Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Lösemi nüks, ^AML1,2,3 hastalarında hematopoetik hücre nakli (HCT) sonrası mortalitenin önde gelen nedenidir. Daha iyi lösemisiz sağkalım, HCT sonrası kan φδ T hücrelerinin grefte karşı Konak Hastalığı (GVHD)⁴ riski olmadan iyileşmesinin artmasıyla bildirilmiştir. φδ T hücrelerinin antijenleri MHC'den bağımsız bir şekilde tanıma ve güçlü sitolitik ve Th1 benzeri efektör fonksiyonlar geliştirme yeteneği, T hücrelerinin bu küçük alt nüfusunu nüks riski altındaki allogeneik transplantasyon geçiren AML hastalarının tedavisi için ideal hale ^{getirmektedir5}. Vφ9Vδ2 T hücrelerinin, ^çevre6'daki T hücrelerinin% 0,5 ila% 5'i arasında değişen küçük bir T lenfosit alt kümesi olduğu göz önüne alındığında, klinik çalışmalar için potansiyel olarak terapötik dozlar elde etmek için bu nadir kan hücresi popülasyonunu genişletmek için sağlam bir sistem kurmak için yola çıktık.

Diğerleri zoledronik asit ve hatta aAPC'ler kullanarak φδ T hücrelerini başarıyla genişletmiş olsa da, φδ T hücrelerini potansiyel olarak 229.749 kat genişletebilen bir süreç geliştirdik. Genişleme bifaziktir: ilk olarak, lenfositler ayırma aleti kullanılarak elutriasyon ile elde edilir. Ekipman, hücrelerin boyutlarına, şekillerine ve yoğunluklarına göre ters akış santrifüjleme ile ayrılmasını sağlayan kapalı bir sistem sağlar. Lenfositler için zenginleştikten sonra, Vφ9Vδ2 T hücrelerinin seçici genişlemesi zoledronik asit ve IL-2 ile 7 gün boyunca tedavi ile elde edilir. Bu tedaviden hemen sonra, TCR-αβ T hücreleri mikrobead teknolojisi kullanılarak tükenerek K562 türevi aAPC'lerle δδ T hücrelerinin daha sonra genişlemesine izin verilir.

Proses doğrulaması için, aAPC'lerle faz-2 ortak kültür genişlemesi için sadece 5 × ¹⁰⁶ zoledronik asit genişletilmiş φδ T hücresi kullanıldı. Genişlemenin bu ikinci aşamasında, φδ T hücreleri, Moffitt'te üretilen genetik olarak tasarlanmış K562 türevi aAPC'lerin (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) mevcut İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) uyumlu Çalışma Hücresi Bankası (WCB) kullanılarak etkinleştirilir. Bu bifazik genişlemenin mantığı, zoledronik asidin monositlerde farnesil difosfat sintazını (FDPS) inhibe etme yeteneğine dayanır ve Vφ2Vδ2 hücrelerini doğrudan uyaran izopentenil pirofosfat birikimine yol açmaktadır. Genişlemenin ikinci aşamasında, K562 türevli aAPC'ler (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) tüm T hücrelerine sağlam bir uyarım sağlar. Bununla birlikte, hücre ürünü zaten φδ T hücreleri için zenginleştirilmiştir, bu da φδ T hücrelerinin sağlam bir şekilde genişlemesine neden olur.

Belirli ekipman ve şişelerin kullanımıyla, işlem işlevsel olarak kapalı bir sistemdir, böylece kontaminasyon riskini azaltır. Ek olarak, 1 L kapalı sistem biyoreaktör, minimum beslenme ihtiyacı ile toplam 1 L orta hacimde hücrelerin maksimum büyümesini ve genişlemesini kolaylaştırır. Moffitt yönteminin avantajı, allogeneik uygulama için son derece saf, donör türevi bir φδ T hücre ürünü üretmek için hızlı, tekrarlanabilir ve son derece uygulanabilir bir GMP sistemi sağlamasıdır. Bu yöntem, kısmi ve tam remisyonlu kanser hastalarında mikroplara ve tümörlere karşı bağışıklığa aracılık etmek için Vφ2Vδ2 T hücre reseptörlerini benimseyen immünoterapi olarak ifade eden insan δδ T hücrelerini kullanmayı amaçlayan herhangi bir klinik çalışmaya uygulanabilir. Ek olarak, δ oksimerik antijen reseptörü pozitif (CAR⁺) T hücrelerinin geliştirilmesi ve üretimi için sağlam bir platform sağlar.

NOT: IRB onayı alınmış, bağışçılardan bilgilendirilmiş onay alınmıştır.

