Method Article

Doğal Dokuda İntestinal Sıkı Bileşke Bariyeri ve İyon Geçirgenliğinin Ussing Oda Tekniği ile Fonksiyonel Olarak Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/62468

⸱

May 26th, 2021

 ,  , 
1Laboratory of Physiology, Graduate School of Nutritional and Environmental Sciences, University of Shizuoka

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak epiteli sadece besin emilimini değil, aynı zamanda zararlı maddelere karşı koruma sağlar. Apikal-en epitelyal hücreler arası bileşke, yani sıkı bileşke, parasellüler çözünen ve iyon geçirgenliğini düzenler. Burada, mukozal tabakaların hazırlanması ve Ussing oda tekniği kullanılarak sıkı bağlantıların iyon seçiciliğinin değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ussing oda tekniği ilk olarak 1951 yılında Danimarkalı bilim adamı Hans Ussing tarafından sodyumun kurbağa derisi boyunca hücre ötesi taşınmasını incelemek için icat edildi. O zamandan beri, bu teknik, membranlar arasında taşımanın fizyolojik parametrelerini incelemek için birçok farklı dokuya uygulanmıştır. Ussing odası yöntemi diğer yöntemlere göre tercih edilir, çünkü doğal doku kullanılabilir, bu da onu in vivo olanlara daha uygulanabilir hale getirir. Bununla birlikte, doğal doku kullanıldığından, verim düşüktür, zaman sınırlıdır ve doku hazırlığı beceri ve eğitim gerektirir. Bu odalar, çeşitli dokulardaki spesifik taşıyıcı proteinleri incelemek, Kistik Fibrozis gibi hastalık patofizyolojisini anlamak, ilaç taşınmasını ve alımını incelemek ve özellikle bağırsakta besin taşınmasının anlaşılmasına katkıda bulunmak için kullanılmıştır. Bir dokunun tüm epitel taşıma süreci göz önüne alındığında, sadece transepitelyal yollar değil, aynı zamanda parasellüler yollar da önemlidir. Sıkı kavşaklar, bağırsak boyunca dokuya özgü parasellüler geçirgenliğin önemli bir belirleyicisidir. Bu makalede, transepitelyal iletkenlik ve seyreltme potansiyellerini ölçerek iyonların parasellüler geçirgenliğini değerlendirmek için Ussing odası tekniği kullanılacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ussing odası yöntemi ilk olarak Danimarkalı bilim adamı Hans Ussing tarafından geliştirilmiştir. Ussing, NaCl'nin dik bir konsantrasyon gradyanına karşı cilt boyunca taşınabileceği gözlemlendikten sonra kurbağa derisi boyunca sodyum taşınmasının kısa devre akımını ölçmek için ilk kez kullandı1. Sistemi, cildin her iki tarafına erişimi olan iki oda arasına monte edilmiş kurbağa derisinden oluşuyordu. Her oda, dolaşıma sokulan ve havalandırılan Ringer çözeltisini içeriyordu. Cildin yakınında bulunan ve doymuş KCl-calomel elektrotlarına bağlı iki dar agar zil köprüsü, bir potansiyelleştirici tarafından okunduğu gibi potansiyel farkı ölçtü. İkinci bir çift agar zil köprüsü, bir batarya tarafından sağlanan bir elektromotor kuvveti uygulamak için AgCl ile doymuş KCl'ye sahip beherlere bağlı her odanın karşı ucuna yerleştirildi. Voltajı ayarlamak için potansiyel bir bölücü kullanıldı, böylece cilt boyunca potansiyel fark sıfır kaldı ve böylece kısa devre koşulları yaratıldı. Deriden geçen akımı okumak için bir mikroamper metre de bağlandı (orijinal oda tasarımı için ref.1'deki şekle bakın).

