Method Article

Sıçan Dizinin Döngüsel Yüklemeye Bağlı Eklem İçi Kıkırdak Lezyon Modelini Oluşturmak için Non-İnvaziv Bir Yöntem

DOI:

10.3791/62660

⸱

July 5th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Development and Rehabilitation of Motor Function, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 2Department of Motor Function Analysis, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, sıçan dizinin siklik yüklemeye bağlı eklem içi kıkırdak lezyonu modeli, 20 N üzerinde 60 siklik kompresyon ile oluşturulan ve sıçanlarda femoral kondiler kıkırdakta hasara neden olan modeli sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer osteoartritin (OA) patofizyolojisi belirsizliğini korumaktadır. Bununla birlikte, nispeten daha genç yaş gruplarında OA'nın spesifik bir alt sınıflandırması, eklem kıkırdak hasarı ve ligament avulsiyonu öyküsü ile muhtemelen ilişkilidir. Diz OA'sının cerrahi hayvan modelleri, travma sonrası OA'nın başlangıcını ve ilerlemesini anlamada önemli bir rol oynamakta ve bu hastalık için yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmaktadır. Bununla birlikte, son zamanlarda müdahalenin değerlendirilmesini etkileyebilecek travmatik inflamasyonu önlemek için cerrahi olmayan modeller düşünülmüştür.

Bu çalışmada, araştırmacıların (1) fokal kıkırdak hasarına neden olabilecek yükün optimal büyüklüğünü, hızını ve süresini belirlemelerine olanak tanıyan in vivo siklik kompresyon yüklemesi ile indüklenen bir eklem içi kıkırdak lezyonu sıçan modeli geliştirilmiştir; (2) kondrosit canlılığındaki travma sonrası uzaysal zamansal patolojik değişiklikleri değerlendirmek; ve (3) eklem basınç yüklerine karşı adaptasyon ve onarım mekanizmalarında rol oynayan yıkıcı veya koruyucu moleküllerin histolojik ekspresyonunu değerlendirir. Bu rapor, bir sıçan modelinde bu yeni kıkırdak lezyonu için deneysel protokolü açıklamaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel olarak, medial menisküsün ön çapraz bağ (ACL) transeksiyonu veya destabilizasyonu, küçük hayvanlarda travma sonrası osteoartriti (PTOA) araştırmak için en uygun olarak kabul edilmiştir. Son yıllarda, PTOA'yı incelemek için non-invaziv siklik kompresyon modelleri kullanılmıştır. Bu model başlangıçta mekanik yükleme1'e cancellous kemik yanıtını araştırmak için tasarlandı ve daha sonra PTOA çalışmaları 2,3,4,5,6 için cerrahi olmayan bir hayvan modeli olarak değiştirildi. Mantık, bir dizi enflamatuar yanıtı tetikleyen periyodik bir dış kuvvet uygulayarak eklem kıkırdağını çarpıştırmaktır. Bununla birlikte, bu model sadece farelere uygulanmıştır ve daha büyük hayvanlara uygun yükleme büyüklüğü tartışılmamıştır.

Önceki modelle ilgili bir başka sorun, yüksek hacimli protokolün, birkaç örnekte istenmeyen bir yan etki olan subkondral kemiğin aşırı kalınlaşmasına neden olan çok fazla döngü içermesidir7. Bu nedenle, büyük hayvanlar için uygun büyüklükte ve daha düşük yükleme yan etkisine sahip yeni bir siklik sıkıştırma yöntemi geliştirilmiştir8. Bu makalenin genel amacı, sıçanlarda non-invaziv siklik kompresyon modelinin protokolünü tanımlamak ve kıkırdak dejenerasyonunun temsili sonuçlarını gözlemlemektir. Mevcut protokol, non-invaziv siklik kompresyon modelinin sıçanlar üzerinde uygulanmasıyla ilgilenen okuyuculara yardımcı olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, Kyoto Üniversitesi Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: Med kyo 17616).