1. Lenfosit izolasyonu

1. Aferez ürününü temiz bir odaya aktarın.
   NOT: Proses doğrulaması, ham hücresel malzeme toplama yönetmeliklerine uygun harici bir ticari satıcıdan normal donör aferez kullanılarak gerçekleştirildi.
2. Sterilite testi, hücre sayısı ve hücre fenotipleme için örnekler toplayın.
3. %1 insan serum albümini (HSA) ve ikincil bir salin çözeltisi (%0,9 sodyum klorür Enjeksiyon USP) veya Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi birincil ortamı kullanarak karşı akış santrifüjleme cihazında elütriat. Elütriasyon santrifüjleme hızını 900 × g olarak ayarlayın ve akış hızına ve zamana göre kesirleri toplayın.
4. Kesir 2'den numuneleri toplayın ve aşağıdaki testleri yapın: sterilite testi için 2 mL; Acridine turuncu/propidium iyodür (AO/PI) kullanılarak hücre sayısı ve canlılık için 0,5 mL; Akış sitometrisi ile hücre fenotipleme için 5 × ¹⁰⁶ hücre.
5. 5 μmol/L zoledronik asit ve 300 IU/mL ^IL-2 ile 1 L kapalı sistem biyoreaktörde 10 × ¹⁰⁶ hücre/cm2'de kültürdeki hücrelerin saf lenfosit fraksiyonunu (fraksiyon 2) genişletin.
6. %5 CO2 ile 37 °C'de ayarlanmış bir inkübatörde yedi gün kuluçkaya _yatır.

2. Alfa-beta (αβ) T hücre tükenmesi

1. 1 L kapalı sistem biyoreaktör şişesinden hücreleri toplar. Kapalı sistem biyoreaktörün kırmızı çizgisine 1 L'lik bir transfer paketi steril kaynaklayın ve hücreleri transfer paketine aktarmak için uygun farmasötik pompayı kullanın.
2. Aşağıdaki örnekleri alın: harcanan orta sterilite için 10 mL; AO/PI kullanarak hücre sayısı ve canlılık için 0,5 mL hücre; Akış sitometrisi için 5 × ¹⁰⁶ hücre
3. Hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) veya (PBS/etylenediaminetetraasetik asit (EDTA)) tampon + %0,5 HSA ve biyotinilasyonlu TCR αβ spesifik antikorda ~5 × ¹⁰⁸ hücre/mL'de yeniden biriktirin.
4. Çalkalayıcıyı buzdolabına yerleştirin ve hücreleri 2-8 °C'de yaklaşık 15 dakika sallanarak kuluçkaya yatırın.
5. Hücreleri toplam 600 mL PBS/EDTA tampon + %0,5 HSA ile yıkayın. 200-500 × g'daki ilişkisiz antikorun 2-8 °C'de 15 dakika boyunca çıkarılması için santrifüj. PBS/EDTA tamponunda ~5 × ¹⁰⁸ hücre/mL + anti-biotin spesifik mikrobeadlarla (7,5 mL/1 şişe) %0,5 HSA'yı yeniden biriktirin.
6. Çalkalayıcıyı buzdolabına yerleştirin ve hücreleri 2-8 °C'de yaklaşık 15 dakika sallanarak kuluçkaya yatırın. kuluçkadan sonra, sınırsız mikropları çıkarmak için hücreleri 200-500 × g'da 2-8 ° C'de 15 dakika santrifüj edin. PBS/EDTA tamponu + %0,5 HSA'da ~6 × ¹⁰⁷ hücre/mL'yi yeniden biriktirin ve bir transfer paketi torbasına aktarın.
7. Boru setini üreticinin talimatlarına uyarak klinik sınıf manyetik hücre ayırma cihazına takın, paketleri PBS/EDTA tamponu ve transfer paketini hücre ürünü ile birlikte cihaza yerleştirin ve cihaz tarafından talimat verildiğinde çivileyin.
8. Etiketli αβ T hücrelerinin tükenmesi için Tükenme 1.2 protokolünü seçin.
9. Hedef fraksiyonu (zenginleştirilmiş φδ T hücreleri) santrifüj edin ve hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş ortamda yeniden biriktirin.
10. 0,5 mL'lik bir örnek alın ve AO/PI lekesi ile hücre sayısı ve canlılık gerçekleştirin. Hücreleri yaklaşık 1 × ¹⁰⁶ hücre/mL'lik son konsantrasyona getirin. Akış sitometri fenotipleme sonrası tükenme için ürünün 5 × ¹⁰⁶ hücresinden bir örnek alın.