Son 70 yılda, bu teknik, besin ve iyon taşınımını incelemek için birçok farklı dokuya, özellikle bağırsak dokusuna uygulanmıştır. Örneğin, kolera kaynaklı ishalin mekanizması bu odalara tavşan ileum monte edilerek incelenmiş ve kolera toksinine bağlı ishale cAMP2 aracılık ettiği bulunmuştur. Ek olarak, bu odalar ayrıca Na +-Glikoz kotransporter 1 (SGLT1) 3 aracılığıyla glikoz taşınmasının altında yatan mekanizmayı incelemek için de kullanılmıştır. Laboratuvarımız intestinal epitel hücrelerinde transsellüler ve parasellüler transporta odaklanmaktadır. Ussing odası yöntemi kullanılarak, hidrolize edilemeyen dipeptid glisilsarkozinin emilimini ölçmek için Ussing odaları kullanılarak, parasellüler sodyum taşınımını bozan Claudin 15 nakavt farelerinde peptid taşınması değerlendirildi. Luminal Na+ homeostazının proton kuplajlı peptid transportu için önemli olduğu bulunmuştur4. Ek olarak, bu odalar ayrıca serin proteaz tripsin5 tarafından proteinaz aktive edilmiş reseptör 1'in submukozal aktivasyonuna yanıt olarak murin çekumdaki anyon sekresyonunu araştırmak için de kullanılmıştır.

Ussing odaları son zamanlarda epitel dokusundaki parasellüler yolları değerlendirmek için de kullanılmaktadır. Parasellüler yollar, iki veya daha fazla hücrenin buluştuğu noktada oluşan protein kompleksleri olan sıkı kavşaklarla düzenlenir6. Bariyer fonksiyonu ve iyon seçiciliği (anyonların veya katyonların seçici olarak sıkı kavşaktan geçip geçemeyeceği), claudin ailesi proteinlerinin varlığı ile belirlenir; bazıları bariyer görevi görür (claudin 3 ve 7), anyon gözenekleri (claudin 10a) veya katyon gözenekleri (claudin 2, 10b ve 15)7. Parasellüler yolu değerlendirmek için, kan plazması FITC konsantrasyonu8 veya EDTA-Cr9 eşliğinde FITC'nin oral gavajı gibi diğer yöntemler kullanılmıştır; Bununla birlikte, bu teknikler daha düşük çözünürlüktedir ve iyon seçiciliğini veya bağırsak sistemi bölümlerinin belirli bir bölümünü değerlendiremez. Bununla birlikte, ussing odaları, hedef iyonların seyreltme potansiyelini değerlendirmek ve bu nedenle sıkı bağlantıların iyon seçiciliğini belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, NaCl ile, Na + ve Cl- için sıkı bağlantıların seçiciliği, membranın bir tarafının (genellikle mukozal taraf) seyreltilmesi ve transepitelyal potansiyel farkındaki değişimin ölçülmesiyle hesaplanabilir. Na+ ve Cl- bağıl geçirgenlikleri Goldman-Hodgkin-Katz denklemi10 ile tahmin edilebilir ve sıkı bağlantının seçiciliği Kimizuka-Koketsu denklemi11 kullanılarak tahmin edilebilir. Bu nedenle, bu odalar, dokunun elektrofizyolojik parametrelerini ölçme avantajına sahiptir ve sonuç olarak, iyonların sıkı bağlantılardan geçişi hakkında diğer düşük çözünürlüklü yöntemlerden daha fazla bilgi sağlar.

Ussing odası yöntemi sadece bağırsak sistemi ile sınırlı değildir, bağırsakla ilgili çalışmalarda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, başka birçok uygulaması da vardır. Örneğin, bu odalar Kistik Fibrozis'i ve özellikle klorür kanalı kistik fibroz transmembran iletkenlik regülatörünü (CFTR) incelemek için kullanılmıştır12. Kistik Fibrozis, CFTR13'teki bir mutasyondan kaynaklanır, bu da bozulmuş klorür sekresyonu ve solunum epitel hücreleri tarafından sıvı taşınması ve bunun sonucunda daha kalın, daha kuru bir mukoza tabakası ile sonuçlanır14. Hava yolu epitelyal CFTR'nin incelenmesi, sadece hastalığı anlamak için değil, aynı zamanda hastalığı tedavi etmenin yollarını keşfetmek için bu odalarla gerçekleştirilmiştir. Örneğin, Kistik Fibrozise neden olan nadir mutasyonları olan hastalarda, Orkambi ve bir amplifikatör ko-terapisi gibi tedavileri test etmek için hasta solunum epitel hücrelerinin analizi kullanılmıştır15.

