Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli

3.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62617

⸱

22 Eylül 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine, 2Department of Pharmacology and Physiology, Drexel University College of Medicine, 3Department of Radiation Oncology, Thomas Jefferson University, 4Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

Bu makalede

Özet

Meme kanseri beyin metastatik hücrelerinin gerçek zamanlı ilaç ve radyasyon yanıtını ölçmek için organotipik bir beyin dilimi modelinde bir protokol sunuyoruz. Yöntemler, çeşitli tedavilerin meme kanserinden beyin metastazları üzerindeki terapötik etkilerini, beyin mikroçevre arayüzü içinde ex vivo bir şekilde araştırmak için nicel bir test sağlar.

Özet

Beyin metastazı, kadınlar için meme kanserinin ciddi bir sonucudur, çünkü bu tümörlerin tedavisi zordur ve kötü klinik sonuçlarla ilişkilidir. Meme kanseri beyin metastatik (BCBM) büyümesinin klinik öncesi fare modelleri yararlıdır, ancak pahalıdır ve beyin parankimi içindeki canlı hücreleri ve tümör hücresi invazyonunu izlemek zordur. Burada, intrakraniyal olarak enjekte edilen meme kanseri beyin arayan klonal alt hatları içeren ksenograflanmış farelerden ex vivo beyin dilimi kültürleri için bir protokol sunulmaktadır. MDA-MB-231BR lusiferaz etiketli hücreler, Nu/Nu dişi farelerin beyinlerine intrakraniyal olarak enjekte edildi ve tümör oluşumunu takiben, beyinler izole edildi, dilimlendi ve ex vivo kültüre alındı. Tümör dilimleri, lusiferaz eksprese eden tümör hücrelerini tanımlamak ve beyin parankimindeki proliferasyonlarını ve istilalarını 10 güne kadar izlemek için görüntülendi. Ayrıca, protokol, iyonlaştırıcı radyasyon veya kemoterapi ile tedaviyi takiben tümör hücrelerinin büyümesini ve invaziv davranışını görüntülemek için hızlandırılmış mikroskopinin kullanımını açıklar. Tümör hücrelerinin tedavilere yanıtı, canlı görüntüleme mikroskopisi, biyolüminesans yoğunluğunun ölçülmesi ve BCBM hücrelerini içeren beyin dilimi üzerinde histoloji yapılması ile görselleştirilebilir. Bu nedenle, bu ex vivo dilim modeli, bireysel bir hastanın meme kanseri beyin metastatik büyümesini beyin mikro ortamında hedeflemek üzere kişiselleştirilmiş ilaçları tanımlamak için tek başına veya radyasyonla kombinasyon halinde yeni terapötik ajanların hızlı bir şekilde test edilmesi için yararlı bir platform olabilir.

Giriş

Meme kanseri beyin metastazları (BCBM), hücreler birincil meme tümöründen beyne yayıldığında gelişir. Meme kanseri, akciğer kanserinden sonra beyin metastazının ikinci en sık nedenidir ve metastazlar hastaların %10-16'sında görülür1. Ne yazık ki, beyin metastazları, hastaların %>80'i beyin metastazı tanısından sonraki bir yıl içinde öldüğü ve nörolojik işlev bozuklukları nedeniyle yaşam kalitelerinin bozulduğu için tedavi edilemez olmaya devam etmektedir2. Daha etkili tedavi seçeneklerinin belirlenmesi için acil bir ihtiyaç vardır. Tek katmanlı iki boyutlu veya üç boyutlu kültür modelleri, terapötik ajanların laboratuvarda test edilmesinde en sık kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, tümör fenotipinin ve büyümesinin önemli bir itici gücü olan karmaşık BCBM mikro ortamını taklit etmezler. Bu modeller yararlı olmasına rağmen, karmaşık tümör-stromal etkileşimleri, benzersiz metabolik gereksinimleri ve tümörlerin heterojenliğini yakalamaz3. Tümör-stromal etkileşimleri ve mikroçevre heterojenliğini daha sadık bir şekilde özetlemek için, grubumuz ve diğerleri, hasta kaynaklı tümör hücreleri (birincil veya metastatik) veya kanser hücresi hatları 4,5,6 ile organotipik beyin metastazı "dilim" kültürleri üretmeye başlamıştır. Klasik in vitro sistemlerle karşılaştırıldığında, bu kısa süreli ex vivo model, büyük hayvan kohortlarında klinik öncesi değerlendirmeden önce yeni terapötiklerin taranması için daha uygun koşullar sağlayabilir.

