Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Kemik iliği megakaryositleri kan trombositlerinin üretimini sağlayan büyük poliploid hücrelerdir. Megakaryopoez yoluyla hematopoetik kök hücrelerden kaynaklanırlar. Bu sürecin son aşamaları karmaşıktır ve klasik olarak bipotent Megakaryosit-Eritrosit Progenitors (MEP) ve tek kişilik Megakaryosit Progenitors 'u (MKp) içerir. Bu popülasyonlar iyi niyetli megakaryositlerin oluşumundan önce gelir ve bu nedenle izolasyonları ve nitelemeleri megakaryosit oluşumunun sağlam ve tarafsız analizine izin verebilir. Bu protokol, fare kemik iliğinden hematopoetik hücreleri toplama prosedürünü, hematopoetik progenitörlerin manyetik tükenme yoluyla zenginleştirilmesini ve son olarak yüksek oranda saflaştırılmış MEP ve MKp popülasyonları veren bir hücre sıralama stratejisini ayrıntılı olarak sunar. İlk olarak, kemik iliği hücreleri femurdan, kaval kemiğinden ve ayrıca yüksek sayıda hematopoetik progenitör içeren bir kemik olan iliak arktan toplanır. İlyak tepe kemiklerinin kullanımı, fare başına elde edilen toplam hücre sayısını büyük ölçüde arttırır ve böylece hayvanların daha etik bir şekilde kullanılmasına katkıda bulunur. Manyetik soy tükenmesi, akış sitometrisine göre çok verimli bir hücre sıralamaya izin vererek 450 nm manyetik boncuk kullanılarak optimize edildi. Son olarak, protokol iki yüksek saflaştırılmış megakaryosit progenitör popülasyonunun sıralanması için etiketleme ve gating stratejisini sunar: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim)ve MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9parlak ). Bu tekniğin uygulanması kolaydır ve i) kimlikleri ve biyolojileri hakkında daha derin bir bilgi için moleküler karakterizasyon, ii) megakaryositlerin olgunlaşma mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacak in vitro farklılaşma tahlilleri veya iii) mikroçevrimle etkileşimin in vitro modellerini gerçekleştirmek için yeterli hücresel materyal sağlar.
Giriş
Kan trombositleri megakaryositler tarafından üretilir. Bu büyük poliploid hücreler kemik iliğinde bulunur ve tüm kan hücrelerine gelince Hematopoetik Kök Hücrelerden (HSC) türetilirler1. Kemik iliğindeki megakaryositlerin klasik üretim yolu HSC'den kaynaklanır ve farklılaşma potansiyellerini giderek kısıtlayan farklı ataların neslini içerir2. Megakaryosit soyuna bağlılığı imzalayan ilk ata, hem eritroid hücreleri hem de megakaryositler3,4,5 üretebilen bir bipotent progenitör olan Megakaryosit-Eritrosit Progenitor'dur(MEP). MEP d....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanları içeren protokoller, CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) uyarınca gerçekleştirildi. İzin Numarası: E67-482-10).
1. Fare kemiği koleksiyonu
- Hayvanı kurumsal yönergelere uygun olarak kurban edin.
NOT: Bu yazıda sunulan veriler 8 ila 12 haftalık C57Bl/6 farelerden elde edilmiştir. Elde edilen hücre sayısı ve atıf yapılan popülasyonların sıklığı yaş ve fare zorlanmasına göre değişebilir. - Vücuda% 70 etanol püskürtün.
- Makas kullanarak, omurgaya dik olan cildin 0,5-1 cm'lik bir kesisini yapın ve cildi tüm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MEP ve MKp olarak tanımlanan hücrelerin fenotipik analizi akış sitometrisi ile yapıldı. Hücreler, megakaryositik ve trombosit soylarının klasik belirteçleri olan CD41a ve CD42c'ye floresan konjuge antikorlarla etiketlendi. Her iki belirteç de MKp popülasyonunun hücreleri tarafından ifade edilirken, bu belirteçler MEP popülasyonunun hücrelerinin yüzeyinde henüz tespit edilmiştir (Şekil 4Ai,4Aii). Poliploidi megakaryositlerin ayırt edici özelliğidir. Sıralanmış popülasyonların.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede açıklanan yöntem, fare MEP ve MKp'nin çıkarılmasına ve saflaştırılmasına izin verir. Protokolün optimizasyonunda önemli bir parametre, çoğu moleküler ve hücresel tabanlı tahlille uyumlu yeterli sayıda hücre elde etmekti. Hematopoetik hücre ekstraksiyonu için fare kemiği toplamanın genel uygulaması genellikle her farenin hem uyluk kemiğinin hem de kaval kemiğinin toplanmasından oluşur. Hematopoetik malzemenin başka bir kaynağı olan pelvik kemik, bu nedenle sıklıkla göz ardı edilir. İlyak armasını toplamamanın .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar monique Freund, Catherine Ziessel ve Ketty'ye teknik yardım için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) ve Grant ANR-17-CE14-0001-01 tarafından Henri.de la'ya desteklendi. Salle.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 21 gauge iğneler | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antikor Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Manyetik tükenme |
| Antikoru B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Manyetik tükenme |
| Antikoru Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Manyetik tükenme |
| Antikoru CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Manyetik tükenme |
| Antikoru CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Manyetik tükenme |
| Antikoru CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Manyetik tükenme |
| Antikoru CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Manyetik tükenme |
| Antikoru TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Manyetik tükenme |
| Antikoru CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Manyetik tükenme |
| Antikoru CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Hücre sıralama |
| Antikoru CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Hücre sıralama |
| Antikoru TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Hücre sıralama |
| Antikor CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Hücre sıralama |
| Antikoru CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Hücre sıralama |
| Antikoru CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Hücre sıralama |
| Antikoru ve c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Hücre sıralama |
| Antikoru Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Hücre sıralama |
| Antikoru CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Hücre sıralama |
| Antikoru CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Hücre sıralama |
| Kültür ortamı StemSpan-SFEM | Kök hücre teknolojileri | # 09650 | |
| Diseksiyon pedi | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Yaşam Teknolojileri | 14190-094 | |
| Etanol | vWR Kimyasalları | 83813.360 | |
| Forseps | Euronexia | P-120-AS | |
| Cam pastör pipeti | Dutscher | 42011 | |
| Mıknatıs : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Manyetik boncuklar: Dynabeads Koyun Anti-Sıçan IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Kök Hücre teknolojileri | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Kök hücre teknolojileri | #03436 | |
| Yenidoğan Buzağı Serumu | Dutscher | 50750-500 | |
| Kırmızı Hücre Lizisi çözüm | BD Bioscience | 555899 | |
| Neşterler | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Makas | Euronexia | C-165-ASB | |
| Steril 1 mL şırıngalar | BD Bioscience | 303172 | |
| Steril 15 mL tüpler | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Steril 5 mL polipropilen tüpler | Falcon | 352063 | |
| Steril 5 mL polistiren tüpler | Falcon | 352054 | |
| 70 mikro& ile steril tüpler; m hücreli süzgeç kapağı | Falcon | 352235 | |
| Steril petri kabı | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Hücre sıralama |
| Tüp silindiri | Benchmark Scientific | R3005 |
Kaynaklar
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