Ussing odaları, ilaç alımını ve farmakokinetiği incelemek için insan biyopsi dokusu gibi ilaç dağıtım yollarını incelemek için de kullanılmıştır16. Bağırsak alımı, ilaç dağıtımının tek yolu değildir. Bu odalar ayrıca nazal ilaç dağıtım sistemlerini incelemek için de kullanılmıştır17. Göz için Ussing odaları ile ilaç dağıtım çalışmaları da yapılmıştır. Tavşan korneasında, ilaçların dokular arasında emilimini artırmak için tasarlanmış bir ilaç olan Labrasol ile geçirgenlik ve alım çalışmaları yapılmıştır18. Başka bir çalışmada, benzilalkonyum klorürün tavşan sklerasında transskleral ilaç dağıtımı üzerindeki etkisi incelenmiştir19.

Ussing odası yöntemi yararlıdır çünkü doğal doku kullanılabilir. Bu nedenle, Caco-2 hücre hatları gibi in vitro modellere göre tercih edilir. Bununla birlikte, teknik numuneleri hazırlamak için beceri ve zaman gerektirir, bu nedenle yüksek verimli uygulamalar için uygun değildir. Hücre monokatmanlarının elektrofizyolojik özellikleri, bu odalardaki hücre kültürü ekleri kullanılarak incelenebilir. Son keşifler, epitel veya endotel kök hücrelerinin toplanmasından kültürde yetiştirilen mini organlar olan organoidlerin kültürüne izin vermiştir20. Organoid kültürü, tek katmanlı olarak yetiştirilmek üzere manipüle edilebilir, böylece organoidlerin bir Ussing odasına monte edilmesini mümkün kılar21. Çeşitli epitel ve endotel dokularının organoidleri incelenebilir, bu da organoid kültür uzun vadede korunabileceğinden, gerekli hayvan sayısını azaltır. Bu aynı zamanda zaman alıcı ve zahmetli doku diseksiyonu ve hazırlık adımlarına ihtiyaç duyulmayacağından verimi de artıracaktır. Gelecekte, Ussing odası çalışmaları doku naklini incelemek için çok yararlı olmaya devam edecek ve özellikle kişiselleştirilmiş tıp alanında önemli olacaktır.

Aşağıdaki protokol, NaCl'nin seyreltme potansiyelini ölçerek Claudin 15 nakavt (Cldn15-/-) farelerinin ve vahşi tip (WT) kontrollerin ince bağırsağındaki sıkı bağlantıların geçirgenlik ve bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için Ussing odası yönteminin uygulanmasını göstermektedir. Epitel ve endotel dokusunda iki veya daha fazla hücrenin buluştuğu noktada sıkı kavşaklar (TJ) oluşur. İki hücreli sıkı kavşakların (bTJ), özellikle bTJ içinde bulunan claudin ailesi proteinlerinin, TJ7'nin bariyer fonksiyonunu ve permselectivity'sini belirlediği düşünülmektedir. Cldn15-/- fareler mega ince bağırsağa22 sahiptir ve claudin 154,23,24 yoluyla meydana gelen bağırsak Na + geri dönüşümünün kaybı nedeniyle besin alım kabiliyeti azalır. Cldn15-/- fareler Na + homeostazını bozmuştur, bu da onları TJ'nin geçirgenliğini incelemek için ilginç bir model haline getirmektedir. Aşağıdaki protokol, orta ince bağırsaktaki NaCl'nin (PNa / PCl) seyreltme potansiyelini ölçerek TJ'nin NaCl'ye geçirgenliğini değerlendirir. Kısaca, membranın bir tarafının seyreltilmesiyle ortaya çıkan membran potansiyel farkındaki değişim (M tarafı veya S tarafı, her ikisi de aşağıdaki protokolde ölçülmüştür), Na + (PNa) ve Cl- (PCl) geçirgenliğini hesaplamak için kullanılabilir ve seyreltme potansiyeli (PNa / PCl), sıkı bağlantının katyonik veya anyonik bir seçiciliğe sahip olup olmadığını gösterecektir.

Bu protokoldeki deneyler, bağırsak preparatının dikey olarak monte edildiği iki yarıdan oluşan özelleştirilmiş bir Ussing odası (Şekil 1A), voltaj kelepçesi amplifikatörü, elektrik kaydedici, elektrotlar, tuz köprüleri, Ringer çözeltisi, HEPES tamponu (150 mM NaCl), seyreltilmiş HEPES tamponu (75 mM NaCl), bağırsak hazırlığı (ekipman hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneylerde kullanılan tüm hayvanlar Shizuoka Üniversitesi'ndeki hayvan bakım tesisinde tutuldu ve deneyler Shizuoka Üniversitesi tarafından belirlenen hayvan araştırmaları kılavuzlarına göre gerçekleştirildi. Tüm deneyler, Shizuoka Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayıyla gerçekleştirildi (İzinler #205272 ve #656-2303).