Ex vivo modelleri, öncelikle çeşitli kanserlerin başarılı tedavilerinin tanımlanması için inşa edilmiş ve başarıyla kullanılmıştır. Birkaç günlük değerlendirme gerektirirler ve ayrıca hastaya özgü ilaç taramasına uyarlanabilirler. Örneğin, insan mesane ve prostat kanseri ex vivo dokuları, dosetaksel ve gemsitabin7'nin doza bağımlı bir anti-tümör yanıtı göstermiştir. Kemoterapötik ilaçlar Oxaliplatin, Cetuximab ve Pembrolizumab8'i taramak için benzer kolorektal karsinom ex vivo dokular geliştirilmiştir. Bu uygulama pankreas kanserinde, pankreatik duktal adenokarsinomun stromal ortamı ile genotipik ve fenotipik özellikleri arasındaki temel etkileşim göz önüne alındığında yaygın olarak kullanılmaktadır 9,10. Ayrıca, baş, boyun, gastrik ve meme tümörlerinde benzer taramalar için bu tür organotipik modeller geliştirilmiştir11,12.

Burada, mikro-ortamlarındaki ksenograflanmış meme kanseri beyin metastatik tümör hücrelerinin ex vivo beyin dilim modeli üretilmektedir. Farelere, TNBC metastazı 14,15'in ortak bir bölgesi olan serebral korteks parietal lobunda meme kanseri beyin metastatik beyin trofik MDA-MB-231BR hücreleri 13 ile intrakraniyal olarak enjekte edildi ve tümörlerin gelişmesine izin verildi. Beyin dilimleri bu ksenograflanmış hayvanlardan üretildi ve 16,17'de tanımlandığı gibi organotipik kültürler olarak ex vivo tutuldu. Bu yeni ex vivo model, BCBM hücresinin beyin parankimi içindeki büyümesinin analizine izin verir ve beyin mikro ortamındaki tümör hücreleri üzerindeki terapötik ajanları ve radyasyon etkilerini test etmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve hayvan bakım kılavuzlarına uygundur. Bu çalışmada Nu/Nu atimik dişi fareler (6-8 haftalık) kullanılmıştır.

