	ZFIN referansı	Tahlil
Casper	roya9; mitfaw2	Hepatik steatosis
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venüs / fabp10a:H2B-mCherry)	s704Tg / uwm41Tg	Karaciğer morfolojisi
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venüs; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)	s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg	Hepatositler ve nükleer morfoloji
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venüs; fli:EGFP)	s704Tg / y1Tg	Anjiyogenez
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venüs;  mfap4:Domates-CAAX; lyzC:BFP)	s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg	Makrofaj ve Nötrofil alımı
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venüs; lck:EGFP)	s704Tg / cz1Tg	T-hücreleri işe alım

Tablo 1: Farklı tahlillerde kullanılacak transgenik zebra balığı hatları.

Larva sayısı	Besleme kutusu boyutu	Günlük yiyecek miktarı (mg)	E3 Hacmi (ml)
30-40	Küçük ıslah kutusu	3-4	200
60-80	Küçük/Büyük ıslah kutusu	6-8	400
100-150	Büyük üreme kutusu	10-15	500

Tablo 2: Besleme kutularının koşullarını ayarlayın.

Fenotip	Puanlama yöntemi
Hiç kimse	Normal Çekirdekler, Mikronüklei veya fıtıklaşma yok
Hafif	Düşük mikroçekirdek sayısı (görüş alanı başına 5'ten az) ve/veya fıtıklaşma
Orta / Şiddetli	Orta ila yüksek sayıda mikroçekirdek (görüş alanı başına 5'ten fazla) ve / veya fıtıklaşma

Tablo 3: Mikronükleer ve Nükleer Fıtıklaşma Skorlaması.

Şekil 1: Ana deneysel adımları ve analiz yaklaşımını özetleyen Protokol Diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Karaciğer Steatozu için Kontrol Testi - ORO boyaması. HCC larvaları normal veya yüksek kolesterol diyeti ile beslendi ve hepatik steatozu değerlendirmek için Oil Red O (ORO) boyaması yapıldı. (A) Ağ kuyusu eklerini kullanarak sıralı ORO boyama yapmak için 12 kuyu plakasının diyagramı. (B) Larvaları manipüle etmek için kullanılan kirpik aracının görüntüsü. (C) Yağ Kırmızısı ile boyanmış karaciğerlerin temsili görüntüleri; HCC ve HCC + HCD larvaları. (D) Farklı karaciğer steatozu skorlaması olan larvaların yüzdesini gösteren ki-kare grafik. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Karaciğer boyutundan temsili görüntüler. Bir karaciğer belirtecini (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) eksprese eden transgenik HCC larvaları, bir zWEDGI kullanılarak ters eğirme diski konfokal mikroskobu üzerinde canlı ve invaziv olmayan bir şekilde görüntülendi. (A) HCC ve HCC + HCD larvalarında karaciğerlerin temsili 3D rekonstrüksiyonları. (B-D) HCC ve HCC+HCD larvalarında karaciğer alanı (B) karaciğer yüzey alanı (C) ve karaciğer hacmi (D) dahil olmak üzere karaciğer morfolojik değişikliklerini gösteren grafik. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Hepatositlerden ve çekirdek morfolojisinden temsili görüntüler. Hepatosit membranlarda (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) ve hepatosit çekirdeklerinde (Tg(fabp10a:H2B-mCherry) floresan proteinleri eksprese eden transgenik HCC hatları görüntülendi. (A-C) HCC ve HCC+HCD larvalarının F-aktin ve hepatosit çekirdeklerinin temsili 3D rekonstrüksiyonları. Açık ok uçları genişlemiş çekirdekleri gösterir; beyaz ok uçları, değiştirilmiş şekle sahip çekirdeği gösterir; kırmızı oklar ise mikronüklei ve nükleer fıtıklaşmayı gösterir. (D-G) HCC ve HCC+HCD 13 günlük larvalarda hücre ve nükleer parametrelerin ortalamalarını gösteren grafikler. (D) Hepatositler alanı. (E) Nükleer Alan. (F) Nükleer: Sitoplazma oranı. (G) Nükleer döngüsellik. Her nokta larva başına ortalamayı temsil eder. Nokta grafikleri, farklı Mikronüklei ve Nükleer herniasyon skorlamasına sahip larvaların yüzdesini gösteren ortalama ±SEM (H) Ki-kare grafiklerini göstermektedir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Hepatik vaskülatürden temsili görüntüler. Hepatosit çekirdeklerinde (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) ve endotel hücrelerinde (Tg)fli:EGFP)) floresan proteinleri eksprese eden transgenik HCC hatları. (A) HCC ve HCC+HCD larvalarında hepatik vaskülatürün temsili 3D rekonstrüksiyonları. (B-C) HCC ve HCC+HFCD larvalarında karaciğer yüzey alanı (B) hacmi (C) ile damar yoğunluk indeksini gösteren grafik. Nokta grafikler ortalama ±SEM. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Karaciğer bağışıklık hücresi manzarasından temsili görüntüler. Makrofajlarda ve nötrofillerde (Tg(mfap4:tdDomates-CAAX; lyz:BFP) veya T-hücrelerinde (Tg(lck-EGFP) floresan proteinleri eksprese eden transgenik HCC hattı. (A,C,F) 13 günlük HCC ve HCC+HCD larvalarında karaciğerlerin temsili 3D rekonstrüksiyonları ve karaciğer bölgesine lökosit alımı. (B) Görüntülenen karaciğer alanının diyagramı. (D-E) HCC ve HCC+HCD larvalarında karaciğer bölgesinde makrofaj yoğunluğunu (D) ve sayısını (E) gösteren grafik. (G-H) HCC ve HCC+HCD larvalarında karaciğer bölgesindeki nötrofil yoğunluğunu (G) ve sayısını (H) gösteren grafik. (G) HCC ve HCC+HCD larvalarında karaciğer bölgesine T hücresi alımının temsili 3D rekonstrüksiyonları. (H-I) HCC ve HCC+HCD larvalarında karaciğer bölgesinde T hücre yoğunluğu (H) ve sayı (I) gösteren grafik. Nokta grafikler ortalama ±SEM. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Arabellekler ve Çözümler Tablosu Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

