Burada psödovirüs paketlemesi ve antikor nötralize edici aktivitenin ölçümü için bir protokol açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Psödotip H5 Kuş Gribi Virüslerinin Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon Yöntemi ile Hazırlanması ve Antikor Nötralize Edici Aktivitesinin Ölçülmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
1996 yılından bu yana, A / kaz / Guangdong / 1 / 96 soyundan gelen yüksek derecede patojenik kuş gribi (HPAI) H5 virüsleri kümes hayvanlarında ve yabani kuşlarda grip salgınlarına neden olmaktadır. Bazen, insanlar da buna kurban gider ve bu da yüksek ölüm oranıyla sonuçlanır. Bununla birlikte, HPAI virüsü araştırması, biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarlarında ele alınması gerektiği düşünülerek sıklıkla engellenmektedir. Bu sorunu ele almak için, H5 HPAI çalışmalarının bazı deneylerinde psödovirüsler vahşi tip virüslere alternatif olarak benimsenmiştir. Psödovirüsler, H5 HPAI virüslerine karşı nötralize edici antikorları incelemek için ideal araçlar olduğunu kanıtlamıştır. Bu protokol, H5 HPAI psödovirüs preparatlarının ve psödovirüs nötralizasyon testlerinin prosedürlerini ve kritik adımlarını açıklamaktadır. Ayrıca, bu testlerin sorun giderme, sınırlama ve modifikasyonları da ele alınmaktadır.
Giriş
1996 yılından bu yana, A / kaz / Guangdong / 1 / 96 soyundan gelen yüksek derecede patojenik kuş gribi (HPAI) H5 virüsleri, kümes hayvanlarında ve yabani kuşlarda sürekli grip salgınlarına neden olmakta ve küresel kanatlı hayvan endüstrisinde muazzam sosyo-ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bazen, insanlar da onunla enfekte olurlar, yüksek bir ölüm oranıile karşı karşıya kalırlar 1,2. Bununla birlikte, HPAI virüsü araştırması, biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarlarının dışında ele alınamayacağı için sıklıkla engellenmektedir. Bu sorunu ele almak için, H5 HPAI çalışmalarının bazı deneylerinde psödovirüsler vahş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Psödovirüs ile ilgili tüm deneysel operasyonlar Şangay Çin Bilimler Akademisi Pasteur Enstitüsü'nde (IPS, CAS) ABSL2 koşulu altında gerçekleştirildi. Hayvan deneyleri, IPS, CAS'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı hayvan protokollerine dayanarak gerçekleştirilmiştir.
1. Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu ile psödovirüs ambalajı
- Tam DMEM ortamında HEK293FT hücrelerin tek hücreli süspansiyonlarını (mL başına 9 x 105) yapın (Tablo 1). Tek hücreli süspansiyonların 10 mL'sini bir T75 şişesine ekleyin, hücreleri transfeksiyondan önce 20 saat boyunca 37 ° C,% 5 karbondioksit (CO
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İnfluenza psödovirüsünün HA, NA ve HIV-1 p24 protein ekspresyonu
Viral paketleme etkinliğini belirlemek için, influenza psödovirüs stokları ilk olarak HA testi ile tespit edildi (Şekil 2A). İnfluenza psödovirüslerinin mililitresi başına HA birimi 643'tür (Tablo 3). Ha, NA ve HIV-1 p24 protein ekspresyonunu test etmek için Western-blot testi ve sandviç ELISA testleri kullanıldı. Daha sonra HA biriminin oranları ve psödovirüsler için gag p24 miktarı hesapla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
HEK293FT hücreler genellikle psödovirüs üretmek için paketleme hücreleri olarak kullanılır. Hücre kültürü sırasında düzenli mikoplazma tespiti esastır. Mikoplazma kontaminasyonu, psödovirüs verimini büyük ölçüde azaltabilir ve bazen sıfıra yakın olabilir. Diğer kontaminasyonlarla karşılaştırıldığında, mikoplazma kontaminasyonları pH değeri değişikliklerine veya hücre kültürü ortamının bulanıklığına yol açmaz. Yüksek konsantrasyonda mikoplazma bile çıplak gözle veya mikroskop altında görülemez. Mikoplazma tespitinin üç po.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Jiangsu eyaleti İnovasyon Kapasite Geliştirme Projesi (BM2020019), Shenzhen Bilimsel ve Teknolojik Projesi (No. JSGG20200225150702770), Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı (XDB29030103), Guangdong Bilimsel ve Teknolojik Projesi (No. 2020B1111340076) ve Shenzhen Körfezi Laboratuvarı Açık Araştırma Programı (No. SZBL202002271003).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 1 Chiken Eritrosit | Biyo-kanal | BC-RBC-C001 | Reaktifi |
| 96 oyuklu hücre kültürü plakaları (düz tabanlı) | Thermo fisher bilimsel | 167008 | sarf malzemesi |
| 96 oyuklu hücre kültürü plakaları (yuvarlak tabanlı) | Thermo fisher scientific | 163320 | sarf malzemesi |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Ekipman/Santrifüj |
| BD İnsülin Şırıngaları | BD | 324910 | sarf malzemesi |
| Kalsiyum Klorür Susuz | AMRESCO | 1B1110-500G | Reaktif |
| klorokin difosfat | Selleck | S4157 | Reaktif |
| Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reaktif |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 16000-044 | Reaktif |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Hücre hattı |
| HEPES SERBEST ASİT | AMRESCO | 0511-250G | Reaktif |
| HIV-1 p24 Antijen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reaktif kiti |
| Luciferase Test Sistemi Dondurucu Paket | Promega | E4530 | Reaktif kiti |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Hücre hattı Mikrosantrifüj |
| Tüpleri 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | sarf malzemesi |
| Nunc Konik Santrifüj Tüpleri 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | sarf malzemesi |
| Nunc Konik Santrifüj Tüpleri 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | sarf malzemesi |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher bilimsel | 156499 | sarf malzemesi |
| Penisilin-Streptomisin | Gibco | 15140-122 | Reaktif |
| Pipet Uçları (10 μ L) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | sarf malzemesi |
| Pipet Uçları (100 μ L) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | sarf malzemesi |
| Pipet Uçları (1000 μ L) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | sarf malzemesi |
| Serolojik pipetler (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | sarf malzemesi |
| Serolojik pipetler (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | sarf malzemesi |
| Tripsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reaktif |
| Varioskan Flash | Thermo fisher Bilimsel | - | Ekipman / Mikroplaka okuyucu |
| Su Ceketi İnkübatörü | Thermo fisher scientific | 3111 | Ekipman / Hücre inkübatörü |
| Pentobarbital sodyum tuzu | Sigma | 57-33-0 | Reaktif |
Kaynaklar
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