1. Tümör hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyonu

  1. Tüm ekipmanı (cımbız, makas, dikiş makası, el matkabı) bir otoklav kuru döngüsü altında, sterilizasyon göstergesi de dahil olmak üzere sterilizasyon torbalarında 45 dakikaya kadar sterilize edin. Birden fazla hayvan üzerinde ameliyat yapıyorsanız, ısıtılmış bir boncuk sterilizatörü (3x'e kadar) kullanarak hayvanlar arasındaki aletleri sterilize edin.
  2. Fareleri kullanıcıların hayvan bakım protokolüne göre anestezi altına alın (örneğin, izofluran (indüksiyon için% 4,% 1-2 bakım) ve ameliyata başlamadan önce analjezi (deri altı, 0.1mg / kg buprenorfin SR-LAB'nin 0.1mL'si) uygulayın. Bir ayak parmağı sıkışması ile optimum anestezi derinliği sağlayın.
  3. Fareleri stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve standart kulak çubuklarını kullanarak kafayı hareketsiz hale getirin (Şekil 1A). Gözlere oftalmik merhem uygulayın.
  4. Kesiden önce tekrarlanan, alternatif iyot çubukları ve %70 etanol uygulaması (3x) ile başın yüzeyini sterilize edin.
  5. Kafatasını ortaya çıkarmak için farelerin beynini iki simetrik yarıya bölen hayali çizgiye hafif çapraz bir açıyla deriden 1 cm'lik bir orta hat kesisi yapmak için cerrahi bir neşter kullanın. Herhangi bir kanı pamuklu çubukla silin.
  6. Enjeksiyon bölgesini açığa çıkarmak için cildi yanal olarak saptırın: sağda 2 mm, bregmaya göre 1 mm öne (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/kaudal (+1RC).
  7. Kafatasına +2ML, +1RC'yi bregmaya nüfuz ettirmek için bir bur ucu (0.73 mm) kullanın ve hafif basınç ve büküm hareketi kullanarak bir delik açın.
  8. Başlangıçta şırıngayı beyne 3,5 mm derinlikte yerleştirerek steril 1x PBS'de 100.000 MDA-MB-231BR (GFP-Luciferaz'ı istikrarlı bir şekilde ifade eden) hücrelerini / μL çözeltisini 5 μL enjekte etmek için bir beyin enjeksiyon şırıngası kullanın.
  9. Şırınganın 2 dakika yerleşmesine izin verin. Yaklaşık 1 mm yukarı çekin ve 2 dakika sonra, hacmin ilk yarısını yavaşça enjekte edin.
  10. Geri kalanını enjekte etmeden önce 2 dakika daha bekleyin ve ardından son enjeksiyondan 3 dakika sonra şırıngayı yavaşça çekin.
    NOT: Yavaş enjeksiyon, hacmin beyin dokusu tarafından iyi emilmesine ve şırıngayı çektikten sonra sızıntı yaratmamasına izin vermede ampiriktir, bu da amaçlanan bölgenin dışında büyüyen kanser hücrelerine yol açabilir.
  11. Kafatasındaki enjeksiyon bölgesine kemik balmumu uygulayın ve ardından dokuyu dikmek için polipropilen dikişler kullanın. Fareler anestezinin çıkarılmasından sonra 5 dakika içinde iyileşir.
  12. Hızlı iyileşmeye yardımcı olmak için tuzlu su enjeksiyonu, yumuşak yiyecekler vb. dahil olmak üzere özel tedaviye ihtiyaç duyulup duyulmadığını belirlemek için ameliyattan hemen sonra yaklaşık 10 dakika, 3 saat sonra ve ertesi gün davranışlarını izleyin.
  13. Görüntüleme sisteminde biyolüminesans görüntüleme ile tümör büyümesini izleyin.
    1. Bunun için önce görüntüleme sistemindeki oksijen ve izofluranı açın. Her ikisinin de görüntüleme kutusunun dışındaki ayrı odaya dağıtılmasına izin verin.
    2. Ardından, yazılımı açın, cihazı başlatın ve tüm fare gövdesini görselleştirmek ve yakalamak için uygun seçeneği belirleyin.
  14. Fareleri izofluran ile ayrı odaya yerleştirin ve bir ayak parmağı sıkışması ile optimum anestezi derinliği sağlayın. Farelere intraperitoneal olarak 200 μL 30 mg / mL lusiferin enjekte edin.
  15. Farelerin midesini, görüntüleme odasının oksijen ve izofluran ile beslenen burun deliğine aktarın. Odayı kilitleyin ve görüntülemeye başlamak için 2 dakikalık süre pozlamayı seçin.
  16. Tümörün biyolüminesan sinyalini ölçmek için yazılımın ROI (ilgi bölgesi) aracını kullanın.
  17. Tümör boyutunu analiz etmek için, daire şekli aracını seçin, tümör şeklinin ve boyutunun etrafına yerleştirin. Yatırım getirisini ölçün ve toplam okumaları raporlayın.
  18. Beyin dilimleri oluşturmadan önce 12-14 gün boyunca (veya lusiferaz yaklaşık 7.0 x 106 üniteye ulaşana kadar) katı tümör büyümesine izin verin (Şekil 1B).
    NOT: Enjekte edilecek hücre sayısının arttırılması daha hızlı tümör büyümesine yol açacaktır; bu nedenle, beyin dilimlerinin oluşumu 12 günden daha erken gerçekleşebilir. Öte yandan, daha büyük bir tümör, 14 gün boyunca büyümesine izin verilirse daha fazla GFP + dilimine yol açacaktır. 14 gün sonra, farelerin sağlığı hızla bozulmaya başlar; Bu nedenle hayvan sağlığı izleme, 10 günlük zaman noktasından sonra günde bir kez arttırılmalı ve dilimleri oluşturmak için ağrı ve / veya rahatsızlık belirtileri gösteren fareler kullanılmalıdır.

2. Beyin dilimleri oluşturun

NOT: Steril laminer akış başlığında beyin izolasyonundan sonraki adımları uygulayın. MDA-MB-231BR hücreleri ile enjekte edilen bir fareden tümör hücreleri (lusiferaz sinyali) içeren 35-40 ayrı dilim üretmek tipik olarak mümkündür (Şekil 1C).