3. AAPC'lerle ortak kültür

1. X-ray üreten cihaza 100 Gy'de 5 × ¹⁰⁷ aAPC/matara ışınlayın.
2. AAPC'leri φδ T hücreleriyle 10:1 oranında birlikte kültür içinde kullanın. Işınlanmış aAPC'leri (5 × ¹⁰⁷ hücre/şişe) ve φδ T hücrelerini (5 × ¹⁰⁶ hücre/şişe) %10 insan AB serumu ile desteklenmiş 1 L kültür ortamına sahip 1 L kapalı sistem biyoreaktör şişelerine yerleştirin. 10 şişeye kadar tohum.
3. 37 °C ve %5 _CO2'de bir inkübatörde 10 gün boyunca kültürdeki hücreleri genişletin.
4. Şeritler, glikoz ve laktat ölçer kullanarak her 3-4 günde bir glikoz ve laktat seviyelerini izleyin.
5. Glikoz 250 mg/dL'ye düşerse, kapalı sistem biyoreaktörün kırmızı çizgisine 1 L'lik bir transfer paketini steril kaynak yaparak bir farmasötik pompa kullanarak şişedeki hacmi 200 mL'ye düşürün.
6. Kalan 200 mL'deki hücreleri karıştırın ve AO-PI boyama ile hücre sayımı ve canlılık ölçümü için 0,5 mL'lik bir örnek alın. Hücre sayısı ≥¹⁰⁹ ise, bir şişeyi iki şişeye bölün ve her şişeyi% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş AIM-V ile 1 L'ye kadar doldurun. Hücre sayısı <¹⁰⁹ ise, hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş taze bir litre kültür ortamı ile besleyin.
7. Tüm şişeler için 3.6 adımını tekrarlayın ve 37 °C ve% 5 _CO2'de inkübatöre geri verin. 3,4-3,7 arası adımları her 3 ila 4 günde bir yineleyin.

4. Hücre hasadı

1. Ortak kültürde 10 günün sonunda, tüm biyoreaktör şişelerini hasat edin. Bir seferde 1 biyoreaktör şişesi hasat edin ve tüm hücreleri uygun boyutta bir transfer paketine toplayın. Transfer paketini kapalı sistem biyoreaktörün kırmızı çizgisine steril olarak kaynaklayın ve hücreleri transfer paketine aktarmak için farmasötik pompayı kullanın.
2. Aşağıdaki kalite kontrol örneklerini çıkarın: kan kültürü ve gram boyama ile sterilite için ilaç ürününün (DP)% 1'i; AO/PI kullanarak hücre sayımı ve canlılık için 0,5 mL; Akış sitometrisi için 5-10 × ¹⁰⁶ hücre (gating stratejisi için Şekil 1'e bakın); Endotoksin için 0,5 mL; Gram boyama için 0,5 mL; Mycoplasma testi için 106 ^hücre 10 mL harcanan ortama yükseldi.
3. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200-500 × g'da santrifüj edin ve üst yapıyı atın.
4. Hücreleri dengeli kristaloid çözelti çözeltisi + 200-500'de% 0,5 HSA × g oda sıcaklığında 15 dakika yıkayın. Bunları 100-300 mL dengeli kristaloid çözelti + % 0,5 HSA hedef hacminde yeniden kullanın.

5. Sürüm testi

1. Aşağıdakiler için δδ T hücresi DP'nin kalite kontrol testini gerçekleştirin: akış sitometrisine göre saflık ve kimlik (Canlı/ Ölü, CD45, CD3, TCR αβ, TCR φδ, CD20, CD56, CD16); AO/PI boyama ile uygulanabilirlik; endotoksin; Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile mikoplazma testi; gram boyama ve aerobik ve anaerobik kan kültürleri ile sterilite; kalıntı K562, akış sitometrisine göre test edilir (CD3-CD16-CD56-CD71⁺).

δδ T hücre süreci, δδ T hücreli ilaç ürününün üretimi için karakterize edildi ve optimize edildi. Proses optimizasyonu dahil 1) elütriasyon kullanılarak lenfosit zenginleştirme, 2) zoledronik asit ile φδ T hücreli ilaç maddesi (DS) hücreye özgü genleşme, 3) φδ T hücre DS'nin TÜKENMEsi TCRαβ, 4) K562 türevi aAPC'ler kullanılarak φδ T hücre DS'nin ikincil genişlemesi ve 5) son DP hasadı ve uygulama veya kriyoprezervasyon için ürünün formülasyonu. Proses optimizasyonundan sonra, hücre işleme uygunluğunu doğrulamak için üç sağlıklı donörden elde edilen malzeme kullanılarak uygun ölçekte onay çalıştırmaları gerçekleştirildi. Tüm veriler analiz edildi ve Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3'te

&

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.