Haemophilus influenzae solunum yollarında inflamasyona neden olur. Bu makalede, bu bakteriye yanıt olarak fagositler ve lenfositler tarafından immün yanıtları tanımlamak için akım sitometrisi ve konfokal mikroskopinin kullanımı üzerinde durulacaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Haemophilus Influenzae'ye Solunum İmmün Yanıtlarının Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Haemophilus influenzae (Hi), çeşitli solunum koşullarında bulunan yaygın bir bakteridir. Bu bakteriye solunum immün / enflamatuar yanıtı değerlendirmek için çeşitli farklı tahliller / teknikler kullanılabilir. Akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi, biyolojik yanıtların ayrıntılı karakterizasyonunu sağlayan floresan tabanlı teknolojilerdir. Hücre duvarı bileşenleri, öldürülmüş / inaktive edilmiş preparatlar ve canlı bakteriler dahil olmak üzere Hi antijeninin farklı formları kullanılabilir. Hi, zenginleştirilmiş ortam gerektiren titiz bir bakteridir, ancak standart laboratuvar ortamlarında yetiştirilmesi genellikle kolaydır. Hi ile stimülasyon için doku örnekleri periferik kan, bronkoskopi veya rezeke akciğerden elde edilebilir (örneğin, akciğer kanseri tedavisi için ameliyat edilen hastalarda). Makrofaj ve nötrofil fonksiyonu, fagositoz, reaktif oksijen türleri ve hücre içi sitokin üretimi dahil olmak üzere ölçülen çeşitli parametrelerle akış sitometrisi kullanılarak kapsamlı bir şekilde değerlendirilebilir. Lenfosit fonksiyonu (örneğin, T hücresi ve NK hücre fonksiyonu), esas olarak hücre içi sitokin üretimi için akış sitometrisi kullanılarak spesifik olarak değerlendirilebilir. Hi enfeksiyonu, hem nötrofiller (NET'ler) hem de makrofajlar (MET'ler) tarafından hücre dışı tuzak üretiminin güçlü bir indükleyicisidir. Konfokal mikroskopi, proteaz aktivitesini değerlendirmek için de kullanılabilecek NET ve MET ekspresyonunu değerlendirmenin tartışmasız en uygun yoludur. Haemophilus influenzae'ye karşı akciğer bağışıklığı, akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirilebilir.
Giriş
Haemophilus influenzae (Hi), çoğu sağlıklı yetişkinin farenksinde bulunan normal bir kommensal bakteridir. Hi, polisakkarit kapsüle sahip olabilir (A-F tipleri, örneğin B veya HiB tipi) veya bir kapsülden yoksun olabilir ve yazılamaz (NTHi)1. Mukozanın bu bakteri ile kolonizasyonu erken çocukluk döneminde başlar ve farklı kolonize edici suşların devrivardır 2. Bu bakteri aynı zamanda hem üst hem de alt solunum yollarının istilasını da yapabilir; bu bağlamda immün yanıtın aktivasyonunu ve inflamasyonu indükleyebilir 3,4. Bu inflamatuar yanıt klinik hastal....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma Monash Health'in insan araştırma etik komitesi tarafından onaylandı. Protokol, insan araştırma etik komitesinin yönergelerini takip eder.
1. Antijenik preparat
NOT: Hi'ye karşı immün yanıtı değerlendirmek için üç farklı antijenik preparat kullanılabilir. Bunlar 1) bir hücre altı bileşenidir (tipik olarak bakteriyel hücre duvarından); 2) öldürülmüş ve etkisiz hale getirilmiş bakteriler; ve 3) canlı bakteriler. Herhangi bir deneyin başlatılmasından önce her antijenik preparatın kullanımını belirleyin.
- Alt hücre bileşenleri
- Ticari preparatlar, şirket içi geliştirilmiş bileşenler ve / veya....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Temsili sonuçlar, NTHi'ye inflamatuar immün yanıtların akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi ile nasıl değerlendirilebileceğini / nicelleştirilebileceğini göstermektedir. Sonuçların yorumlanmasının önemli bir kısmı, kontrol ve uyarılmış numuneler arasındaki floresan karşılaştırmasıdır. Numunelerin boyanmasını optimize etmek için genellikle bir dizi ön deney gereklidir. Aynı anda kaç farklı rengin incelenebileceği, akış sitometresi / konfokal mikroskopta bulunan kanal sayısına bağlı olacaktır. 1) ROS üretiminin, 2) insa.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada listelenen yöntemler, Hi'ye inflamatuar akciğer yanıtı hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için birlikte kullanılabilecek floresan bazlı akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi tekniklerini kullanır.
Kullanılacak Hi'nin uygun antijenik formülasyonunun oluşturulması kritik öneme sahiptir ve bu konuda bir mikrobiyologdan spesifik girdi alınması tavsiye edilir. Live Hi daha güçlü bir tepki verirken, öldürülen Hi preparatları ve Hi bileşenleri daha standartlaştırılmıştır ve depolanması daha ko.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Monash Health'teki Klinik İmmünoloji personeline bu çalışmadaki yardımları için teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Amonyum klorür | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI uzun süreli altın | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon steril naylon örgü | Becton Dickinson | 340606 | |
| Jelatin substrat, Enzchek | Moleküler problar | E12055 | |
| MACS karışım tüpü döndürücü | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Katalog numarası mevcut değil | |
| Medicons 50 µ m | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iyodür | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slaytları | Thermofisher | 11562203 |
Kaynaklar
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