  1. Tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin. Doku dilimleyiciyi steril laminer akış başlığına yerleştirin ve tüm alet ve aletleri %70 etanol ile temizleyin.
  2. İntrakraniyal MDA-MB-231BR hücre enjeksiyonundan 12-14 gün sonra, fareleri 1.2'de açıklandığı gibi kullanıcıların hayvan bakım protokolüne göre anestezi yapın. Bir ayak parmağı sıkışması ile optimum anestezi derinliği sağlayın.
  3. Beyinlerini hızla (45 saniye içinde) buz gibi soğuk (4 °C) sakaroz-ACSF'ye çıkarın ve aşağıdakilerden oluşur: 280 mM sakaroz, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2,20 mM glikoz, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-askorbat, 3 mM tiourea,2 mM Na+, 29 mM piruvat; pH=7,3.
  4. Keskin, steril bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak, beynin alt kısmı da dahil olmak üzere her taraftan herhangi bir tümör içermeyen beynin fazla kısımlarını kesin.
  5. Dilimlemeyi kolaylaştırmak için 60 mm'lik bir çanak kapağı üzerindeki ACSF ıslak filtre kağıdının üzerine düz oturmak için beynin şeklini mükemmel olmayan bir küpe getirin.
    NOT: Tümörün büyümesinin muhtemel olmadığı beynin ekstra dokusu, çoğunlukla GFP + dilimlerinin üretilmesine izin vermek ve aletin yüzeyinde stabil olan ve dilimlemenin neden olduğu titreşimlerden rahatsız olmayacak bir beyin şekli oluşturmak için dilimlemeden önce çıkarılır.
  6. Kesme platformuna birkaç yaprak önceden ıslanmış (ACSF ile) filtre kağıdı çemberi yerleştirin ve tıkalı mendili bunun üzerine yerleştirin.
  7. Dokuyu 200-250 μm kesitlere bölmek için cihaz üzerindeki kesim boyutunu sağlanan cetvel üzerinde 2 veya 2,5 birime ayarlayın.
    NOT: 350 μm'ye kadar veya 100 μm'ye kadar ince dilimler uygulanabilir. <200 μm dilimler için bir vibratom veya komprestom kullanın.
  8. Beyin dilimlerini sakkaroz ACSF içeren bir kaba aktarmak için bir boya fırçası (samur) kullanın ve dilimleri 27 G iğneleri kullanarak hafif bir mikroskop altında ayırın.
  9. Floresan mikroskop altında GFP pozitif dilimleri tanımlayın ve steril 1 mL kırık pipet (geniş açıklık) kullanarak 2-3 mL yetişkin dilim ortamı (Nörobazal ortam A,% 2 B12 takviyesi,% 1 N2 takviyesi,% 1 glutamin,% 0.5 glikoz, 10 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin) içeren yeni bir 60 mm kaba aktarın.
    NOT: Beyin yüzeyinde büyüyen tümör hücrelerini içeren beyin dilimleri (belki enjeksiyon hücresi sızıntısı vb. nedeniyle) hariç tutulmuştur.
  10. Her 30 mm, 0,4 μm gözenek boyutunda doku kültürü ekine, 6 delikli plakalar halinde birbirine büyümeye izin vermeyecek bir mesafede 3-5 dilim aktarın.
  11. P1000 pipet kullanarak fazla ortamı kesici ucun yüzeyinden çıkarın, her bir kesici ucun altına 1 mL yetişkin fare dilimi ortamı ekleyin ve dilimlemeden önce inkübatördeki ortamı dengeleyin.
  12. Görüntülemeden önce dokuları 37 °C, %5 CO2 ve %95 nemde 24 saat boyunca inkübe edin.

3. Dilimlerin IVIS görüntülemesi

NOT: Steril laminer akış başlığında lusiferaz ve inhibitör ekleme adımları uygulayın.