1. NaCl elektrotlarının hazırlanması

NOT: Bu deneylerde kullanılan elektrotlar konsantre NaCl veya KCl'den oluşur. KCl/calomel elektrotları ticari olarak satın alınmaktadır. Deneye başlamadan önce, tüm elektrotların konsantre NaCl veya KCl çözeltisi ile en üste kadar doldurulduğundan emin olun.

  1. Plastik kapaklı küçük cam kavanozlar hazırlayın (hacim 20 mL).
  2. Plastik kapaklarda, biri NaCl tuz köprüsü (2,5 mm çaplı), diğeri gümüş tel (1 mm çap; Şekil 1C, NaCl elektrodu).
  3. Cam kavanozu doymuş NaCl çözeltisi ile doldurun (dolana kadar yaklaşık 15 mL).
  4. Kavanozun içine gümüş tel (0,8 mm çaplı, 7 cm uzunluğunda) yerleştirin, ancak kavanozun dışındaki tel kısmının timsah klipsleri (küçük boyutlu) aracılığıyla amplifikatör sistemine bağlanabildiğinden emin olun.
  5. Kullanılmadığında, elektrotları sarın ve kurumayı önlemek için deliklerin parafilm ile kaplandığından emin olun.

2. Tuz köprülerinin hazırlanması

NOT: Katılaşmak için yeterli zaman sağlamak üzere deneyden en az bir gün önce tuz köprüleri hazırlayın. Tuz köprüleri tekrar tekrar kullanılabilir ancak 2 ay sonra kullanılması önerilmez.

  1. NaCl tuz köprüleri
    1. #7 polietil boru (dış çap 2,3 mm, iç çap 1,3 mm), 19 G iğne ve kilit tipi şırınga, 200 mL 1 M NaCl çözeltisi, 2 g agar, tuz köprüsü depolaması için kapatılabilir plastik kap hazırlayın.
    2. Ussing odası kurulumu için gerekli boyuta kadar boruyu keserek uygun sayıda tuz köprüsü hazırlayın (her oda iki tuz köprüsü gerektirir).
    3. Agar enjeksiyonundan önce, tüplerle bir U şekli yapın ve bunları ılık su kabına yerleştirin (tuz köprüleri kurmak için kolay bir şekil oluşturmak için).
    4. 11.688 g NaCl'yi 200 mL'de deiyonize suda çözerek 200 mL 1 M NaCl yapın.
    5. 1 M NaCl'yi 100 mL'lik porsiyonlara bölün: 1 M NaCl'de 100 mL'lik %2 agar yapın (NaCl'de 2 g agar karıştırın, çözünmesi için mikrodalgada ısıtın).
    6. 19 G'lık bir iğne ve kilitleme şırıngası kullanarak, şırıngayı 1 M NaCl / agar çözeltisi ile doldurun. Çözeltiyi damla damla atmaya yavaşça başlayın ve bunu yaparken iğneyi tüpün bir ucuna yerleştirin ve karışım diğer taraftan çıkana kadar doldurun.
    7. Çözeltiyi ifade ederken iğneyi yavaşça geri çekin ve gerekli tüm tuz köprüleri yapılana kadar tekrarlayın. (Çözelti şırıngada veya iğnede katılaşırsa, çözelti tekrar ifade edilene kadar sıcak suda kısaca ısıtın.)
    8. Kabarcık olmadığından emin olmak için tuz köprülerini kontrol edin ve kalan 1 M NaCl çözeltisini kapatılabilir bir kapta saklayın.
  2. KCl tuz köprüleri
    NOT: Tuz köprüsü uçları çözülebildiğinden ve K+ tampona sızabildiğinden, tampondaki K+ konsantrasyonunun artmasını önlemek için KCl agar köprüleri için daha ince borular kullanılır.
    1. #3 polietil boru (dış çap 1.0 mm, iç çap 0.5 mm), 23 G iğne ve kilit tipi şırınga, 200 mL 1 M KCl çözeltisi, 2 g agar, tuz köprüsü depolaması için kapatılabilir plastik kap hazırlayın.
    2. Boruyu Ussing odası kurulumu için gerekli boyuta kadar keserek uygun sayıda tuz köprüsü hazırlayın (her oda iki tuz köprüsü gerektirir).
    3. 200 mL deiyonize suda 14.91 g KCl'yi çözerek 200 mL 1 M KCl yapın.
    4. İki 100 mL porsiyona bölün: 1 M KCl'de 100 mL% 2 agar yapın (KCl'de 2 g agar karıştırın, çözünmesi için bir mikrodalgada ısıtın).
    5. 23 G'lik bir iğne ve kilitleme şırıngası kullanarak, NaCl tuz köprülerinde olduğu gibi% 2 agar 1 M KCl karışımı (tüplerin tamamen dolu olduğundan ve kabarcık olmadığından emin olun) ile boru enjekte edin.
    6. Kabarcık olmadığından emin olmak için tuz köprülerini kontrol edin ve kalan 1 M KCl çözeltisinde kapatılabilir bir kapta saklayın.