HCC'nin, özellikle NASH'nin indüklediği HCC'nin insidansının artmasıyla, NASH ile ilişkili HCC'de yer alan hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için daha verimli modellere sahip olmak büyük önem taşımaktadır. Karaciğerdeki hücre-hücre etkileşimlerinin dekonvolüsyonu, karaciğer hastalığının ilerlemesini ve hepatokarsinogenezi daha iyi anlamak için çok önemlidir. Bu protokolde açıklanan yaklaşım, karaciğer hastalığının ilerlemesini in vivo ve non-invaziv olarak analiz etmek için benzersiz bir yol sunmaktadır.

Diyetin hazırlanması, NASH ile ilişkili bir HCC modelinin oluşturulmasının başarısı için kritik öneme sahiptir. Zebra balığı için diyetler hazırlarken, zararlı etkilerden kaçınmak için dietil eterin duman davlumbazının içinde tamamen buharlaşmasına izin vermek önemlidir. Bu diyetleri larvalarla kullanmak için (döllenmeden 5-12 gün sonra), larvalar tarafından gıda alımını sağlamak için diyetleri ince parçacıklara öğütmek son derece önemlidir. Floresan etiketli yağ asidi analoglarının kullanımı, larvalarda gıda alımını değerlendirmek için kullanılabilir.

Larvaları üreme kutularına yerleştirmeden ve besleme prosedürüne başlamadan önce, larvaları farklı plakalardan karıştırarak deneysel örneklemenin üniforma haline getirilmesini sağlamak çok önemlidir. Bu adım önemlidir, çünkü 0. Gün'den başlayarak farklı mikro ortamlar plakaların her birinde teşvik edilir ve enflamatuar yanıtı etkileyebilir.

Bir diğer önemli adım, larvaları saymak, her beslenme kutusu için ne kadar yiyeceğe ihtiyaç duyulduğunu bilmektir. Yiyecek miktarı her kutuda bulunan larva sayısı için yeterli değilse, iki senaryodan biri gerçekleşecektir: 1) larvalar yetersiz beslenecektir; 2) larvalar aşırı beslenecektir. Yanlış beslenme, karaciğer mikro çevresini büyük ölçüde etkileyecek iltihaplanma gibi yetersiz beslenme veya aşırı beslenme ile ilişkili sağlıksız koşullara yol açacaktır. Yanlış beslenme meydana gelirse, larvalar hareket sorunları gösterecektir. Bu gelişim aşamasında, larvalar yoğun bir şekilde yüzmelidir, bu nedenle hareket sorunları fark edilirse larvalar sağlıksız koşullar altında (yetersiz beslenme veya aşırı beslenme nedeniyle toksik kolesterol dozlarına maruz kalma) ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, normal ve kolesterol bakımından zenginleştirilmiş her iki diyet için de beslenme prosedürlerinin sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekir. Hepatomegali (karaciğer boyutu) varlığı ve doku ve organların, özellikle karaciğer ve bağırsağın iltihaplanması (nötrofillerin ve makrofajların gözle görülür şekilde artmış infiltrasyonu) dahil olmak üzere larvaların beslenmesinin ve sağlığının doğruluğunu hızlı bir şekilde ele almak için bazı testler yapılabilir.