  1. Pipet, 5 μL'lik 30 mg/mL lusiferin çözeltisini kesici uçlarla kaldırıp kuyucuktaki ortama lusiferin ilavesinden sonra tekrar kuyuya yerleştirerek kesici uçların altındaki ortama döker.
  2. 6 delikli plakayı, kapağı cihazın görüntüleme odasının içine yerleştirerek sabit kameranın altına yerleştirin ve hazne kapağını kilitleyin.
  3. Yazılımı açın ve cihazı başlatın.
  4. Görüntü başına yalnızca bir kuyunun görselleştirilmesine ve yakalanmasına izin veren kamera ayarlarını seçin. Sahneyi yukarı doğru hareket ettirin (5 cm'lik FOV) ve görüntülenmesi gereken kuyuyu doğrudan kameranın altına yerleştirin.
  5. Tümörün yayacağı lusiferazın yoğunluğuna bağlı olarak görüntüleme süresini en uygun şekilde ayarlayın, bu da 10 s ila 5 dakika arasında değişebilir. 10 sn'ye ayarlayarak başlayın ve sinyal düşükse artırın, ancak deneyin sonuna kadar tüm zaman noktaları ve koşullar için tutarlı tutun (Şekil 1D).
  6. ROI aracını (daire şekli aracı) kullanın, tümör şeklinin ve boyutunun etrafına yerleştirin, ROI'yi ölçün ve dilimdeki her tümörün biyolüminesan sinyalini ölçmek için toplam okumaları raporlayın.
  7. Plakayı steril laminer akış başlığına geri getirin, kesici ucu kuyudan hafifçe kaldırmak için forseps kullanın.
  8. Ortamı aspire edin, 1 mL taze ortamla değiştirin ve kesici ucu tekrar kuyucuğa yerleştirin.
  9. Dilimlerin inhibitörler, metabolitler vb. gibi çeşitli bileşiklerle muamele edildiği deneyler için, reaktifin uygun konsantrasyonunu 1.5 mL'lik bir tüp içinde 1.2 mL'lik beyin dilimi ortamında hazırlayın ve ardından 1 mL'yi dilimi içeren kuyuya aktarın.
  10. Bu işlemi çalışma süresince her 48 saatte bir tekrarlayın.

4. ex vivo beyin dilimlerinde tümör büyümesinin canlı görüntülenmesi

NOT: Canlı görüntüleme sırasında ek ortam eklemek mümkün olmadığından, deneyin uzunluğuna dayanacak kadar ortama (1,5 mL) sahip kesici uçlar sağlayın.

  1. 6 delikli plakayı inkübatörün içindeki otomatik mikroskop plakası tutucusuna yerleştirin (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem).
  2. Yazılımı açın, dilimleri görüntülemek için gereken pozlamayı ayarlamak için ilk kadranda parlak alanı açın. Dilimin konumunu ("xy" koordinatları) bulmak için, mikroskopun "xyz" koordinatlarını kontrol etmek için ikinci kadranda "xy" ile gezinin.
  3. Bu deney için kullanılan laboratuvar yazılımı olarak 6 kuyulu plakayı seçin. YG harita düzenleyicisini seçin ve yeni bir YG seçerek bu konumu kaydedin, bu YG'yi ekleyin ve kaydedin.
  4. Diğer kuyulardaki diğer tüm ilgi alanları için aynı adımları tekrarlayın. Tüm YG'leri ekledikten sonra, tüm YG'leri kaydedin.
  5. Protokol altında, Varolanı Temizle'yi seçin ve Edinme altında Zaman Aşımı'nı seçin, ardından ilgilenilen kanalları (bu durumda GFP) seçin.
  6. Netleme Ayarları'nda Otomatik Netleme'yi kapatın ve tüm dilimler için uygun odağa manuel olarak ayarlayın. Son olarak, Parlak Alan Yoğunluğu ve Floresan Kanal Uyarma ve Pozlama Süresi'ni uygun seviyeye ayarlayın.
  7. Protokolü 48 saat boyunca her 15 dakikada bir görüntü alacak şekilde ayarlayın.
  8. Protokolü kaydedin ve çalıştırın. Denemenin sonunda, kaydedilen dosya her yatırım getirisi için yakalanan hem parlak alan hem de GFP görüntülerini içerecektir.
  9. Bir videodaki görüntüleri birleştirmek için, ilgilenilen tüm görüntüleri aynı adla yeniden adlandırın ve ardından yakalandıkları sırayla düzenlemek için ikili bir sayı ekleyin (örneğin, ROI1 (1), RO1 (2) ...)
  10. ImageJ'yi açın ve Dosya > Görüntü Dizisini İçe Aktar>a tıklayarak görüntüleri içe aktarın. Listede görünen dosya adlarını seçin ve video için seçilen dosyaları tanımlamak üzere görüntülenecek Dosya Adı İçeriği kutusuna dosyaların adının içeriğini yazın.
  11. Birleştirilen görüntüleri Dosya > Farklı Kaydet > AVI altında kaydedin.