1. Sıçan dizinde in vivo siklik kompresyon gerçekleştirin

  1. Deneysel hayvan anestezisini indükleyin
    1. Anestezi kutusunda% 5 izofluran çözeltisinin solunmasıyla 12 haftalık bir Wistar sıçanında (256.8 ± 8.7 g) anesteziyi indükleyin.
    2. İntraperitoneal olarak, sıçan vücut ağırlığının 2 mg / kg'ında medetomidin, midazolam ve butorphanol dahil olmak üzere üç anestezik ajan9 karışımı enjekte edilir ve sağ diz eklemi etrafındaki alanı tıraş edin. Bir ayak parmağını sıkıştırmak için pedal refleksi eksikliği ile yeterli anesteziyi onaylayın.
  2. Anestezi uygulanan sıçanı fiksasyon cihazına monte edin.
    1. Karnında yatan anestezi altındaki sıçanı taban plakasına yerleştirin (Şekil 1), sağ diz içbükey bir oluklu küçük bir reçine parçasına tutturulmuş. Sağ arka bacağı kalça uzatma, diz fleksiyonu ve ayak bileği uzatma pozisyonlarına yerleştirin, diz yaklaşık 140 ° 'de bükülür. Sıçanın topuğunu, hareketli fikstür üzerindeki kama şeklindeki oluğa yerleştirin.
    2. Fiksasyon cihazını gerilme/çekme test cihazına taşıyın (bkz. Yük hücresiyle temas olmadığından emin olduktan sonra, gerilme/çekme test cihazı kontrol yazılımını açın (Malzeme Tablosu) ve Kalibrasyon düğmesine tıklayın. Kalibrasyondan sonra, çerçevenin üst kısmını yük hücresine dikkatlice takın. Diz eklemini çerçeveye yakından bağlı tutmak için, hareketli ana çalışma panelindeki döner düğmeyi, ön yük 5 N'ye ulaşana kadar yavaşça açın.
  3. Bir yükleme yöntemi oluşturun ve sıkıştırma testini ayarlayın.
    1. Ana menüde, Yeni bir yöntem oluştur'a tıklayın | Sistem etiketi. Test Modu'nu Döngü olarak ve Test Türü'nü Sıkıştırma olarak ayarlayın. Sensör etiketine tıklayın ve sınırın 60 N içinde olup olmadığını kontrol etmek için Test sekmesini seçin. Ek olarak, Kontur sekmesini seçin ve sınırın 500 mm içinde olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: Yukarıdaki adım, gerilim noktasında büyük bir yer değiştirme olması durumunda işlemi hemen durduracaktır.
    2. Test denetimi etiketinin altında, ana programı %0,3/tam ölçekle başlatmak için Büyümenin kaynağı'nı seçin. Bir yükleme döngüsündeki dört bölümden, 1. ve 3. bölümlerde kontrol altındaki Strok hızını 1 mm / s'ye ayarlayın. 2. bölümdeki Maksimum test kuvvetini 20 N'ye ve 4. bölümdeki Minimum test kuvvetini 5N'ye ayarlayın. "Bekletme Süresi"ni pik yük için 0,5 sn ve minimum yük için 10 s olarak ayarlayın (Şekil 2).
      NOT: Bu adım her döngüyü tanımladığından, bağlantı yüzeylerinin birbirleriyle temas halinde olduğundan ve makul bir hızda hareket ettiğinden ve hareketin korunduğundan emin olun.
    3. Sayfanın altındaki Ön yükleme sekmesinde, Açık seçeneğinin işaretli olduğundan, Sapma kaldırma hızının 100 mm/dak olarak ayarlandığından ve maksimum kuvvetin 5 N olduğundan emin olun. Örnek etiketinde, Malzemeyi Metal olarak ayarlayın.
      NOT: Bu ayrıntılı ayarlar her üretici için özel olabilir.
    4. Ana menüde, Yöntem ve test seç bölümünün altında, yeni oluşturulan yöntemi seçin ve testi başlatmak için Başlat'a tıklayın.
      NOT: Alttaki tablo, pik yük ve yer değiştirmenin gerçek ölçümlerini gösterir.
    5. Döngü sayısını 60 olarak ayarlayın.
      NOT: Tüm yükleme seansı, yaklaşık 12 dakika süren 60 döngü içerir. Kontrol grubunda, sıçanlar aynı koşullar altında 12 dakikalık ön yükleme için 5 N ön yüklemeye tabi tutuldu.
  4. Yükledikten sonra, sıçanı kafesine geri döndürün ve tamamen iyileşene kadar izleyin. Kafeste yeterli alan ve yiyecek ad libitum ile 12-12 saatlik bir açık-karanlık program uygulayın. Gerekli deney sürelerinden sonra, sıçanları intraperitoneal olarak enjekte edilen üç anestezik ajanın karışımının aşırı dozda veya analiz için karbondioksit inhalasyonu ile feda edin (1 h-8 hafta).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