E3'ün% 95'inin günlük temizliği ve değiştirilmesi, beslenme kutularındaki mikroorganizmaların büyümesini azaltmak ve larva sağlığını ve hayatta kalmasını iyileştirmek için çok önemlidir. Alternatif olarak, larvalar Bağımsız Raf Sistemine yerleştirilebilir. En iyi sonuç için, 3 litrelik bir tanka 60-80 larva yerleştirin. Akışı hızlı damlama moduna ayarlayarak ve larvaları günde iki kez 3-4 mg besleyerek (ve PM) su akışını minimum seviyede tutun. Her tankta doğru akışı sağlamak için su akışı düzenli olarak kontrol edilmelidir. Laboratuvarımızda bu yöntem %10 HCD'lik kısa süreli beslenme ile bize %95-100 sağkalım sağlamaktadır. Ek olarak, bu yöntem, açıklanan statik besleme protokolünde gerekli olan günlük temizlik ve su değişiminin doğasında bulunan iş yükünü büyük ölçüde azaltmıştır.

Kısa süreli maruziyette NASH'yi indüklemek için% 10 kolesterolle zenginleştirilmiş bir diyet kullanırken, (steatohepatiti indüklemek için 5 gün yeterlidir), fruktoz ¹⁸, yağ asitleri (Palmitik Asit gibi)¹⁹ veya % 4 kolesterolle zenginleştirilmiş bir diyet kullanılarak genişletilebilen beslenme protokolleri kullanmak için diyet değişiklikleri yapılabilir ve genişletilebilir²⁰. Şu anda, HCC için az sayıda başarılı terapötik hedef vardır ve NASH için hiçbiri yoktur. Zebra balığı modellerinin kullanımı, hepatokarsinogenez hakkındaki bilgimizi genişletmek için eşsiz bir fırsatın yanı sıra büyük verim alan ilaç taramaları gerçekleştirmek için paralel olmayan bir omurgalı sistemi sunar. Bu protokolde açıklanan teknikler, karaciğer hastalığı ve hepatokarsinogenez için gelecekteki bulguları ve terapötik hedefleri kolaylaştıracaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kolesterol	Sigma	C8667-25G	Kolayca bozulur. Mağaza -20 derece;
Corning Netwells taşıyıcı kiti 15 mm	Fisher	07-200-223
Corning Netwells kesici uçlar	Fisher	07-200-212
Dietil eter	Fisher	60-046-380	Son derece uçucu.
Dumont forseps # 55 dumostar	Fisher	NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipetleri 5.75in	Fisher	22-183624
4 paraformaldehit (PFA)	Elektron Mikroskobu Bilimi	15710
Altın İnci Diyeti 5 – 50 nm Aktif Küreler	Salamura Karides	Doğrudan-Larvalar	için herhangi bir ticari kuru toz yem kullanılabilir.
Dereceli Transfer	Pipetleri Fisher	22-170-404
İzopropanol	Fisher	BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10'lu Paket	Crystalgen	221-1422-10
Petri Kapları 100X20MM Fisher		08-747D
Trikain	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Yağ Kırmızı O çözeltisi% 0.5 izopropanol	Sigma	O1391-500ML
Trikain	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Vactrap	VWR	76207-630	Larva toplama için vakum sistemi
Mikroskoplar< / güçlü >
Floresan Stereomikroskop	Leica	M205 FCA THUNDER Görüntüleyici Model Organizma Büyük
Eğirme Disk Konfokal Mikroskop	Nikon	Nikon CSU-W1
Stereomikroskop	Leica	S9i, transilluminated base
Software< / strong>
Fiji	Açık kaynaklı Java görüntü işleme programı.
Imaris 9.6	Bit Düzlemi; Oxford Aletleri.