5. ex vivo beyin dokusunun MTS testi ve immünohistokimyası

  1. MTS TAHLILİ
    1. Dokunun kenarları boyunca her dilimin altındaki doku kültürü zarını keserek dilimleri eksize edin ve hala zara bağlı olan dokuyu 96 delikli bir plakaya aktarın.
    2. MTS reaktifini, çözeltinin dokuya nüfuz etmesine izin vermek için, kültür ortamı ve% 0.01 triton (1x) ile 1: 5 oranında karıştırılmış olarak, her bir kuyucukta toplam 120 μL hacimde ekleyin.
    3. Beyin dilimlerini uygulanabilir hale getirmek için bir ajan olarak% 4 Paraformaldehit (PFA) kullanın ve böylece bu deney için olumlu bir kontrol sağlayın. MTS testine devam etmeden önce RT'de (oda sıcaklığında) 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de ilgilendiğiniz beyin dilimini% 4 PFA'ya batırın.
    4. MTS reaktifinin dilimler üzerinde 4 saat boyunca reaksiyona girmesine izin verin, dilimleri kuyucuklardan çıkarın ve referans olarak dilim içermeyen boş bir kuyu da dahil olmak üzere tüm koşullar için 490 nm'de emiciliği ölçün.
    5. Okumaları, dijital bir kumpas cetveli ile ölçülen doku dilimi alanının bir fonksiyonu olarak raporlayın.
  2. İmmünohistokimya preparatı
    1. Membran kesici uç yüzeyine tutturulmuş beyin dilimlerini 4 °C'de gece boyunca% 10 formalin içine daldırın.
    2. Gömme, işleme, bloke etme işlemlerini gerçekleştirin ve dokunun lekesiz slaytlarını oluşturun. H&E, Ki-67, gama-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI için boyama yapmak için standart immünohistokimya boyama protokolünü kullanın

6. Tümörün ex vivo beyin dilimlerinde ışınlanması

  1. Tümörü 6 Gy (310 kVp röntgen) ile ışınlayın.
    NOT: Toplam 6 Gy dozunu almak için girilen birimler, R birimleri (Victoreen elektrometresi kullanılarak ölçülür) ve dahaönce tarif edildiği gibi zımba, hava yoğunluğu ve cGy / R için düzeltmeler dikkate alındıktan sonra 3522 birimdir. Pozlama süresi 130.9 sn'dir.
  2. 0,25 mm Cu +1 mm Al ilave filtrasyon, 50 cm SSD, dakikada 125 cGy kullanın.
  3. Dozimetriyi, birincil standarda göre kalibre edilmiş bir ışın içi iyonizasyon odası ile gerçekleştirin.
  4. Nem, sıcaklık ve barometrik basınç için günlük düzeltmeler yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