3. Ringer çözeltisinin ve HEPES tamponunun hazırlanması

NOT: Ussing odasına monte edilen dokuya bağlı olarak, Ringer çözeltisinin bileşenleri farklı olabilir. Burada sunulan tarifler ince ve kalın bağırsaklara özgüdür.

  1. Ringer'ın çözeltisini Tablo 1'de açıklandığı gibi deneylerin yapıldığı gün taze yapın.


  4. Elektrokimyasal denklem: Potansiyel fark hesaplaması için Nernst denklemi formülü, V=RT/Fln[(α+β)/(1+αβ)].
    Geçirgenlik oranı denklemi; β = PCl/PNa = (α-x)/(αx-1); iyon seçiciliği çalışmasında formül.
    Termodinamik analiz için üstel denklem x=e^(-VF/RT), matematiksel formül.
    İyon geçirgenliği hesaplaması için denklem; iyon taşıma mekaniğini gösteren formül; Bilimsel analiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede gösterilen sonuçlar, tamamlanmış daha büyük bir projenin parçası olan sonuçlardır (bkz. ref.4,23,24).

Cldn15-/- farelerde ince bağırsağın transepitelyal elektriksel iletkenliği azalır .
Cldn15-/- farelerde orta ince bağırsak segmentinin temel transmukozal iletkenliği (kısa devre ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneyde, Cldn15-/- ve WT farelerinin ince bağırsağında NaCl'nin temel elektriksel parametrelerini ve seyreltme potansiyelini ölçmek için Ussing odaları kullanıldı. Ussing odası deneyleri yaparken, deneylerde kullanılan membran preparatının uygulanabilir olduğunu doğrulamak çok önemlidir. Bu genellikle glikoz veya adenilat siklaz aktivatörü forskolin eklenerek ve Isc'de uygun bir artış olup olmadığını görerek yapılır (farelerde 100-300 μA / cm2). Bağırsak preparatının ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak potansiyel çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma 17K00860 (HH'ye) ve 19K20152 (NI'ye) tarafından desteklenmektedir. WH, Otsuka Toshimi Burs Vakfı'na 2018-2021 yılları arasındaki finansal destekleri için teşekkür eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
# 3 polietil boruHibikidış çap 1.0 mm; iç çap 0,5 mm
# 7 polietil boruHibikidış çapı 2,3 mm; iç çap 1,3 mm
10 mL kilitleme şırıngasıTerumoSS-10LZDoldurma sırasında iğnenin yerinden çıkmasını önlemek için kilitleme şırıngaları gereklidir
19 g iğneTerumoNN-1938Rİğnelerle çalışırken lütfen dikkatli olun ve keskin bir kaba atın
23 g iğneTerumoNN-2332RLütfen iğnelerle çalışırken dikkatli olun ve kesici alet kabına atın
5 mm zımbaNANA Filtrekağıdı ve parafilm
akupunktur iğnelerindeSeirinNSDokuyu diseksiyon plakası Agar'a sabitlemek için diseksiyon pimleri olarak kullanılır
Fujifilm Wako010-15815
Timsah klipsleriNANAElektrodu amplifikatöre bağlar
CaCl2Fujifilm Wako038-00445
D(-)-MannitolFujifilm Wako133-00845Bu, seyreltme HEPES tamponu
D(+)- GlikozFujifilm Wako049-31165
Diseksiyon kitiİhtiyacınız olacak, makas ve kavisli forseps
Diseksiyon plakaları10 cm hücre kültürü plakaları kullandık ve silikon kauçuk ile kaplandık
DMSOSigma472301-500MLForskolin stoğu yapmak için
Elektrik kaydediciTOA ElektronikPRR-5041Diğer eşdeğer elektrik kayıt cihazları ticari olarak temin edilebilir
Epitel gerilim kelepçesi amplifikatörüNihon KohdenCEZ9100Diğer eşdeğer amplifikatörler ticari olarak
mevcuttur filtre kağıdı, kareler halinde kesilmişNANA5 mm'lik bir zımba ile delinmiş, bağırsak hazırlığını tutmak için kullanılır
ince forsepsHızlı GenFG-B50476Kas tabakasının künt diseksiyonu için
ForskolinAlomone LabsF-500DMSO'da 10 mM stok yapın, nihai konsantrasyon 10 & mikro olacaktır; M
HEPESSigmaH4034-1KG
İndometasinSigmaI7338-5G21 mM NaHCO3'te 1 mM stok yapın, nihai konsantrasyon 10 &mikrodur; M
K < alt > 2 < / alt >HPO< alt > 4 < / alt >Fujifilm Wako164-04295
KClFujifilm Wako163-03545
KCl / kalomel elektrotAsch Japan Co.SCE-100
KH2< / sub>PO4< / sub>Kanto kimyasal32379-00