20 N siklik yüklemeye maruz kalan numunelerde kondrosit canlılığındaki kısa süreli değişikliklerin (1 saat ve 12 saat) temsili bir sonucu elde edildi. Şekil 3'te gösterildiği gibi, ölü kondrositlerin (kırmızı floresan) sayısı travma sonrası 12 saatte artmıştır. Tersine, canlı kondrositlerin (yeşil floresan) sayısı azalmaya devam etti ve etkilenen bölgede canlı kondrosit içermeyen bazı örnekler vardı.

Histoloji, 20 N dinamik yükleme yapılan sıçan dizlerinin eklem k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlk kez, mevcut protokol, fare2 gibi daha küçük kemirgenlerde eklem içi hasar modeline benzer şekilde, sıçanlarda lateral femoral kondil üzerinde yükleme kaynaklı kıkırdak lezyonu modelinin nasıl oluşturulacağını göstermektedir. Bununla birlikte, farelerde yükleme protokolü, siklik kompresyonun etkilerini değerlendirmek için ideal olmayan ciddi osteofit oluşumuna ve çapraz bağ lezyonlarına neden olmuştur. Mevcut protokol, çok daha düşük yükleme kuvvetine sahip sıçanlarda fokal kıkırdak lezyonu yar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen bir JSPS KAKENHI hibesi ile desteklenmiştir (JP18H03129 ve JP18K19739 numaraları).
Bu araştırma aynı zamanda Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü (NICHD), Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü (NIBIB) tarafından P2CHD086843 Ödül Numarası altında desteklenen Rejeneratif Rehabilitasyon Araştırma ve Eğitim İttifakı'ndan (AR3T) fon aldı. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Küçük Hayvanlar İçin Anestezik AparatSHINANO MFG CO.,LTD.SN-487-0T
İmza AG-XShimadzu CorpNAHassas Üniversal / Çekme Test Cihazı
Fluoview FV10i mikroskobuOlympus CorpN.A.Tam otomatik konfokal lazer tarama mikroskobu
ISOFLURAN İnhalasyon ÇözeltisiPfizer Japonya A.Ş.(01)14987114133400
CANLI/DEA Canlılık/Sitotoksisite KitiThermo Fisher Scientific Japan IncL3224Hücrelerin canlılığını belirlemek için hızlı ve kolay iki renkli bir test
TRAPEZIUM X SoftwareShimadzu CorpNAAutograph AG-X için veri işleme yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Souza, R. L., et al. Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element. Bone. 37 (6), 810-818 (2005).
  2. Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model. Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).
  3. Wu, P., et al. Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets. Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).
  4. Poulet, B., et al. Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).
  5. Ko, F. C., et al. Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading. Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).
  6. Adebayo, O. O., et al. Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).
  7. Ko, F. C., et al. In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae. Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).
  8. Ji, X., et al. Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).
  9. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
  10. Iijima, H., et al. Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model. Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cyclic LoadingCartilage Lesion ModelRat KneeIntra Articular CartilageOsteoarthritis ModelNon Invasive MethodChondrocyte ViabilityMechanical LoadingCompression TestingPost Traumatic Osteoarthritis

Related Articles