MDA-MB-231BR-GFP-Luciferaz hücreleri, yukarıda açıklandığı gibi 4-6 haftalık Nu/Nu farelerin sağ yarımküresine intrakraniyal olarak enjekte edildi (Şekil 1A) ve 12-14 gün boyunca büyümesine izin verildi, bu süre zarfında tümör büyümesi biyolüminesans görüntüleme ile izlendi (Şekil 1B). Diğer grup19 tarafından bildirildiği gibi kafa içi 100.000 kanser hücresi enjekte ettik, ancak 20.000 hücre20 kadar düşük enjekte e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, ekşik ksenogreft beyin tümörleri için yeni bir ex vivo beyin kültürü yöntemi ortaya koymaktadır. Farelerin beynine intrakraniyal olarak enjekte edilen BCBM hücreleri MDA-MB-231BR hücrelerinin ex vivo beyin dilimlerinde hayatta kalabileceğini ve büyüyebileceğini gösteriyoruz. Çalışma ayrıca intrakraniyal olarak enjekte edilen U87MG glioblastoma (GBM) hücrelerini test etti ve ayrıca bu kanser hücrelerinin beyin dilimlerinde hayatta kaldığını ve büyüdüğünü buldu (veriler gösterilmedi). Bu model...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek finansal çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Teknik yardımları için Julia Farnan, Kayla Green ve Tiziana DeAngelis'e teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma kısmen Pennsylvania Commonwealth Evrensel Araştırma Geliştirme Hibe Programı (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) ve W.W. Smith Charitable Trusts (EjH) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL şırınga, kayma ucuBD309659
30 G1/2 İğnelerBD305106
6 oyuklu plakalarGenessee25-105
Otomatik mikroskop ve LUMAVIEW yazılımıEtalumaLS720
B27 (GEM21)Gemini Bio-Products400-160
Beher 50 mLFisher10-210-685
Künt samur boya fırçası, Boyut # 5/0Elektron Mikroskobu Bilimleri66100-50
Kemik BalmumuModoMedDYNJBW25
Beyin enjeksiyon ŞırıngasıHamilton Şirketi80430
CaCl < sub > 2 < / sub >Fisher ScientificBP510-250
Bölünmüş kaspaz 3 AntikorHücre Sinyali14220S
DAPIInvitrogenP36935
D-Luciferin Potasyum TuzuPerkin Elmer122799
Çift kenarlı tıraş bıçağıVWR55411-060(95-0043)
Filtre Kağıdı (# 1), kantitatif daireler, 4,25 cmFisher09-805a (1001-042)
İnce samur boya fırçası #2/0Elektron Mikroskobu Bilimleri66100-20
ForsepsGüzel Bilim Araçları11251-20
Gama-H2AX antikoruMillipore05-636
GFAP antikoruThermo Fisher13-0300
GFP antikoruSanta CruzSC-9996
GlikozSigma AldrichG8270
Glutamin (200 mM)Corning cellgrow25-005-CL
H & E ve KI-67Jefferson Çekirdek Tesisi Patoloji boyama
El Matkap Seti, Mikro Mini Bükümlü Matkap UçlarıAmazonYCQ2851920086082DJ
HEPES, serbest asitFisher ScientificBP299-1
Sadece fareler için Stereotaksik ÇerçeveHarvard Aparatı (Holliston, MA, ABD).72-6049, 72-6044
KClFisher ScientificS271-10
Büyük cerrahi makasGüzel Bilim Araçları14001-18
MDA-MB-231BR hücreleriNazikçe Dr. Patricia Steeg tarafından sağlanmıştırRef 14< / sup>
MgCl 2< / sub>· 6H2OFisher ScientificM33-500
Fare görüntüleme cihazıPerkin ElmerIVIS 200 sistemi
Fare görüntüleme yazılımıKaliper Yaşam Bilimleri (Waltham, MA, ABD).Living Image Yazılımı
Mikroplaka OkuyucuTecan Spark
Montaj çözümüInvitrogenP36935
MTS reaktifiPromega CellTiter 96 Sulu Bir Çözelti(Cat: G3582)
N2 takviyesiYaşam Teknolojileri17502-048
Nörobazal ortamYaşam Teknolojileri21103049
Nu / Nu atletik farelerCharles Rivers Labs (Wilmington, MA, ABD)
ParaformaldehitAffymetrix19943
Kalem / StrepYaşam Teknolojileri145140-122
Polipropilen SütürMedex kaynağıETH-8556H
Povidone İyot Swab çubuklarıDME Kaynağı ABDKedi: 689286X
Neşter bıçağı #11 (pk of 100)Güzel Bilim Araçları10011-00
Neşter sapı #3Güzel Bilim Araçları10003-12
Sodyum PiruvatSigma AldrichS8636
Spatula / probGüzel Bilim Araçları10090-13
SS Çift kenarlı kaplamasız tıraş bıçağı (Amerikan güvenlik tıraş bıçağı co (95-0043))VWR55411-060
SucroseAmresco57-50-1
Cerrahi NeşterExelint InternationalD29702
Doku DoğrayıcıBrinkman(McIlwain tipi)
Doku kültürü ekleriMillipore PICMORG50veya PICM03050
X-ray cihazıHassas 250 kVp

Kaynaklar

  1. Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
  2. Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
  3. Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  4. Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557(2017).
  5. Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881(2013).
  6. Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
  7. van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400(2018).
  8. Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030(2019).
  9. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
  10. Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
  11. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
  12. Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
  13. Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
  14. Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542(2017).
  15. Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
  16. Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
  17. Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94(2020).
  18. Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377(2009).
  19. Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406(2020).
  20. Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
  21. Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
  22. Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  23. Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
  24. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017(2012).
  25. Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Meme Kanseri MetastazıEx Vivo KültürTümör Hücresi İnvazyonuBiyolüminesans GörüntülemeZaman Atlamalı MikroskopiKemoterapi Yanıtıİyonlaştırıcı RadyasyonTümör Mikroçevresi
Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.