L (+) - GlutaminFujifilm Wako074-00522
MgCl < alt > 2 < / alt >Fujifilm Wako135-00165
Karışık Gaz (% 95 O < alt > 2 < / alt >% 5 CO< alt > 2 < / alt >)Shizuoka Oksijen ŞirketiZil çözeltisi NaCl kullanılırken Zil çözeltisi ve hazneleri köpürtmek için kullanılır
Fujifilm Wako191-01665
NaCl elektrotNANA KonsantreNaCl ve Gümüş tel gerektiren el yapımı elektrotlar
NaHCO3Fujifilm Wako191-01305
O2 GazShizuoka Oksijen ŞirketiHEPES tampon parafilm kullanılırken köpürme odaları için kullanılır
BemisPM-996Ussing odalarının sızdırmazlığına yardımcı olmak için kullanılır
pH metreDKK-TOA CorpHM-305HEPES tamponunun 37 °C'de pH 7.4'e ayarlanması gerekir; C
pH metre elektroduDKK-TOA CorpGST-5311C
silikon kauçukShinetsu ChemicalKE-12Diseksiyon plakalarını doldurmak için kullanılır
gümüş telNaCl elektrotları yapmak için kullanılır
Plastik kapaklı küçük kavanozlarNANANaCl elektrotları için kullanın
stereomikroskopZeissStemi 305Bir stereomikroskop derinliği görmenizi sağlar, böylece dokuyu daha kolay inceleyebilirsiniz
Tris (Trizma tabanı)SigmaT1503-1KGHEPES tamponlarının pH'ını ayarlamak için 1M'lik bir çözelti yapın
Ussing odalarıSanki Kagaku KougeiBu odalar özel yapım sürekli perfüzyondur Pencere çapı 5 mm olan Ussing odaları
Su pompası ve ısıtma sistemiTokyo Rikakikai Co., Ltd.NTT-110
delikler açmak için kullanın Serisi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
  2. Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3', 5'-AMP. American Journal of Physiology - Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
  3. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
  4. Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology - Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
  5. Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
  6. Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907(2010).
  7. Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
  8. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032(2018).
  9. Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
  10. Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
  11. Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
  12. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
  13. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
  14. Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
  15. Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
  16. Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, John Wiley & Sons, Inc. 1-19 (2017).
  17. Östh, K. The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery - Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , Uppsala University. Dissertation thesis (2002).
  18. Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
  19. Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703(2005).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  21. Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
  22. Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
  23. Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376(2020).
  24. Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
  25. Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
  26. Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
  27. Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
  28. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
  29. Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
  30. Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ussing Chamber TechniqueTight JunctionsIntestinal TissueIon PermeabilityFunctional AssessmentPermselectivityPhysiological PropertiesClaudin 15 Knockout MiceTissue PreparationMucosal LayerFilter Paper MountingHEPES BufferReal time MeasurementEpithelial Studies